Hedef yeni nesil sıralama ve Biyoinformatik boru hattı anayasal hastalığı genetik belirleyicileri değerlendirmek için

Özet

Hedeflenen yeni nesil sıralama Hastalıkları Araştırma ve Klinik teşhis giderek daha popüler hale geliyor zaman ve maliyet-etkin bir yaklaşımdır. Burada açıklanan protokol sıralaması için gerekli karmaşık iş akışı ve hastalık katkıda genetik varyantların tanımlamak için kullanılan Biyoinformatik işlem sunar.

Özet

Yeni nesil sıralama (NGS) hızlı bir şekilde anayasal hastalığı genetik belirleyicileri içine araştırma nasıl gerçekleştirildiğini devrim. Sıralama okuma bir kısa zaman aralığı ve nispeten düşük maliyetle üretilen milyonlarca ile yüksek verimli bir tekniktir. Özellikle, hedeflenen NGS çalışma hastalık üzerinde dayalı özel ilgi odağı araştırmalar genomik bölgelere için yapabiliyor. Sadece does bu azaltın maliyeti daha fazla ve işlemin hızını artırmak, ama genellikle NGS eşlik Hesaplamalı yükünü azaltır. Hedeflenen NGS genom belirli bölgeler için kısıtlı olmasına rağmen ilgi, potansiyel roman loci tanımlaması önleme mükemmel bir teknik var olan phenotypically ve genetik olarak heterojen bir hastalıkla karşı karşıya olabilir daha önce bilinen genetik dernekler. Sıralama tekniği karmaşık doğası nedeniyle, yakından iletişim kuralları ve yöntemleri sıralama okuma yüksek kapsama ve kalite elde etmek için uygun önemlidir. Ayrıca, bir kez sıralama okuma elde edilen, sofistike Biyoinformatik iş akışı okuma başvuru genom, türevlerini aramak ve türevleri kalite ölçümleri geçmek emin olmak için doğru şekilde eşlemek için kullanılmaktadır. Türevleri de açıklamalı olmalı ve küratörlüğünü American College of Medical Genetics ve genomik patojenitesi yönergeleri uygulayarak standardize klinik öneme göre. Burada sunulan yöntemleri oluşturma ve klinik önemi olabilir türevlerini tanımlamak için bir model olarak ONDRISeq nörodejeneratif hastalık panelini kullanarak bir hedeflenen sıralama panelinden NGS veri çözümleme adımları görüntüler.

Giriş

Çeşitli koşullar genetik belirleyicileri tanımlama olarak daha yüksek bir öncelik araştırma ve klinikte, yeni nesil sıralama (NGS) bu gol^{1,2 elde etmek için yüksek performans ve maliyet-etkin bir araç olduğunu gösteriyor alır ,3}. Neredeyse 40 yıldır, Sanger sıralama genetik varyantların⁴; tanımlamak için altın standart olmuştu Ancak, genetik heterojenite veya genetik etiyolojisi bilinmeyen hastalıklar için birçok olası aday genler, sık sık aynı anda değerlendirilecek gerekir. Bu bağlamda Sanger sıralama olur pahalı ve zaman alıcı. Ancak NGS DNA parçalarının, milyonlarca büyük paralel sıralama aynı anda çok çeşitli genetik varyasyon genom çeşitli bölgeler arasında algılamak maliyet ve zaman verimli bir tekniği için izin içerir.

NGS sıralama DNA için üç tür vardır: 1) bütün-genom sıralama (WGS), 2) bütün exome sıralama (WES) ve 3) hedeflenen sıralama⁵. Sadece protein kodlayıcı bölgeler genom⁶sıralama WES içerir iken WGS bir birey tüm genomik içeriğini değerlendirir. Hedeflenen sıralama, buna ek olarak, ortak patolojik mekanizma ile bağlantılı veya bilinen görece az sayıda belirli genler dayalı genomunun belirli bölgeleri üzerinde duruluyor klinik fenotip. Ekzonlar veya intron ya da herhangi bir intergenic bir gen veya gen belirli grup bölgelerinde bu yaklaşımı kullanarak belirtilebilir. Bu nedenle, aday genler faiz hastalığı ile ilişkili olduğu bilinen bir temeli zaten olduğunda hedeflenen sıralama mükemmel bir yaklaşım olabilir. Genom belirli bölgelerinde hedefleme bulut veya klinik yorumu dikkatini gereksiz ve alakasız genetik varyasyon ortadan kaldırılması için izin verir. Büyük miktarda yüksek kaliteli veri WGS ve WES üretmek iken, veri miktarını çok zor olabilir. Sadece bu büyük miktarda veri yoğun hesaplama Biyoinformatik analizi gerektirir, ancak veri depolama sık sık sorunlar⁷sunabilirim. Bu meydan okuma veri depolama WGS ve başlangıçta sıralama giderleri hesaplanırken dikkate kez değil WES için ek maliyeti de ekler. Ayrıca, her ne kadar bu azalıyor, WGS ve WES maliyeti kalır nispeten yüksek. Özellikle çok sayıda bireyler nın gerekli olduğunda hedeflenen sıralama daha maliyet-etkin bir seçenek olabilir.

Ontario nörodejeneratif hastalık araştırma girişimi (ONDRI) olduğunu da dahil olmak üzere beş nörodejeneratif hastalıklar karakterize bir çoklu platform, il genelinde, gözlemsel kohort çalışması: 1) Alzheimer hastalığı ve hafif bilişsel bozulma, 2). amyotrofik lateral skleroz, 3) da demans, 4) Parkinson hastalığı ve 5) vasküler kognitif bozukluk⁸. ONDRI genomik alt grubu bu kohort temel alan nitelik özellikleri bir parçası olarak phenotypically ve genetik olarak türdeş olmayan bu hastalıklar genellikle indirimli henüz son derece önemli genetik peyzaj aydınlatmak için kullanıcılara yönelik bir ürün. Nörodejeneratif hastalıklar böylece NGS metodolojiler ve özellikle hedeflenen sıralama için uygun adaylar bulunmaktadır.

Biz özel bir hedeflenen NGS panel, ONDRISeq 528 katılımcılar ONDRI içinde yer alan önceden faiz beş hastalıkları ile ilişkili olan 80 genlerin protein kodlayıcı bölgeler için sıralamak için tasarlanmış. Bu metodoloji ile yüksek kaliteli NGS veri odaklı ve verimli bir şekilde koşum edebiliyoruz. Tasarım ve ONDRISeq panelin birden çok uyum çalışmaları ile doğrulanmasını daha önce tarif edilmiştir, ONDRISeq paneli roman, olası klinik önemi paneli doğrulamak için kullanılan 216 vakaların % 72.2 nadir türevlerini tespit edebilmek ⁹. her ne kadar NGS teknoloji hızla gelişmiş ve son derece son yıllarda pek çok araştırmacı bir mücadeleyle kullanışlı, ek açıklama eklenen türevleri¹⁰bir liste halinde ham veri işleme sırasında karşı karşıya. Ayrıca, özellikle nadir veya roman¹¹olan birçok ile karşı karşıya yorum varyantlarını karmaşık olabilir.

Burada, adım adım, hedeflenen NGS Metodolojisi ve içinden, ONDRISeq kullanarak ek açıklama örnek olarak çalışma türevi arama ve varyant için gereken ilişkili Biyoinformatik iş akışını açıklar. NGS veri bir nesil sonra ham sıralama dosyaları insan başvuru genom doğru türevleri çağırmak için hizalı gerekir. Türevleri sonra sonraki varyant küratörlüğü gerçekleştirmek için açıklanmalıdır. Amerikan Koleji tıbbi genetik standartları ve yönergeleri doğru varyant patojenitesi sınıflandırmak için bizim uygulanması da açıklayacağız.

Protokol

ONDRI amacı gereği, etik protokolleri ve aydınlatılmış onam araştırma etik kurulları için geriatrik bakım (Toronto, Ontario, Kanada); Baycrest merkezinde göre elde edilmiştir Merkezi bağımlılığı ve ruh sağlığı (Toronto, Ontario, Kanada); Elizabeth Bruyère Hastanesi (Ottawa, Ontario, Kanada); Hamilton General Hospital (Hamilton, Ontario, Kanada); Londra Sağlık Bilimleri Merkezi (Londra, Ontario, Kanada); McMaster (Hamilton, Ontario, Kanada); Ottawa Hastanesi (Ottawa, Ontario, Kanada); Parkwood hastane (Londra, Ontario, Kanada); St Michael's Hastanesi (Toronto, Ontario, Kanada); Sunnybrook Sağlık Bilimleri Merkezi (Toronto, Ontario, Kanada); ve üniversite sağlık ağ-Toronto Western Hastanesi (Toronto, Ontario, Kanada).

1. insan kanı örnekleri DNA izolasyonu

1. Sıralama katılımcılardan uygun olarak uygun etik protokolleri ve aydınlatılmış onam örnekler toplamak.
   1. DNA yüksek kalite elde etmek için ayıklama amaçlar için kan örnekleri çizin.
      Not: DNA da tükürük ya da bukkal hücreler, uygun bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılmasını sağlama elde edilebilir.
   2. DNA, yüksek verim elde etmek için kan açılan üç 4 mL EDTA K2 tüpler örnek toplamak, Toplam hacim örneği sağlama ~ 12 ml.
   3. 750 x g kesir için de 20 dk için kan örnekleri plazma, ince, bir üst aşamaya lökositlerin orta faz ve eritrositler alt aşaması santrifüj kapasitesi.
2. Plazma tek kullanımlık transfer pipet ile örnek tepesinden pipetting tarafından kan örneğinden kaldırmak. Uygun şekilde plazma atın veya birden fazla 500 µL aliquots-80 ° c gelecekteki biyokimyasal analizler için depolama içine dağıtmak. Bir yeni, steril pipet her örnek için kullanıldığından emin olun.
3. Kan örneği ile bir kan ekstraksiyon kiti¹² (Tablo reçetesi) üretici yönergelerine göre DNA ayıklamak.
   Not: yukarıda açıklanan birim örneği aldıysanız, ~ 3 mL lökositlerin DNA ekstraksiyon kullanmak için elde edilir.
4. Ng/µL tam spektrumlu Spektrofotometre¹³ (Tablo malzemeler), kullanarak ilk DNA konsantrasyon üretici yönergelerine göre ölçmek.
5. Doğrudan adım 2'ye gidin. Alternatif olarak, DNA 4 ° C'de depolayın

2. Sıralama kitaplığı hazırlık

1. Seri dilutions üzerinde DNA örnekleri 5.0 ± 1,0 ng/µL son bir konsantrasyon elde etmek için üç gün boyunca gerçekleştirin.
   1. 1 M Tris tampon pH 8,5-10 µM deiyonize suyla seyreltik.
      Not: sonraki adımlar seyreltilmiş gerekir DNA örnekleri sayısı seyreltilmiş birim bağlıdır.
   2. Adım 1.4 hemen sonra DNA seyreltme gerçekleştirme, aşağıdaki adıma devam edin. Aksi takdirde aynı gün, DNA toplama 1.4 adımda olduğu gibi ölçmek.
   3. Ölçülen konsantrasyon dayanarak, ~ 10 ng/µL 10 µM Tris tampon pH 8,5 kullanarak için DNA'ın 40 µL sulandırmak ve gecede 4 ° C'de oturmak örnek izin
   4. DNA toplama bir yer¹⁴ DNA (Tablo malzemeler), miktar için uygun ile üretici yönergelerine göre ölçmek.
      Not: Numune konsantrasyon olmalıdır > 10 ng/µL daha önce kullanılan Spektrofotometre daha düşük duyarlılık nedeniyle.
   5. Ölçülen konsantrasyonu bağlı olarak, 10 ng/µL 10 µM Tris tampon pH 8,5 kullanarak için DNA'ın 20 µL sulandırmak ve gecede 4 ° C'de oturmak örnek izin
   6. DNA konsantrasyon ile yer¹⁴, üreticinin talimatlarına göre ölçmek.
   7. Ölçülen konsantrasyon dayanarak, 5 ng/µL 10 µM Tris-HCl pH 8,5 kullanarak için DNA'ın 10 µL sulandırmak ve gecede 4 ° C'de oturmak örnek izin
2. Sıralama kitaplığı hedeflenen NGS panelin uygun hedef zenginleştirme seti¹⁵ (malzemeler tablo) ile üretici yönergelerine göre hazırlayın. Zenginleştirme kiti kullanılan NGS platformu için uygun olduğundan emin olun.
   1. Plexity ile ilgili olarak ve kütüphanelerin havuzu üreticisinin yönergeleri¹⁶ izleyin.
      Not: ONDRISeq, kitaplıkları iki sette havuzlu 12 DNA örneklerinin oluşmaktadır ve NGS masaüstü aracı (Tablo reçetesi) çalıştırın. Tek bir tepki olarak çalıştırabilirsiniz örnekleri sıralama kit ve platformu üzerinde bağlıdır.
   2. Daha yüksek kalite sıralama veri elde etmek için tagmentation, hedef zenginleştirme seti¹⁵üretici yönergede açıklanan takip DNA Kütüphane kalite doğrulamak için isteğe bağlı adım gerçekleştirin.
      1. Her kitaplıkta nüsha Kütüphane verim kalitesini garanti etmek için analiz.
   3. Kitaplıkları havuzu varsa, DNA konsantrasyon ile yer¹⁴, üreticinin talimatlarına göre ölçmek. Bu toplama havuzu kullanılan hedef zenginleştirme paketi tarafından önerilen ekimolar oranları elde etmek için her DNA kitaplığına hacmi belirlemek için kullanın.

3. nesil sıralama

1. Kütüphanede NGS masaüstü gerecin reaktif kiti üreticisinin yönergeleri^17,18 (malzemeler tablo) göre sıra.
   1. NGS masaüstü gerecin iş akışı içine alınacak uygun NGS teknoloji yazılım (Tablo malzemeler), kullanarak üreticisinin yönergeleri¹⁸ göre örnek bir sayfası hazırlamak.
      Not: ONDRISeq amacıyla, seçilen uygulama seçeneği 'diğer', istenen sadece FASTQ dosya ile (şekil 1). Sonraki adımları hizalama ve kalite parametreleri tam özelleştirme için izin vermek için bu FASTQ dosyaları işler. Hedeflenen sıralama seçilir, ancak, bazı NGS VCF dosyalarıyla kendilerini sıralama verileri işlemek güçlü araçlardır. Üreticinin yönergeleri¹⁸ seçenekleri tam bir seçim için başvurulan.
   2. Bir bulut tabanlı bilgi işlem ortamı¹⁹ (Tablo reçetesi) kullanıyorsanız, çalıştırmak sıralama yukarı ayarlarken giriş yapın. Bunu "Sıralama" NGS masaüstü araç giriş sayfasında tıkladıktan sonra.
   3. Kütüphane denatürasyon¹⁸ üreticinin yönergelerine göre DNA Kütüphane konsantrasyon yer¹⁴ile ölçmek.
   4. Üreticinin talimatina uygun otomatik Elektroforez Sistemi ve DNA kalite analiz kiti²⁰ (Tablo malzemeler), kullanarak DNA Kütüphane kalitesini doğrulamak.
   5. Aşağıdaki formül¹⁶ DNA toplama ng/µL nM için dönüştürmek için kullanın
      
      Not: Ortalama Kütüphane boyutu kullanılan hedef zenginleştirme kiti için geçerli olur ve adım 3.1.4 gözlenen Elektroforez izleme elde edilebilir.
   6. 6 – 20 son bir konsantrasyon sıralama kitaplığına seyreltik uygun, pM ve üreticisinin yönergeleri²¹göre 600 μL hacmi.
      Not: gerekli tam konsantrasyon kullanılan sıralama seti üzerinde bağlıdır. Uygun yükleme konsantrasyonu belirlemek için zenginleştirme kit üreticisine başvurun.
   7. Sulandırmak, tabiatını ve olumlu denetim sıralama kitaplığı²¹, üreticinin yönergelerine göre içerir.
   8. Her sıralama koş, içeren yüklü DNA Kütüphane konsantrasyonu (pM), pozitif kontrol eklendi yüzdesi, reaktif kartuşu barkod, adım 3.1.1, dizin okuma sayısı, kullanılan, zenginleştirme seti seçilen uygulama günlüğünü tutmak length(s), okumak ve Örnek sayfa adı.
      Not: NGS masaüstü aracı çalışma süresi enstrüman, zenginleştirme kiti, bağlı ve uzunlukları (Bu deneme²²yılında kullanılan sequencer için 4-56 h) seçilen okuyun.
2. Sıralama çalışma tamamlandıktan sonra "koşmak NGS masaüstü araç giriş sayfasına gezinme ve"Dosyalar Yönet'i"tıklatarak tüm çıktıların içeren klasöre", erişim. Dosyaları daha sonra erişim için bir yerel sürücüye taşıyın. Bir bilgisayarda ayrı bir seçenek için gezinme panelindeki "ishal" seçerek bulut tabanlı bilgi işlem ortamı¹⁹ içindeki dosyaları bulabilirsiniz. Run Özeti sayfasına gitmek için çalıştırmak uygun nasıl yapılacağını seçin. Bulut verileri elde etmek için "Yükle" seçeneğini seçin. Görünen iletişim kutusunda, FASTQ dosyaları indirmek ve tıkırtı "Download" dosya türü olarak seçin.
3. Bulut tabanlı bilgi işlem ortamı^19,23Run Özeti sayfasından, "bilgi işlem ortamı tarafından üretilen çeşitli rakamlar ile çalıştırmak sıralama kalitesini analiz grafikleri" gidin. Üretilen her şekil ile ilgili ayrıntılı bilgi için üreticinin yönergeleri²³ bakın.
   1. Çalıştırma şemaları sayfasında "Veri tarafından döngüsü" etiketli resim bulun. Grafik altında "Yoğunluk" seçin ve "Tüm kanallar" Kanal altında seçin. Üretilen bu sinyal şiddeti arsa ishal aynı zenginleştirme kit ve NGS masaüstü aracı ile geçmişte yapılan sıralama tarafından üretilen benzer olduğundan emin olun.
      Not: Bu yoğunluğu her Bankası tarafından gösterilen tüm 150 döngüsü yüzdesini yansıtır. Rakam çok aynı paneli son sıralama çalışır karşılaştırıldığında gerekir bu yüzden kullanılan, zenginleştirme seti bağlı olarak değişebilir.
   2. Sayfanın sağ tarafında dizin oluşturma kalite kontrol (QC) çubuk grafik bulmak için çalışma Gezinti paneli içinde "Dizin oluşturma QC" sekmesini seçin. Nispeten tekdüze dağılım % okur tespit (PF) tüm örnekler üzerindeki görülmektedir emin olun.
      Not: herhangi bir örnek bir çok alt % okur tespit (PF) örnekleri kalanından daha varsa, sıralama veri kalitesi etkilenebilir unutmayın.
4. Bulut tabanlı bilgi işlem ortamı Run Özeti sayfasından, kalite ölçümleri için "Ölçütleri" çalışma Gezinti paneli içinde tıklatarak gidin.
   Not: Ölçüler kesintileri kullanılan sıralama platform ve zenginleştirme seti üzerinde bağlıdır. Orada üreticisinin yönergeleri²³, üç yüksek kalite kontrol için tavsiye edilir vurgulayarak aşağıdaki adımları göre kullanılması gereken birçok ölçümleri.
   1. "Yoğunluğu (K/MM²) altında" küme yoğunluğu kullanılan zenginleştirme paketi tarafından önerilen Aralık içinde olduğundan emin olun (Bu durumda 1200-1400 K/mm²).
   2. Toplam "% ≥Q30" altında değeri ≥85%, sıralama okuma kalitesini yansıtan olduğundan emin olun.
      Not: % 85 bu eşik değerinden daha düşük Eğer nasıl yapılacağını kalitesini tehlikeye olabilir unutmayın.
   3. "BAĞLANTISIZLAR (%) altında" değeri çalıştırmak sıralama dahil edildi pozitif kontrol % benzer olduğundan emin olun.
      Not: yalnızca toplam okuma yüzdesi bulunmuştur öyle ki olumlu denetim genom hizalamak için pozitif kontrol, bir ölçüsü olarak davranır. % 1 olumlu denetim kullandıysanız hizalı (%) % ~ 1-5 olacaktı beklenir.

Şekil 1: Screenshot NGS teknoloji Software (malzemeler tablo) örnek sayfa yaratıcısı uygulama seçenekleri. ONDRISeq amacıyla FASTQ sadece uygulama kullanılır. Ancak, kullanıcı, üretilen VCF dosyaları gibi diğer dosyaları isterseniz hedeflenen resequencing kategorisi içinde bir uygulama kullanılır önerilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. içinden ve varyant arama

1. Veri ön işleme için uygun yazılımı raw FASTQ dosyaları için insan başvuru genom hizalamak için ve türevleri (Tablo reçetesi) aramak için seçin.
2. Alma FASTQ sıralama yazılım ön işleme verileri okur.
   Not: ONDRISeq amacıyla, 24 örnekleri tek sıralama çalıştırılacak durumundan üretilen 48 FASTQ dosyaları ithal ve yazılım aracılığıyla işlenir. Aynı anda işleme örnekleri araştırmacı ihtiyaçlarını ve NGS paneli büyüklüğüne bağlı olarak değişebilir.
   1. "Gezinti alanı", içinde doğru tıkırtı ve seçme "Yeni klasör". Öyle ki nasıl yapılacağını olarak netlik koşmak bu belgili tanımlık ağıl ad gerçekleştirildi.
   2. Üst araç çubuğundan "Alma" seçin. Açılan listeden gösterilen sıralama platformların nasıl yapılacağını ile gerçekleştirildiği Platformu seçti.
      Not: ONDRISeq amacıyla, "Illumina" seçilir. Ancak, farklı sıralama platformu konsültasyon kullanıyorsanız²⁴FASTQ ithal üretici yönergelerine kalanı için adımları.
   3. İletişim kutusunu bulun ve bu işlenmekte olan FASTQ üzerinden sıralama dosyaları seçme koşmak. Alınan dosyaları depolanır ve yerel sürücüden alınan bir bilgisayar ile birden çok sunucu kullanıyorsanız emin olun.
   4. Sıralama eşleştirilmiş son kimyaları kullandıysanız "Genel Ayarlar" iletişim kutusunun, "Çiftli okuma" yanındaki kutuyu tıklatın.
      Not: Bu durumda olmalıdır her örnek için - ithal iki FASTQ örnek bir ileri ve bir geri.
   5. İleri FASTQ dosya dosya listesinde geriye doğru okuma önce görünür okursanız iletişim kutusunun bilgi çiftli "Çiftli uç (ileri-geri)" seçin. Dosyaları ters sırada görünür, "Dostum çifti (ters-ileri)" seçeneğini belirleyin. Eşleştirilmiş okuma minimum mesafe 1 ve maksimum mesafe 1000 örnek dizileri içinde küçük ölçekli yapısal düzenlemeler tespiti için izin vermek için ayarla.
   6. "Illumina seçenekleri" iletişim kutusunun, "Kaldır okuma başarısız oldu", seçin sıralama başarısız okuma kaldırmak için. NGS okul sırası alet de-multiplexed, FASTQ dosyalarını dışa aktarma önce veri "MiSeq de-çoğullama" kutusunu seçin.
   7. "Kalite Puanı" açılır listeden, sıralama için kullanılmıştır NGS boru hattı seçin. İletişim kutusunun en altında seçin "İleri".
      Not: kullanılan boru hattı FASTQ dosya Kalite Puanlarını biçimini etkiler. Seçmek için hangi boru hattı hakkında daha fazla bilgi için üreticinin yönergeleri²⁴başvurun.
   8. Yeni iletişim kutusunda, Seç "Kaydet" ve "her örnek'ın FASTQ dosyaları kendi bireysel klasöre koymak için banyo birim başına alt klasörler oluşturabilirsiniz. İletişim kutusunun en altında seçin "İleri".
   9. Yeni iletişim kutusundan 4.2.1 adımda oluşturulan klasörü seçin. Bu FASTQ dosyaları nerede alınır. "İletişim kutusunun en altında son" seçin ve FASTQ dosyaları içe kadar bekleyin. Dosya alma durumunu görmek için "İşlemler" sekmesini tıklatın.
3. İş akışı içinden ve varyant, üreticinin talimatlarına göre arama gerçekleştirmek için belgili tanımlık bilgisayar yazılımı içinde tasarım.
   Not: Bu iş akışı araştırmacı ihtiyaçlarına göre değişebilir, ancak ne ONDRISeq (Şekil 2) amaçlı dahil olduğunu aşağıdaki adımları kapsamaktadır. Bu iş akışındaki adımları diğer içinden NGS ve varyant arama yazılımı uygun olarak uygulanabilir. ONDRI amaçlar için işleme tüm Biyoinformatik insan başvuru genom GRCH37/hg19, veri işleme ve analiz tutarlılık için referans olarak gerçekleştirilir.
   1. Sıralama okuma için başvuru genom eşleyin.
      1. Yapılandırırken, tüm Biyoinformatik adımları için kullanılan aynı başvuru genom sağlanması başvuru genom uygun şekilde seçin.
      2. Maskeleme modundan aþaðý açýlan listesinden seçin "Maskeleme" böylece hiçbir bölgeleri başvuru sırası maskelenir.
      3. Yazılım tarafından atanmış seçenekleri eşleme varsayılan kullanın. Bunun kabul edilebilir olduğunu doğrulamak için üreticinin yönergeleri²⁴ inceleyip araştırma amaçları doğrultusunda bağlı.
   2. Herhangi bir okuma hataları eşleme, özellikle ekleme-silme türevleri çevreleyen gidermek için insan başvuru genom için iş akışı yerel yeniden düzenlenmesi dahil.
      1. Yazılım tarafından atanan varsayılan yerel yeniden hizalama seçenekleri kullanın. Bunun kabul edilebilir olduğunu doğrulamak için üreticinin yönergeleri²⁴ inceleyip araştırma amaçları doğrultusunda bağlı.
   3. Yinelenen eşlenen okuma yanlış pozitif²⁵üretebilir PCR güçlendirme önyargı etkisini azaltmak için NGS protokolde PCR tarafından üretilen kaldırın.
      1. "Araştırma gereksinimlerine göre en fazla temsil azınlık sıra (%)", ayarlayın.
         Not: Bir yumuşak, ONDRISeq, amaçlar için kullanılan olarak %5 ayardır; Ancak, yazılım'ın varsayılan ayarı daha sıkı % 20 's. İki okuma çok benzer, bu ayar sıra daha az okuma sayımları ile PCR güçlendirme önyargı sıralama hatadan kabul Eğer belirler. Bu nedenle, ayarlama %5 oranında, azınlık sayısı ≤ % 5'çoğunluk okuma sayısı okumak çoğu için aynı olması için düzeltilmesi olmalıdır okuyun.
   4. 4.3.3. adımda oluşturulan okuma parçaları bir kapsama Özet metin dosyası biçiminde bulunan hedef bölgelerde istatistiklerini verme. Non-spesifik maçlar ve kırık ikili ayarları yoksayar. Bu dosyaların yerel sürücüdeki bir hedef seçin.
   5. 4.3.3. adımda oluşturulan okuma parçaları her örnek için bir ikili sıra hizalama harita (BAM) dosyası verme. Bu sıra hizalama, gelecekte analizleri gerekirse verilerdir. Bu dosyaların yerel sürücüdeki bir hedef seçin.
   6. Varyant algılama türevleri dizisi içinde aramak için bir yöntem seçin.
      Not: varsayımlar örnekleri Ploitlik hakkında yapılabilir zaman sabit Ploitlik varyant algılama algoritması, ONDRISeq amaçlar için kullanıldığı gibi kullanılması önerilir. Bu varsayım yapılamaz, araştırma amacıyla en iyi algoritmasını belirlemek için üreticinin yönergeleri²⁴ bakın.
      2. 
         
      3. 
         
   7. 
      
4. 5. 
      

1. 1. 
      
   2. 
      
   3. 
      
4. 
   
5. 
   

Sonuçlar

Burada açıklanan yöntemleri 528 katılımcı DNA örnekleri için ONDRI içinde kayıtlı bireylerden uygulandı. Örnekleri başına 24 örnekleri 22 ishal ONDRISeq panelde işletilmiştir. Genel olarak, sıralama veri 78 ± 13 x kötü örnek örtmek ile yüksek kalitede olması için tespit ve tüm bireysel çalışan bir kötü örnek kapsama ifade > 30 x. Daha fazla, ortalama olarak, tüm hedef bölgeleri % 94'ü kaplıydı en az 20 x (Tablo 1).

Tartışma

Bir hastanın tanı, hastalık ilerleme ve olası tedavi seçenekleri dikkate alınarak ilgi olabilir türevleri belirlenmesi için yoldan içinde DNA örneği çıkarma, gerekli metodoloji çeşit çeşit doğasını tanımak önemlidir hem sıralama ve uygun veri işleme. Burada açıklanan Protokolü kullanımı hedeflenen NGS ve sonraki bioinformatic analiz temel potansiyel klinik önemi nadir türevlerini tanımlamak için bir örnektir. Özellikle, biz yaklaşım ONDRISeq özel tasarlanmış NGS panelini kullanırken ONDRI genomik alt grubu tarafından alınan mevcut.

Bu yöntemler belirli bir NGS platformu dayalı geliştirilen ve diğer sıralama platformları ve kullanılabilir hedef zenginleştirme kitleri vardır kabul edilmektedir. Ancak, NGS platformu ve okul sırası alet (Tablo reçetesi) bağlı⁴⁶onun erken ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onayı olarak seçildi. Bu yetkilendirme seçim ve sıralama okuma yerleştirilebilir güvenilirlik NGS protokollerle gerçekleştirilen yüksek kaliteli sıralama yansıtır.

Doğru sıralama okuma kapsama derinliği ile elde etmek çok önemli olsa da, son nadir varyant analizi için gerekli Biyoinformatik işleme çok önemlidir ve yoğun hesaplama olabilir. Sıralama işleminin içinde ortaya çıkabilecek hataları nedeniyle birçok kaynak sağlam Biyoinformatik boru hattı tanıttı olabilir çeşitli yanlışlıklar için düzeltmeniz gerekir. Eşleme işlemi, PCR güçlendirme Kütüphane hazırlık ve sıralama eserler⁴⁷üreten teknolojisi tarafından tanıtıldı amplifikasyon önyargı misalignments üzerinden ortaya çıkabilir. Okuma haritalama ve varyant arama gerçekleştirmek için kullanılan yazılım olursa olsun, yerel yeniden düzenlenmesi, yinelenen eşlenen okuma, kaldırılması da dahil olmak üzere ve türevleri çağrılırken kalite kontrol için uygun parametreleri ayarlayarak bu hataları azaltmak için yaygın yolu vardır. Ayrıca, seçilmiş VARIANT arama sırasında parametreleri el¹¹almak için en uygun ne göre değişebilir. Asgari sigorta kapsamı ve kalite puanı bir değişken ve burada uygulanan çevre nükleotit uygun özgüllük ve duyarlılık arasında bir denge oluşturmak için seçilmiştir. Bu parametreler varyant arama uyumluluk dahil olmak üzere daha önce açıklandığı gibi üç ayrı genetik teknikleri, temel ONDRISeq paneli için doğrulandıktan: 1) çip tabanlı Genotipleme; 2) allelic ayrımcılık tahlil; ve 3) Sanger sıralama⁹.

Doğru varyant, o potansiyel klinik önemi, belirlemek için arama aşağıdaki ek açıklama ve küratörlüğü gereklidir. Onun açık erişim platformu nedeniyle ANNOVAR ek açıklama ve ön elemeyi varyant veya ortadan kaldırılması için mükemmel bir araçtır. Kolayca erişilebilir olmak, ötesinde ANNOVAR olursa olsun ne sıralama platformu kullanılır, VCF dosyalardan uygulanabilir ve özelleştirilebilir araştırma²⁶ihtiyaçlarını dayanmaktadır.

Sonra ek açıklama, onlar klinik önemi olmak düşünülmesi gereken eğer belirlemek için değişik yorumlanmalıdır. Sadece bu süreç karmaşık hale gelir, ama genellikle öznellik ve insan hata eğilimli olur. Bu nedenle, ACMG kanıt Sensing herhangi bir varyantın için değerlendirmek için kurallarımız. Bu yönergeleri dayalı ve özel tasarlanmış ile ardışık düzen boyunca geçmek mümkün her değişken ayrı ayrı değerlendirilmesi tarafından yapılan inşa edilmiş olan bir eşanlamlı sigara, nadir-esas manuel küratörlüğü yaklaşım, uyguladığımız Python komut yönergelere göre değişik sınıflandırır. Bu şekilde, her varyant patojen, bir sıralama atanır muhtemel patojen, belirsiz önemi, büyük olasılıkla iyi huylu veya iyi huylu, ve standardizasyon ve şeffaflık varyant küratörlüğü sürecine eklemek edebiliyoruz. Biyoinformatik boru hattı ötesinde varyant küratörlüğü ayrıntılarını araştırma gereksinimlerine göre bireyselleştirilmiş tanımak önemlidir ve bu nedenle oldu sunulan yöntemleri kapsamı dışındadır.

Burada sunulan yöntemler ONDRI için belirli olmasına rağmen çok sayıda ilgi anayasal hastalıklar göz önünde bulundurarak açıklanan adımları çevrilebilir. Gen ilişkilendirmeleri sayısı için birçok fenotipleri arttıkça, hedeflenen NGS bir hipotez alanında yapılmış olan önceki araştırma yararlanmak yaklaşım tahrik sağlar. Henüz, hedeflenen NGS ve sunulan metodoloji sınırlamalar vardır. Sadece genom belirli bölgeleri üzerinde odaklanarak, keşif alanlarında ilgi roman allelleri sınırlıdır. Bu nedenle, roman genleri veya diğer genomik loci olanlar dışında ortaya sıralama hedefleri tarafından örtülü WGS veya WES ile yaklaşımlar, tespit değil. Ayrıca doğru sıra ile tekrarlanan sıralar⁴⁸ yüksek derecede ya da olanlar GC içerik⁴⁹yılında zengin de dahil olmak üzere NGS yaklaşımlarla zor olabilir genom içindeki bölgeleri vardır. Neyse ki, hedeflenen NGS kullanan zaman priori sıralı genomik bölgeler ile aşinalık yüksek derecede yoktur ve olup bunlar teknik sorunlar yaratabilecek. Son olarak, şu anda NGS verilerden kopyalama numara versiyonlarının algılama standart⁵⁰değil. Ancak, bu endişeleri Biyoinformatik çözümler ufukta olabilir; Yeni Hesaplama Araçlar varyasyon ONDRI hastalarda bu ek biçimleri analiz etmek için yardımcı olabilir.

Sınırlamaları rağmen hedeflenen NGS hipotez odaklı bir yaklaşım içinde yüksek kaliteli veri WGS ve WES göre daha az pahalı kalan süre elde etmek mümkün. Sadece bu metodoloji verimli ve yönlendirilmiş araştırma, hedeflenen NGS klinik uygulama katlanarak büyüyen için uygundur. Bu teknoloji, çeşitli hastalıkların moleküler yolları ile ilgili birçok farklı soruları cevaplamak için kullanılıyor. Ayrıca içine doğru bir tanı aracı ne zaman WES ve WGS karşı nispeten düşük maliyetle geliştirilmektedir. Hatta sıralama, hedef altın standart Sanger karşılaştırıldığında NGS onun zaman - ve ekonomiklik içinde kul. Bu nedenlerden dolayı bir bilim adamı veya kim alır ve laboratuar veya klinik rapor, metin olarak teslim NGS veri, mesela karmaşık sonuçları altında yatan "kara kutu" anlamak için kullanır klinisyen için önemlidir. Burada sunulan yöntemleri üretimi ve yorumu NGS veri temel süreci anlamak kullanıcıların yardımcı olmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
4 mL EDTA K2 tüpleri	Fisher Scientific	02-689-4
1 M Tris Tampon Bio	Basic Canada Inc.	SD8141
Gentra Puregene Kan Kiti	Qiagen	158389	1.000 mL Kit. Bu, adım 1.3'te atıfta bulunulan kan çıkarma kitidir.
NanoDrop-1000 Spektrofotometre	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	NanoDrop-2000 spektrofotometre ile değiştirildi. Bu, adım 1.4 ve 2.1.2'de atıfta bulunulan tam spektrumlu spektrofotometredir.
Qubit 2.0 florometre	Invitrogen	Q32866	Bu, 2.1.4, 2.1.6, 2.2.3 ve 3.1.3 adımlarında atıfta bulunulan DNA'nın miktar tayini için uygun bir florometredir.
Nextera Hızlı Özel Yakalama Zenginleştirme Kiti	Illumina, Inc.	FC-140-1009	ONDRISeq paneli için özel olarak tasarlanmış, 80 genin eksonlarını dizileyen, uzunluk olarak 150 bazın eşleştirilmiş uç okumalarında 971.388 baz çifti ile sonuçlanır; kit başına 288 örnek. Bu, 2.2, 2.2.2, 2.2.3, 3.1.5, 3.1.6, 3.4.1 adımlarında ve Tartışma'da atıfta bulunulan hedef zenginleştirme kitidir.
2100 BioAnalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Bu, adım 3.1.4'te atıfta bulunulan otomatik bir elektroforez sistemidir.
Yüksek Hassasiyetli DNA Reaktif Kiti	Agilent Technologies	5067-4626	Kit başına 110 Numune; Bu, adım 3.1.4'te atıfta bulunulan bir DNA kalite analiz kitidir.
MiSeq Reaktif Kiti v3	Illumina, Inc.	MS-102-3003	600 Döngü Kiti; Bu, adım 3.1'de atıfta bulunulan NGS masaüstü cihaz reaktif kitidir.
MiSeq Kişisel Genom Dizileyici	Illumina, Inc.	SY-410-1003	Bu, 2.2.1, 3.1, 3.1.1, 3.1.2, 3.1.8, 3.2, 4.2.6, Temsili Sonuçlar ve Tartışma adımlarında atıfta bulunulan bir NGS masaüstü aracıdır.
Deney Yöneticisi	Illumina, Inc.		Bu, adım 3.1.1'de atıfta bulunulan ve BaseSpace Illumina, Inc. https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html Şekil 1. NGS teknoloji yazılımıdır
	.	SW-410-1000	Bu, 3.1.2, 3.2, 3.3, 3.3.1, 3.3.2, 3.4, 3.4.1, 3.4.2 ve 3.4.3 adımlarında atıfta bulunulan bulut tabanlı bir bilgi işlem ortamıdır. https://basespace.illumina.com/
CLC Genomics Workbench 10.1.1	Qiagen	832000	Bu protokolde kullanılan iş akışını modelleyebilen veri ön işleme için açık kaynak seçenekleri de mevcuttur. Bu, veri ön işleme için kullanılan yazılımdır ve 4. adımda ve Şekil 2.
Varyasyona Açıklama Ekle			http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/download/
RefSeq	Ulusal Biyoteknoloji Bilgi		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
dbSNP138	Ulusal Biyoteknoloji Bilgi		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi?view+summary=view+summary&build_id=138
Ekzom Agregasyon Konsorsiyumu	Broad Institute		http://exac.broadinstitute.org/
Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Ekzom Dizileme Projesi Avrupa Kohortu	Washington Üniversitesi ve Broad Enstitüsü		http://evs.gs.washington.edu/EVS/
ClinVar	Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi Bilgi		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
Birleşik Açıklama Bağımlı Tükenme,	Washington Üniversitesi ve Hudson-Alpha Biyoteknoloji		http://cadd.gs.washington.edu/
J. Craig Venter Enstitüsü'nden		Toleranssız Sıralama	http://sift.jcvi.org/
PolyPhen-2	Brigham ve Kadın Hastanesi, Harvard Tıp Okulu		http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/
İnsan Geni Mutasyon Veritabanı	Qiagen	834050	Bu, adım 5.2'de ve Temsili Sonuçlarda atıfta bulunulan bir hastalık mutasyon veritabanıdır. https://portal.biobase-international.com/cgi-bin/portal/login.cgi?redirect_url=/hgmd/pro/start.php
Varyantların Eklemeye Dayalı Analizi	Frey lab, Toronto		http://tools.genes.toronto.edu/
İnsan Ekleme Bulucu	Aix Marseille Üniversitesié
http://www.umd.be/HSF3/HSF.shtml< güçlü > diğer malzemeler< / güçlü >
Santrifüj
Tek kullanımlık transfer pipetleri