Yöntem makalesi

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

DOI:

10.3791/57272

⸱

2 Nisan 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oncohematology and Genetics. Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío, 2Institute of Biochemistry, Medical Faculty, Friedrichstrasse 24, Member of the German Center for Lung Research, Justus-Liebig-University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nükleer mimari plastisite kodlamayan RNA'ların, DNA metilasyonu, nucleosome yeniden konumlandırma gibi Histon kompozisyon ve değiştirme işlemleri de dahil olmak üzere dinamik epigenetik mekanizmalar tarafından kontrol edilir. Burada tekrarlanabilir, ucuz ve basit bir şekilde Kromatin erişilebilirlik belirlenmesi sağlayan bir Formaldehyde-Assisted yalıtım, Düzenleyici öğelerini (dürüst) protokolünü açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uygun gen ekspresyonu yanıt olarak, diğer bir deyişle, doku ve soy özel gen transkripsiyonu, hücre dışı yardımlar eleştirel Kromatin organizasyon yüksek tanımlı Birleşik üzerinde bağlıdır. Çekirdek dinamik mimarisi birden fazla mekanizma ile kontrol edilir ve transkripsiyon çıkış programları şekiller. Bu, bu nedenle, locus özel Kromatin erişilebilirlik tercihen deneysel değişkenlik potansiyel karıştırıcı bir kaynağı olabilir antikorlar bağımsız bir güvenilir bir şekilde belirlemek önemlidir. Kromatin erişilebilirlik hücreleri nispeten düşük bir dizi genel Kromatin erişilebilirlik belirlenmesi izin Formaldehyde-Assisted yalıtım, Düzenleyici öğelerini (dürüst) tahlil de dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle ölçülebilir. Burada genomik bölgeleri düşük protein doluluk ile basit, güvenilir ve hızlı tanımlaması sağlayan bir FAIRE protokol açıklayın. Bu yöntemde, DNA kovalent formaldehit crosslinking Aracısı olarak kullanarak Kromatin proteinleri bağlı ve küçük parçalara sheared. Ücretsiz DNA daha sonra fenol: kloroform ayıklama kullanılarak zenginleştirilmiştir. Ücretsiz DNA oranı nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) veya toplam DNA temsil eden bir denetim örneğe göre DNA sıralama (DNA-seq) tarafından belirlenir. Böylece alt Kromatin sıkıştırma genomik bölgeleriyle tanımlaması izin ücretsiz DNA örneği içinde bölgeleri daha gevşek bir Kromatin yapısı ile zenginleştirilmiş.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik hücrelerin genomik DNA sıkıca paketlenmiş oluşturarlar, kaldırılabilir veya DNA diğer proteinler etkileşime izin vermek için yenilenmiş gerekiyor. Bir gen transkripsiyon aktivasyonu genellikle nucleosomal yapısı, özellikle de1+ 1 nucleosome, daha açık bir yapılandırma transkripsiyonu RNA polimeraz tarafından kolaylaştırmak için yol açar. Ayrıca, düzenleyici bölgeleri, Organizatör ve arttırıcılar gibi Kromatin değiştiriciler veya transkripsiyon faktörleri2etkileşime izin vermek için onların Kromatin erişilebilirlik dinamik değişiklikleri meydana. Bu nucleosome serbest bölgeleri tanımlamak için birkaç yaklaşım geliştirilmiştir. Bu enzimler Dnaz gibi karşı hassasiyetini içerir ben3 veya sıkıca oluşturarlar sarılı değil zaman ulaşabileceğiniz sadece DNA micrococcal nükleaz4,. Retrotransposable elemanları (tahlil Transposase erişilebilir Kromatin, ATAÇ için) transposase-aracılı entegrasyonu açık Kromatin veya ücretsiz DNA kimliği için diğer yöntemleri dahil5veya Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanarak Histon karşı antikor. DÜRÜST yöntemi kapasitesi bir enzim DNA ulaşmak için veya belirli bir protein bir antikor bağlama temel değil, ancak yerine bir fenol: kloroform ayıklama6,7tarafından nucleosome serbest bölgeler arıtma üzerinde dayanır. Bu yöntemde, DNA'yı Kromatin proteinleri crosslinking Ajan formaldehit tarafından kovalent bağlı ve daha sonra küçük parçalara sonication tarafından sheared. DNA bölgeleri yoktur veya çok az oluşturarlar ile az veya hiç çapraz DNA/protein kompleksleri varken sıkıca paketlenmiş Kromatin bölgeleri-ecek-si olmak bol DNA/protein Glossar. Fenol: kloroform ayıklama sigara çapraz DNA çapraz proteinler için ise sulu faz ücretsiz DNA organik fenol faz veya organik sulu Interphase proteinler ile birlikte yakalanan arıtma sağlar. Toplam DNA örneği referansı ile karşılaştırıldığında bu ücretsiz DNA miktar Kromatin serbest bölgeler tanımlamasını sağlar. FAIRE yöntemi tek tek genomik bölgeler karakterizasyonu için burada açıklandığı gibi kullanılabilir, ama aynı zamanda derin sıralama için farklı modelleri8 ' de açıklandığı gibi birleştiğinde genom çapında Kromatin erişilebilirlik tanımlanması için uygundur , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. FAIRE-seq ve ataç-seq gibi diğer yöntemler tarafından elde edilen sonuçlar büyük ölçüde14üst üste. Çok sağlam dürüst yöntemidir, ucuz ve kolay nucleosome serbest bölgeleri tanımlamak için yöntemi gerçekleştirmek. Diğer yöntemlerin aksine bu enzimler (Dnaz seq, MNase-seq) veya transposases (ataç-seq) için gerektiği gibi sindirim uygun düzeyini belirlemek için pilot deneyler gerektirmez ve ayrıntılı bir son bir daha gözden geçirme15olarak ele. Düzeltilecek tek sonication koşulları ve bazı durumlarda fiksasyon zaman parametreleridir. Bu kağıt şematik Resim 1 ' de görüntülenir ve bunu bir sonicator dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez basit bir protokolünü açıklar. Protokol makul kısa sürede gerçekleştirilebilir ve dürüst Kromatin erişilebilirlik akciğer hücreleri11 ' den birincil fare karaciğer16' dan elde edilen hücreleri arasında değişen farklı hücre tipleri, bir dizi test etmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. gün 1: Hücre kültürü

  1. Hücreleri istediğiniz miktarı analiz edilecek kültür. Hücre kültür koşulları ve medya soruşturma altında hücre tipleri bağlıdır.
    Not: ilke olarak, herhangi bir ökaryotik hücre mükellef Kromatin erişilebilirlik FAIRE tarafından analizi için. Bu deneme için bir tek 10 cm tabak (v/v) FBS % 10 ve % 1 ' (w/v) penisilin/streptomisin ile desteklenmiş ve %5 CO2 ve 37 ° C için hücreleri % 70-80 izdiham ulaşana kadar 24 saat inkübe DMEM orta numaralı seribaşı 4 x 106 HEK-293T hücreleri (~ 8 x 10 çanak başına 6 hücre).

2. 2. gün: Formaldehit Crosslinking ve hücre hasat

Dikkat: Formaldehit çok zehirli ve her zaman bir duman başlık altında kullanılmalıdır. (Eldiven ve önlük) koruyucu giysiler giyin. Atık uygun şekilde atın.

  1. Formaldehit son konsantrasyonu % 1 (v/v) (270 µL % 37 (v/v) formaldehit hücre kültür ortamının 10 ml) ulaşmak için bir duman hood hücre kültür ortamda doğrudan ekleyin. Oda sıcaklığında (20-25 ° C) 10 min için kuluçkaya ve tabakları el ile her 2 dakikada öldürdü.
    Not: Çapraz zaman hücre tipine göre ayarlanabilir. Hücre hatları çoğunluğu için çapraz 10 dakika yeterlidir. Dokular için daha uzun incubations tüm hücreleri fiksasyonu sağlamak için gerekli olabilir.
  2. Glisin 0,125 M formaldehit gidermek için son bir konsantrasyon için Ekle (2.5 M glisin stokunun 500 µL kültür orta için 10 mL ekleyin). Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya ve her 2 dakikada öldürdü.
  3. 3 hücreleri yıkama x buz soğuk PBS ile (8 g/M NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4 · 2 H2O, 0,24 g/L KH2PO4, ayarlamak pH HCl ve NaOH 7.4 için). Orta Aspire edin ve PBS 10 mL ekleyerek doğrudan hücre kültür çanak veya şişeye yıka. İki kez gevşek yapışık hücreleri HEK-293T gibi söz konusu olduğunda çok dikkatli olmanın bu adımı yineleyin. PBS çanak tarafına dekolmanı hücrelerin önlemek için dikkatli bir şekilde ekleyin.
  4. Üçüncü yıkama sonra buz soğuk PBS ve buz bir 1,5 mL tepki tüp transfer 1 mL hücreye resuspend. Bir hücre kazıyıcı hücreler gerektiğinde ayırmak için kullanın.
    Not: sınırlı malzeme ile başlatırken, işlem sırasında örnek kaybını önlemek için düşük DNA'ya bağlanıcı tüpler kullanın.
  5. Santrifüj vasıl 300 x g soğutmalı masa üstü santrifüj 4 ° C'de 5 min için. Süpernatant dikkatle aspirating tarafından atmak.

3. hücre lizis ve Kromatin parçalanma

  1. Hücre Pelet 1 mL FAIRE lizis arabellekte (%1 (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µg/mL leupeptin, 10 µg/mL aprotinin, 2 mM PMSF), resuspend ve dikkatlice yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından hücreleri resuspend. Buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya. Bu aşamada-80 ° C'de örnekleri gerekirse depolar.
  2. Çapraz DNA ortalama 200-300 bp boyutuna yamultmak için solüsyon içeren temizleyicide. Sonicator belirli ayarları örnekleri ve kullanılan sonication aygıt her kaynak için belirlenmelidir. Her durumda DNA verimli nın yaşadığı emin olun. DNA kesme için bir en iyi duruma getirme adım adım 5,14 altında açıklanmıştır. Buz üzerinde örnekleri örnek Isıtma önlemek için sonication sırasında serin.
  3. Örnek 4 ° C'de 13.000 x g ve 15dk için santrifüj kapasitesi
  4. Süpernatant yeni bir tepki tüp aktarın. 100 µL aliquots örneklerinde bölün. -80 ° C'de örnekleri gerekirse depolar.
    Not: Protokol bu noktada durdurulabilir.

4. de-denetim DNA polietilenin

  1. 100 µL adım 3.4 toplam DNA örneği almak için bir başvuru olarak kullanılacak ve crosslink tersine çevirmek için aliquot al. 10 µL RNase-A (10 mg/ml) ekleyin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
  2. 10 µL (20 mg/mL), İndinavir K ekleyin. Programlanabilir bir termo blok 4 h 37 ° C'de ve sonra 6 h 65 ° c proteinler ayırmak için ve Glossar tersine çevirmek için kuluçkaya için kullanın. Son olarak, protokol devam etti kadar örnekleri 4 ° C'de tutun ve adım 5'e devam edin.
    Not: Hangi çapraz başvuru, böylece de crosslinking11ihtiyacını kaldırılması olarak olmamıştır hücrelerden Kromatin örnekleri diğer dürüst iletişim kuralları kullanırlar. Bu örnekler çapraz sonication verimlilik veya DNA istikrar için farklılıklar neden olabilir değildir aslında, bu nedenle test örnekleri olarak aynı işlemi undergone toplam DNA başvuru örnekleri kullanımını daha doğru olur.

5. gün 3: Fenol: kloroform arıtma DNA'ın

  1. Sigara-de-çapraz 3.4 adımından aliquot al. 10 µL RNase-A (10 mg/ml) ekleyin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
  2. De çapraz aliquot formu adım 5.1 ve 4.2. adımdaki de çapraz örnek almak ve buna paralel olarak devam edin. Son hacmi 300 µL ulaşmak için H2O ekleyin.
  3. Fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1) 300 µL bir duman hood ve girdap şiddetle ekleyin.
    Dikkat: Fenol aşındırıcı ve toksik ve her zaman bir duman başlık altında kullanılmalıdır. (Eldiven ve önlük) koruyucu giysiler giymek, reaksiyon boru sıkıca kapalı ve atık uygun şekilde atın emin olun.
  4. Santrifüj 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için
  5. Dikkatle üst sulu faz, 280 µL yeni bir tepki tüp aktarın. Ayrıca protein içeren Interphase üzerinden herhangi bir enkaz almak emin olun. Kalan alt aşamasını organik çözücü atık olarak atın.
  6. 5.3-5,5 adımları yineleyin ve dikkatli bir şekilde yeni bir tepki tüp üst sulu faz 270 µL aktarmak.
  7. Kloroform 270 µL bir duman hood ve girdap şiddetle ekleyin.
    Not: Bu adımı örnekten kalan herhangi bir fenol ortadan kaldırmak için kullanılır.
  8. Santrifüj 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için
  9. Dikkatle üst sulu faz 250 µL herhangi bir enkaz Interphase üzerinden taşımak için değil dikkat çekici bir yeni tepki tüp aktarın. Kalan örnek organik çözücü atık olarak atın.
  10. 5 M NaCl 25 µL ve isopropanol 250 µL ekleyin. Glikojen (20 mg/mL) 5 µL DNA taşıyıcı olarak ekleyin. İyi tüpler ters çevirme tarafından mix ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Santrifüj 13.000 x g DNA çökelti 4 ° c de 10 dakika.
  11. DNA Pelet 400 µL % 70 (v/v) etanol ile yıkayın. Santrifüj 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için
  12. Süpernatant dikkatle Aspire edin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuru Pelet izin. 100 µL TE arabellekte (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA) resuspend.
  13. De çapraz ücretsiz DNA örneği için 4 h 65 ° C arası DNA Glossar kaldırmak için kuluçkaya. Örnekleri-20 ° C'de depolayın
  14. Bir Spektrofotometre kullanarak DNA miktarını ölçmek ve parça boyutu %2 (w/v) özel jel üzerinde kontrol etmek için bir aliquot çalıştırın. Ayarlamak belgili tanımlık kesme zamanı ve yoğunluklarını, Jel Elektroforez 200-300 BP ortalama bir büyüklük elde etmek için özel göre DNA boyutu analiz sonuçları bağlı olarak.

6. ücretsiz Versus toplam DNA kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) tarafından belirlenmesi

  1. Nucleosome-ücretsiz DNA ('aşağıdaki ücretsiz DNA anılacaktır) oranını karşı toplam DNA qRT-PCR17,18tarafından belirlenir. Örnekleri de kantitatif Mikroarray hibridizasyon veya derin sıralama genom çapında belirlemeleri için analiz edilebilir.
  2. Tasarım qPCR astar test edilecek bölgeler ve pozitif ve negatif kontrol eder.
    Not: Uygun olumlu ACTB, GAPDH, TPI1 veya TUBA1A gibi aktif kopya etmek temizlik genlerin organizatörü yer alan astar denetimleridir (β-aktin, GAPDH, TPE veya α-tübülin kodlama). Uygun negatif denetimler heterochromatin bölgeler veya gen çöller bulunur. Diğer uygun negatif denetimleri genomik bölgelerde dinamik olarak düzenlenmiş odağı denetlemek için yerel kopya numarası farklılıklar (Tablo 1) için soruşturma altında bitişik tasarlanabilir.
  3. DNA örnekleri 10 ng/µL TE arabelleği ile son bir konsantrasyon için sulandırmak ve seyreltme faktörü son hesaplamalar için dikkate almak (bkz. Adım 6.5).
  4. QPCR tepki triplicates iyi başına aşağıdaki reaksiyon karışımı ile bir 96-şey plaka olarak ayarlayın: şablon DNA: 20 ng (2 µL), ileri astar 200 nM (5 mikron stokunun 0.4 µL), ters astar 200 nM (5 mikron stokunun 0.4 µL) , yeşil boya (2 x hisse senedi 5 µL) ve H2O 10 µL için içeren tepki mix kullanmak için ticari bir hazır.
  5. Mutlak miktar modunu kullanarak bir gerçek zamanlı qPCR cihazda, çalıştırın ve Ct örneklerinden farklı astar çiftiyle belirlemek. 6.3. adımdaki seyreltme faktörler dikkate alarak toplam DNA örneği almak için aşağıdaki formülü kullanarak her astar için ücretsiz DNA'ın kurtarma oranını hesaplamak:
    figure-protocol-1
    Temsilcisi sonuçları ve bir örnek hesaplama Tablo 2' de verilmiştir.
  6. Örnekleri arasında farklılıklar telafi etmek için olumlu denetim kurtarma oranı için normalize:
    figure-protocol-2

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromatin erişilebilirlik MHC sınıf II genlerinin farklılıkları HEK293T hücrelerdeki yayımlanan19ölçmek için FAIRE yöntemi kullandık. MHC sınıf II kodlama genler hücrelerin (ZPT), yapısal veya yanıt20sinyal sitokin olarak sunulması antijen ifade edilir. MHCII gen ifadesinin XY kutuları, organizatörü ve bu genlerin21,22arttırıcılar yer olarak adlandırılan belirli DNA öğelere bağlar bir aktivatör karmaşık tarafından tahrik edilmektedir. Bu Kromatin, düzeyinde MHC sınıf II genler HLA-DPB1 ve HLA-DMA seçilen bölgelerde bizim dürüst analiz tarafından ortaya yansıtılır. Bu deneyler bu Kromatin gen organları (Şekil 2) daha küçük iken XY kutuları kapsayan bölgeler itibariyle açık olduğunu gösterdi.

Hesaplamalarda bu özel deneme için bir örnek olarak biz toplam seyreltilmiş DNA örneği 10 (seyreltme faktörü 10), ve ücretsiz DNA örneği değil düşürülmüştü (seyreltme faktörü 1) qRT PCR. Cts test farklı bölgeler için alınan ve hesaplamalar final kurtarma oranları ve göreli kurtarma oranları elde etmek için listelenen Tablo 2. Bu göreli kurtarma oranları ACTB organizatörü olumlu denetim kullanarak elde edilmiştir. Bu hesaplamalar Şekil 2' de gösterilen sonuçlar üretmek için kullanılan çoğaltır biri için olduğunu unutmayın.

Farklı bir bağlamda Kromatin erişilebilirlik indüklenebilir gen ifadesi için bir model olarak test edildi. Bu durumda, Kromatin sıkıştırma pro-inflamatuar uyarıcı tümör nekrozis faktör (TNF) yanıt olarak hızlı değişiklikler ölçüldü. HeLa hücreleri tedavi edilmemiş veya 1s FAIRE Kromatin sıkıştırma organizatörü bölge kontrol ifade TNF-duyarlı sitokin İnterlökin 8 (IL8) kodlama gen, ölçmek için takip için TNF ile uyarılan kalmıştı. Bu sonuçlar bir şiddetle artan Kromatin erişilebilirlik TNF teşvik hücreleri (şekil 3) IL8 organizatörü gösterdi. Il-8 organizatörü, erişilebilirlik TNF stimülasyon sonra bile bir dramatik Kromatin düzenleyici bu bölgede remodeling gösterilen ACTB organizatörü bulunan daha yüksektir. Elde edilen kurtarma oranı bu durumda (ACTB faktörü) pozitif kontrol kullanılan bölgede elde daha yüksek olduğu gibi göreli kurtarma oranı daha yüksektir.

figure-results-1
Şekil 1: dürüst iş akışı. Hücreleri çapraz doğrudan hücre kültür şişesi veya tabak içinde formaldehit(a)ekliyoruz. Formaldehit Şoklama sonra hücreler buz soğuk PBS (B) ile üç kez yıkanmış ve nerede FAIRE lizis arabellekte resuspended ve (C) DNA yamultmak için sonicated bir tepki tüp transfer. Ayıklanan Kromatin bir aliquot de-çapraz toplam DNA referans (D), almak 65 ° C'de Isıtma tarafından kullanılmaktadır ve daha sonra ücretsiz DNA fenol: kloroform çapraz ve de-çapraz aliquots (E), hem de kullanarak elde edilir. Son olarak, DNA sayılabilir ve (F) toplam DNA'sı vs ücretsiz oranı hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: Kromatin erişilebilirlik MHC sınıf II Gen belirlenmesi küme HEK293T hücrelerde. HEK293T hücreleri FAIRE tarafından analiz edildi. Arasındaki oran ücretsiz karşı toplam DNA (i.e., göreli kurtarma oranı) ACTB gen Düzenleyici için olumlu bir denetim, Chr. 12 olarak negatif kontrol, bir heterochromatin Bölge Düzenleyici bölgeler ve MHC gen organları belirlendi Sınıf II genler HLA-DMA ve HLA-DPB1. Üst kısmı locus şematik gösterimi ve astar konumunu gösterir. Hata çubukları iki biyolojik çoğaltır triplicates içinde ölçülen standart sapmalar temsil. Rakam bir yayımlanan raporu19güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: değişiklikleri yanıt olarak TNF tedavisi IL8 organizatörü, DNA erişilebilirlik. HeLa hücreleri TNF ile teşvik (20 ng/mL) 1 s ve dürüst tarafından analiz için. Arasındaki oran ücretsiz karşı toplam DNA ACTB (pozitif kontrol) organizatörü, heterochromatin bölge Chr. 12 (negatif kontrol) ve IL8 Düzenleyici için tespit edildi. Hata çubukları temsil üç biyolojik çoğaltır çoğaltmaları ölçülen değerlerin ortalamasının (SEM) standart hataları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: optimizasyon sonication koşullardan. 293T hücrelerinden çıkarılan Kromatin odaklanmış bir sonicator uygun tüpler (Malzemeler tablo) ile kullanarak sonified. Kromatin 30 yineleyerek belirtilen süre için sonicated s aşağıdaki ayarlarla: tepe gücü 150, görev faktörü 15, döngüleri patlama 500, 30 s: tepe gücü 2.5 tarafından takip, görev faktörü 15, devir patlama 500. Elde edilen Kromatin de-çapraz, fenol: kloroform çıkarma tarafından saflaştırılmış ve bir % 2 özel jel dolu oldu. Jel lekeli bir etidyum bromür gösterilir ve molekül ağırlığı işaretleri konumlarını kan basıncı gösterilir. Bu deneyde, en uygun Kromatin boyutu (200-300 bp) sonication 20 dk sonra elde edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

AstarSıra
ACTB-organizatörü-FAAAGGCAACTTTCGGAACGG
ACTB-organizatörü-RTTCCTCAATCTCGCTCTCGC
Chr. 12 negatif kontrol-FATGGTTGCCACTGGGGATCT
Chr. 12 negatif kontrol-RTGCCAAAGCCTAGGGGAAGA
HLA-DMA-XY-kutu-FCATCAGTCACTGGGGAGACG
HLA-DMA-XY-kutu-RGCTTCCCAGCCCAGTTACAT
HLA-DMA-5'-FGGAGAGAACAATCTCCGCTTCA
HLA-DMA-5'-RAGCTGCTATGTGTGGTTGGT
HLA-DMA-3'-FTGGGGACCTAGTTAGGGAGC
HLA-DMA-3'-RAGATCCATGGGAGGAGGCTT
HLA-DPB1-XY-kutu-FGTCCAATCCCAGGGTCACAG
HLA-DPB1-XY-kutu-RTGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA
HLA-DPB1-5'-FGCGTGTTCATGTCTGCATCC
HLA-DPB1-5'-RTGATCCTCAGAGCCTGGACA
HLA-DPB1-3'-FCCAGCCTAGGGTGAATGTTT
HLA-DPB1-3'-RGCCTGGGTAGAAATCCGTCA
IL8 Organizatörü-FGTGATGACTCAGGTTTGCCCT
IL8 Organizatörü-RCTTATGGAGTGCTCCGGTGG

Tablo 1: Astar qPCR için.

figure-results-5
Tablo 2: FAIRE göreli kurtarma oranları örnek hesaplamalar. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DÜRÜST nucleosome serbest bölgeler tanımlaması sağlayan güçlü ve ucuz bir yöntemdir. Bu DNA buna sarılarak oluşturarlar kolayca çapraz histonlarla için olabilir ilkesine dayanır. Fenol: kloroform ayıklama çapraz sigara ve protein içermeyen DNA parçalarının alt fenol faz ve bir ölçüde Interphase (şekil 1) bulunur protein bağlı DNA ayırmak için kullanılır. Bu nedenle, nucleosome içermeyen bölgeler içinde sulu faz ücretsiz DNA kısmını overrepresented. Bir sayıda yayın hangi burada açıklanan yordamı tamamlamak üzere istişare FAIRE yöntemi23,24,25,26, detaylı iletişim kurallarını açıklar.

Benzer şekilde Kromatin yapısı belirlemek için kullanılan bir diğer yöntem, FAIRE yöntem aynı zamanda eleştirel DNA'sı en uygun kesme bağlıdır. Parçaları çok uzun ise, herhangi bir nucleosome arındırılmış bölge bitişik Kromatin bağlı DNA tarafından maskeli. Parçalar çok küçük, qPCR veya derin sıralama tarafından algılamayı çok zor oldu. Bu nedenle, DNA sonication kontrollü ve çevresinde parçaları elde etmek için en iyi duruma getirilmiş bir çok önemli parametredir 1-2 oluşturarlar (şekil 4) temsil 200-300 bp uzunluğu.

Nihai sonucu etkileyen başka bir örnek polietilenin parametresidir. Burada açıklanan fiksasyon yordamı çoğu hücre satırları için geçerli olsa da, araştırmacı dikkatli bir şekilde altında eğitim, belirli örnek için bu adım özellikle dokular, nereye uzun fiksasyon kez izin vermek gerekli olabilir kullanırken değerlendirmek gerekir formaldehit doku örneği hücrelerde ulaşmak için.

Diğer yöntemler aksine, Dnaz gibi ben veya micrococcal nükleaz aşırı duyarlılık, ChIP veya ataç, dürüst bir enzimatik aktivite veya belirli antikor dayanmaz, ve bu nedenle titrasyon veya reaksiyon koşulları duruma getirilmesi gerekmez. Bu dürüst Kromatin erişilebilirlik labs Kromatin alandaki küçük deneyimi için ölçmek için ideal bir yöntem sağlar. Buna ek olarak, pilot deneyler sadece DNA kesme adım atarsan crosslinking zaman optimize etmek için gerekli gerekli olduğunda.

Yöntem başlangıçta Maya6' geliştirilmiş, ancak aynı zamanda memeli hücreleri için uzatıldı. DÜRÜST yöntemi ile saf DNA Kromatin durumu genom çapında karakterizasyonu sağlayan derin sıralama için kullanılabilir. Bu zaten bir dizi çalışmalar8,9,10,11,12,13,19,27, yararlı olmuştur 28.

Her ne kadar bazı farklılıklar ortaya FAIRE-seq deneyler sonuç Dnaz-seq14gibi diğer yöntemler tarafından elde edilen sonuçlar ile büyük bir örtüşme göster. Bu DNA bölgeleri DNA/protein Glossar üretmek daha az eğilimli olur ve bu yüzden gibi nucleosome ücretsiz belirlenir ise rahat veya yenilenmiş oluşturarlar hala bölünme Dnaz tarafından engel olabilir örnek metodolojik farklılıklar nedeniyle ben, olmasıdır DÜRÜST9kullanarak bölge. Ayrıca, Sigara Histon proteinleri RNA polimeraz gibi veya epigenetik işaretleri için okuyucu proteinler DNA/protein Glossar neden olabilir ve böylece FAIRE deneyler protein Paketli bölgelerde olarak yorumlanır. Bu sınırlamalar böylece kapsamlı bir bakış açısı elde etmek için farklı yöntemlerin bir bileşimini kullanmaya gerek yükselterek Kromatin durumu tayini için kullanılan her yöntem için doğasında vardır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, lütfen sonication aygıt paylaşımı için Tilman Borggrefe (Giessen Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. M.L.S. işten Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, mükemmellik küme kardiyo-pulmoner sistem (ECCPS, EXC 147/2), Deutsche Krebshilfe (111447) ve IMPRS-HLR program gelen hibe tarafından desteklenmektedir Max-Planck topluluğu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fenol: kloroform: izoamil alkol 25: 24: 1Carl RothA156.1
Glikojen, 20 mg / mlThermo FisherR0561
ABsolute QPCR Karışımı, SYBR-Green, RoxThermo FisherAB1162B
Proteinaz K, 20 mg / mlThermo FisherEO0491
RNase A, 10 mg / mlThermo FisherEN0531
LeupeptinSigmaL8511
AprotininSigmaA1603
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)Sigma78830
miliTUBE 1 ml AFA FiberCovaris520130
Tutucu milliTUBE 1mlCovaris500371
Covaris S220 Fokuslu ultrasonicatorCovaris
StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR SistemiUygulamalı Biosistems4376600

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).">Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
  2. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).">Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  3. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).">Wu, C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
  4. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).">Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
  5. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).">Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  6. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).">Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
  7. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).">Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
  8. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).">Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
  9. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).">Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
  10. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).">Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
  11. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).">Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  12. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).">Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
  13. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).">Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  14. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994(2015).">Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994(2015).
  15. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).">Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  16. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28(2016).">Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28(2016).
  17. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455(2014).">Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455(2014).
  18. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50(2013).">Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50(2013).
  19. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547(2017).">Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547(2017).
  20. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).">Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
  21. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).">Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
  22. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).">Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
  23. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).">Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
  24. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).">Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  25. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).">Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).
  26. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).">Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
  27. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660(2017).">Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660(2017).
  28. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).">Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

FAIRE DeneyiFormaldehit apraz Ba lamaDNA FragmantasyonuFenol Kloroform EkstraksiyonuKantitatif PCRDNA DizilemeSonikasyon ProtokolH cre LizisiJel Elektroforezi

İlgili makaleler