Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

9.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57383

⸱

14 Mayıs 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Boston University School of Medicine, 2Department of Medicine, Section of Hematology and Oncology, Boston University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Canlı hücre görüntüleme bilgi hazinesi tek hücreler veya tüm nüfus üzerinde ulaşılamaz olan sabit hücre tek başına Imaging tarafından sağlar. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kuralları açıklanır.

Özet

Canlı hücre görüntüleme doğrudan tek hücreler biyolojik olayları uzun bir süre görselleştirmek için kullanılan güçlü bir tekniktir. Son on yıl içinde yeni ve yenilikçi teknolojileri oldukça canlı hücre görüntüleme pratiklik gelişmiş. Hücreler şimdi odakta tutulabilir ve sürekli olarak birkaç gün süre altında tutulan 37 °C ve %5 CO2 hücre kültür koşulları görüntüsü. Ayrıca, birden çok alan açısı farklı deneysel koşullar temsil eden aynı anda, böylece-mek şartıyla yüksek-den geçerek deneysel veri elde edilebilir. Canlı hücre görüntüleme doğrudan görselleştirme ve dinamik hücresel olaylar zamansal Nefelometri için vererek sabit hücreli görüntüleme önemli bir avantaj sağlar. Canlı hücre görüntüleme aksi takdirde nüfus tabanlı deneyleri kullanarak atlanmış tek hücre davranış değişimi de tanımlayabilir. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kurallarını açıklar. Biz yöntemleri mitotically olup olmadığını görmek için hücre ölmektedir doğrudan mitoz veya geri Interphase içine kayma tutuklandı göstermek. Ayrıca floresan ubiquitination tabanlı hücre döngüsü göstergesi (FUCCI) sistem hücrelerinin hücre döngüsü yeniden girerek bir özelliği olan Mitotik kayma tarihi Interphase kesir değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Son olarak, biz nükleer zarf rüptürü olayları tanımlamak için bir canlı hücre görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır.

Giriş

Anti-Mitotik uyuşturucu uzun solid tümör türleri kemoterapi rejimleri içinde kullanılmıştır ve büyük etkinlik1,2,3kez göster. Mechanistically, bu ilaçların normal Mitotik ilerleme bozabilir ve hızla Proliferasyona içinde Mitotik tutuklama teşvik kanser hücreleri. Ancak, hücre kader Mitotik tutuklama karşılık olarak son derece değişkendir: hücrelerin bir kısmı doğrudan doğruya--dan mitoz hücre ölümü geçer iken, diğerleri mitoz dışarı çıkıp tetraploid hücreler (bir süreç olarak adlandırdığı Mitotik kayma) olarak Interphase için dönmek4, 5,6,7,8. Bu Interphase hücreler apoptosis yürütmek, kalıcı hücre döngüsü tutuklama geçmesi veya bile hücre döngüsü4,5,6,7,8,9 yeniden girin ,10,11. Sadece uyuşturucu kaldırma, aşağıdaki hücre döngüsü yeniden girmek için Interphase kaymasını tarafından Mitotik hücre ölümü kaçmasına hücreleri bu nedenle kanser hücre nüfusun yeniden doğuş için katkıda bulunabilir. Ayrıca, mitoz slip tetraploid ve tetraploidy tümör sürücüler kromozom istikrarsızlık tanıtmak için bilinen hücreler12,13,14,15Relaps. Yanıt olarak anti-Mitotik ilaç tedavileri hücre kaderini kontrol faktörler tanımlama bu nedenle geçerli tedavi optimize etmek için önemlidir.

Bu protokol için doğrudan gözlemlemek ve anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel karşılık olarak uzun süreli Mitotik tutuklama tabi hücre kaderi çalışma yöntemleri açıklanmaktadır. Paklitaksel olduğunu kurulmuş bir klinikte tedavi ve göğüs, yumurtalık ve akciğerler16,17,18,19, de dahil olmak üzere birçok tümör türleri'nde, son derece etkili kanıtlamıştır 20. Paklitaksel, porsuk ağacı kabuğundan elde edilen bir bitki alkaloid olan mikrotübüller stabilize ve böylece onların dynamicity21,22engeller. Paklitaksel tarafından Mikrotubul dinamikleri nemlendirme G1 G2, hücre döngüsü ilerleme etkilemez iken ilaç Milli Meclis denetim noktası sürekli etkinleştirme sırasında mitoz engelleyen tarafından yol açmaz kinetochore-Mikrotubul eki (23,24burada derinlemesine gözden)25. Sonuç olarak, anafaz başlangıçlı Paklitaksel tedavi hücrelerinde ve uzun süreli Mitotik krizi sonuçlarında engellenir.

Bu iletişim kuralı önce canlı hücre görüntüleme deneylerde Mitotik hücre tanımlamak için yaklaşımlar anlatacağım. Mitoz iki fark hücre biyolojik değişiklikler nedeniyle yapisan doku kültürü hücrelerdeki görüntülenmeyecektir. İlk olarak, kromozomlar son derece hemen önce nükleer zarf arıza konsantre olmak. Kez tespit ederken çift faz kontrast mikroskobu tarafından kromozom yoğunlaşma floresan kullanarak Etiketler Bu etiket kromozomlar (örneğin fluorescently etiketli Histon proteinleri) daha iyi bir şekilde algılanabilir. İkinci, Mitotik hücre hücre yuvarlama neden dramatik morfolojik değişiklikler de belirlenebilir.

Bu iletişim kuralı sonra canlı hücre görüntüleme yaklaşımlar uzun süreli Mitotik tutuklama yaşandığı hücre kaderi izlemek için nasıl kullanılacağını gösterecektir. Hücreler mitoz içinde tutuklanan üç ayrı kader biri tabi. İlk olarak, hücre hücre ölümü sırasında mitoz uygulayabilir. Ölen hücreleri küçültme, bleb ve/veya yırtılması gözlemlediği gibi bu olay kolayca ışık mikroskobu tarafından görüntülenmiştir. İkinci olarak, hücreler mitoz çıkabilirsiniz ve dönüş geri kromozom segregasyon veya sitokinez Interphase için bir işlemi Mitotik kayma olarak. Bu işlemi kromozom decondensation ve/veya kolayca Mitotik hücre düzleştirme tanımlar. Mitoz kayma hücreleri de sık sık düzensiz, çok loblu çekirdeği görüntülemek ve sık sık birkaç micronuclei5liman. Üçüncü olarak, hücreler mitoz içinde tutuklandı anafaz başlatmak ve mitoz uzun bir bekleme süresinden sonra devam edin. Nadir olsa da daha yüksek ilaç konsantrasyonlarda, bu davranış tutuklandı hücreleri Milli Meclis denetim noktası tatmin olması veya Milli Meclis denetim noktası kısmen zayıflamış veya arızalı olduğunu göstermektedir. Anafaz başlangıçlı kromozom segregasyon ve sonraki sitokinez canlı hücre Imaging'i kullanma tarafından görüntülenmeyecektir.

Mitotik kaymayı uygulanan tarafından Mitotik hücre ölümü kaçmasına hücreleri kaderi izlemek için canlı hücre görüntüleme yöntemleri de açıklanacaktır. Mitotik kayma geçmesi hücreleri ya sonraki Interphase ölecek, dayanıklı G1 hücre döngüsü krizi tetiklemek, ya da hücre bölünmesi4yeni bir tur başlatmak için hücre döngüsü yeniden girin. Mitotik kaymalarını aşağıdaki hücre döngüsü yeniden girin hücreleri kısmını belirlemek için FUCCI (floresan ubiquitination tabanlı hücre döngüsü göstergesi) sistemini kullanan bir yaklaşım açıklanacaktır. FUCCI G1/S geçiş doğrudan görselleştirme için sağlar ve uzun vadeli yaşamak- vitro ve in vivo26,27Imaging hücre ile birlikte kullanılabilir. FUCCI sistemi iki fluorescently etiketli protein, hCdt1 kesilmiş formları yararlanır (faktör 1 Kromatin lisans ve DNA ikileşmesi) ve hücre döngüsü konumuna bağlı olan düzeyleri salınım hGeminin. hCdt1 (kırmızı bir floresan protein erimiş) yüksek düzeylerde SCFSkp2 nerede bu DNA çoğaltma için lisans için davranır, ancak ubiquitinated E3 Ubikuitin ligaz tarafından G1 aşamasında mevcut olduğunu ve S/G2/M aşamaları sırasında önlemek için bozulmuş yeniden çoğaltma DNA26. Buna karşılık, hGeminin, (bir yeşil flüoresan protein erimiş) bir inhibitörü olan hCdt1 olan düzeyleri en yüksek S/G2sırasında /M, ama ubiquitinated E3 Ubikuitin ligaz APC tarafındanCdh1 ve mitoz sonunda G1 boyunca bozulmuş 26. hücreleri G1 ve yeşil Floresans S/G2/M sırasında sırasında kırmızı Floresans sergilemek gibi sonuç olarak, hücre döngüsü aşamasının bir basit Floresans okuma FUCCI sunar. FUCCI önemli bir ilerleme (bromodeoxyuridine boyama gibi) diğer yaklaşımlar çünkü o does değil istemek hücre fiksasyon ve tek hücre görüntüleme için gerek kalmadan ek sağlar proliferatif hücreleri tanımlamak için sistemidir farmakolojik hücre popülasyonlarının eşitlemek için tedaviler. Bu protokol için tartışılmamış rağmen ek canlı hücre sensörler de bir helikaz B sensör G128, DNA ligaz RFP29 ve PCDNA-GFP30 sensörleri için de dahil olmak üzere hücre döngüsü ilerleme görselleştirmek için geliştirilmiştir S-faz ve son FUCCI-4 sensör için hangi hücre döngüsü31tüm aşamalarında algılar.

Son olarak, nükleer zarf rüptürü algılamak için bir canlı hücre görüntüleme yöntemi açıklanır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda nükleer zarf kanser hücrelerinin böylece nucleoplasm ve sitoplazma karışacak içeriğini izin veren kararsız ve patlama, eğilimli olduğunu ortaya çıkardı. Nükleer rüptürü, olarak adlandırdığı bu fenomen, DNA hasarı ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı32,33,34,35,36,37, uyarılması tanıtabilirsiniz 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. nükleer kopma nedenleri eksik olarak karakterize kalırken, bu nükleer yapısında deformasyonlar bir nükleer rüptürü42olaylarının artması ile ilişkilendirmek bilinmektedir. Paklitaksel tedavisinin bir iyi bilinen etkisi çarpıcı anormal nükleer yapılar mitoz takip olduğunu; Bu nedenle, canlı hücre Imaging kullanarak nükleer rüptürü ölçmek için bir yöntem, Paklitaksel tedavi nükleer rüptürü olaylar sıklığı artarsa da keşfetmek açıklanacaktır. Nükleer rüptürü tarafından nükleer hedefli floresan protein kaçağı gözlenen (tandem dimer tekrar bir nükleer yerelleştirme sinyal TDRFP-NLS erimiş RFP,örneğin ) sitoplazma içine tespit edilebilir. Bu sızıntı rüptürü olayların basit Nefelometri sağlayan göz tarafından net olarak görünüyor.

Bu iletişim kuralı bir kodlanmış sahne ve autofocusing yazılım ile donatılmış bir widefield epifluorescence mikroskop gerektirir. Otofokus yazılım odak hücrelerde görüntüleme dönemi süresince korur sırada kodlanmış sahne alanı için tanımlanmış XY koordinatları, tam otomatik hareketi sağlar. Ayrıca, ekipman hücreleri ile 37 ° C'de % 5 CO2 nemlendirilmelidir korumak için bu protokolü gerektirir bir atmosfer. Bu bir sıcaklık içinde tüm mikroskop içine alarak elde edilebilir ve atmosfer kontrollü muhafaza veya sahne alıcı cihazlar kullanarak bu yerel olarak sıcaklık ve çevre korur. Bu protokol için kullanılan faz kontrast objektif bir planı fluor 10 olduğunu x 0,30 sayısal bir diyafram ile. Ancak, 20 X hedefleri de bir tek odak düzlemi içinde her iki yuvarlak Mitotik ve düzleştirilmiş Interphase hücrelerini tanımlamak için yeterli bulunmaktadır. Faz kontrast gerçekleştirme (Bu yöntemde anlatıldığı gibi) görüntüleme, kapak cam veya plastik olabilir. Fark girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullandıysanız, depolarizasyon ışık önlemek için bir cam kaplama kullanmak zorunludur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu iletişim kuralı olmayan dönüştürdü ve kromozom istikrarlı retina Pigmentli epitel (RPE-1) hücre kültürünü yaşamak-hücre görüntüleme deneyler için kullanarak odaklanmaktadır. Ancak, hücre kültür koşulları gerektiği gibi ayarlanır sürece bu iletişim kuralı için herhangi bir yapisan hücre kültürünü adapte edilebilir. Tüm yordamları kurumsal Biyogüvenlik ve Etik kurallar ve düzenlemeler için uygun olmalıdır.

1. hücreleri canlı hücre görüntüleme için hazırlanması

  1. Taze çözdürülen ve erken geçiş RPE-1 hücreleri insan Histon H2B floresan bir protein (örneğin H2B GFP) erimiş veya (FUCCI ifade hücreler üretmek nasıl ayrıntılı bir iletişim kuralı başvuru45' bulunabilir) FUCCI sistem ifade kullanma Mitotik hücre kader değerlendirmek için.
    1. Nükleer rüptürü sıklığını ölçmek için RPE-1 hücreleri H2B GFP ve tandem dimer tek nükleer yerelleştirme sinyal (TDRFP-NLS) erimiş kırmızı floresan protein ifade kullanın.
      Not: Üç yeşil flüoresan proteinlerin yapıları erimiş tek nükleer yerelleştirme sinyalle tandem (GFP3- NLS) da Rüptürü (olduğu gibi başvuru42) göstermek için kullanılmıştır.
    2. 10 cm doku kültürü plakaları uygun büyüme orta hücreleri korumak. RPE-1 hücreleri içinde fenol red-ücretsiz, Dulbecco'nın modifiye kartal orta/besin karışımı F-12 (DMEM:F12) % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 IU/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş sürdürülür.
  2. Orta hücrelerden Aspire edin, 10 mL steril, oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuz kalan orta kaldırmak ve PBS Aspire edin (PBS) ile doku kültürü bulaşık yıka.
    1. 2 mL % 0.25 ekleyin ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) hücreleri ile tripsin ve 37 ° C'de 3 dk ya kadar hücreleri çoğunluğu plaka ayırdıktan kuluçkaya.
      Not: hücreleri tripsin gerekenden daha uzun tutmayın.
  3. 10 mL serolojik stripette trypsinized hücrelerle toplamak ve bir 15 mL konik tüp içinde dağıtmak için tam orta 10 mL ekleyin.
    1. Hücreleri tarafından Santrifüjü 180 x g oda sıcaklığında 3 dk de cips.
  4. Pelet bozmaya değil dikkatli olmak süpernatant, Aspire edin ve sonra iyice Pelet 10 mL taze orta orta yukarı ve aşağı serolojik stripette pipetting hafifçe tarafından resuspend.
  5. Bir hemasitometre veya makine sayma otomatik hücre hücreleri46kullanın.
    1. Yeni bir konik tüp 30.000 hücre/ml tam orta hücrelerde sulandırmak.
    2. Ertesi gün (% 30-50 birleşmesi) gerekli hücresel yoğunluğu sağlamak için çanak Imaging 30.000 RPE-1 (1 mL cilt) başına hücre iyi dipli bir 12-şey cam (#1.5 kalınlık) plaka.
      Not: Her zaman eldiven ile plaka işlemek ve cam alt dokunmak dikkatli olun.
  6. Hücre kadar tam olarak eklemek ve cam popolu görüntüleme plaka üzerinde dümdüz bir 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesine büyümeye izin. Hücreleri az 4 h olarak ekleyebilirsiniz, bu hücreleri değil ilaçlar ile tedavi ve ertesi gün kadar yansıma önerilir.
  7. (İstenen son konsantrasyonu tam orta ve mix Dimetil sülfoksit (DMSO) çözünmüş) Paklitaksel iyice ekleyin.
    1. Yalnız bir denetim olarak kullanmak için DMSO eşit bir birimdeki tam orta hazırlayın.
    2. Uyuşturucu ya da DMSO hücrelere eklemeden önce 37 ° C içeren orta sıcak. Bu ani sıcaklık değişikliği nedeniyle odak kayması engeller.
    3. Paklitaksel veya DMSO 12-şey görüntüleme çanak bireysel wells için yalnız içeren orta 1 mL ekleyin.

2. mikroskop yaşamak-hücre görüntüleme için ayarlama

  1. Herhangi bir parmak izi ya da görüntüleme ile girişime neden olabilir toz kaldırmak için optik temizleyici ile görüntüleme çanak cam alt temiz. Tüm cam yüzey ıslak için yeterli optik temizleyici kullanın.
  2. Görüntüleme çanak adaptör mikroskop sahnede cam alt çanak yerleştirin, yemek plastik kapağı çıkarın ve cam tepesinde odası ile çanak kapağı. %5 CO2/ oluşan hava sürekli bir akış sağlamak için bir vana odası olduğundan emin olun.
    Not:, steril su banyosu konut içine eklenen boru aracılığıyla gaz % 5 CO2nemlendirmek için akıtılana. Bu gaz % 95 nem equilibrated haline sağlar.
  3. Başlat/mikroskop kontrol yazılım programı kullanarak kodlanmış sahne kalibre edin. Bu doğru XY koordinatları sağlamak ve odak kayması önlemek.
  4. Faz kontrast optik kullanarak hücreleri üzerinde odaklanmak ve Kohler aydınlatma (ışık odaklanmak ve en iyi kontrast sağlamak için başvuru47ayrıntılı olarak açıklanmıştır) gerçekleştirin.
  5. Beyaz ışık ve kullanılan tüm floresan kanallar (poz vermek % 75 piksel doygunluk kamera olduğunu ideal, bu ışık miktarını hücrelere zehirli değil sağlanan) için en uygun pozlama süreleri belirlemek için satın alma yazılımı kullanın.
    1. Birkaç tane seçmek için satın alma yazılım kullanın üst üste alanları bakıldığında her şey için düşsel. Nerede hücreleri cam alt de yapıştırılır ve % 50 ve % 70 birleşmesi arasında görüntüleme bölgeleri seçin. Bu daha sonraki analiz zorlaştıracak gibi alanlarda olmalı hücrelerinin kaçının.
      Not: Üst üste alanları görüş aynı hücreler iki kez izleme önlemek için her kuyudan olması önemlidir. Hücreleri son derece hareketli iseniz, bir merkez noktası ve dikiş onları bir geniş görüş alanı yapmak için tekrar bir araya dışarı yayılan birkaç görüntü elde etmek gerekli olabilir.
  6. Tüm noktaları odakta deneme süresince korunur emin olmak için mikroskop'ın autofocusing özelliği etkinleştirin.
  7. Mitotik hücre kader değerlendirmek için toplamak görüntüler için görüş her seçili alan her 10 min kadar 96 h. Unperturbed mitoz 20-40 dakika sürer ve böylece 10 dk aralıklarla hücreleri bölmek zamanları belirlemek için yeterli örnekleme sağlayacak görüntüleme yazılımı ayarlayın. Geçici bir olaydır, nükleer rüptürü tanımlamak için görüntüleri her 5 dakikada elde etmek.
    Not: Bunlar genellikle üzerinde uzun deneyler ile resim alma engelleyebilir gibi görüntü alma yazılımı sürüş bilgisayar otomatik güncelleme, ekran koruyucular ve enerji tasarrufu modu devre dışı, bulunduğundan emin olun.
  8. Görüntüleme deneme başlatmak. Düzenli olarak resim alma video boyunca sorunsuz çalışır durumda olduğunu doğrulayın.

3. video analiz hücre kader Paklitaksel karşılık olarak tanımlamak için

  1. Görüntülü hücreleri görüntüleme deneme ders boyunca sağlıklı olduğundan emin olun. Kontrol hücreleri DMSO ile tedavi uygun ve etkin bir şekilde Proliferasyona olmalıdır.
    Not: hücreleri sergi stres, belirtileri değil video quantitate ve bunun yerine görüntüleme koşulları48optimize odaklanmak. Belirtileri stres görüntüleme blebbing/ölen hücreleri, başaramamak-e doğru eklemek/plaka üzerinde yayılmış hücreler ve düşük Mitotik dizin ve/veya uzun süreli mitoz gösteren hücreler içerir. Stres olası kaynakları dalgalanmaları sıcaklık veya CO2 düzeyleri görüntüleme odası veya fototoksisite48içinde yer alıyor.
  2. Tüm bir görüş alanı X 10 ya da 20 X amacı ile görüntüleme, tek tek hücreleri yüzlerce mevcut olabilir. Bu nedenle, Nefelometri ile yardımcı olmak için görüş alanı daha küçük renkleri mevcut yazılım araçları kullanılarak bölün. Her çeyrek daire içindeki hücreleri (adımları 3.3.1–3.6.2 içinde açıklandığı gibi) ayrı ayrı puan.
  3. Video analiz, faz kontrast ve/veya floresan görüntüleri kullanarak birleştirilmiş görünümü her hücrede izleyebilirsiniz. Birleşmiş görünümü oluşturmak için yazılım analiz araçlarını kullanın.
    1. Videonun başında başlayan, bir tek Interphase hücre tanımlamak ve faz optik kullanarak hücre döngüsü boyunca ilerleme durumunu izlemek. Tek bir hücre izlemek için hücreyi göz tarafından kare kare gözlemlemek. Interphase hücreleri (Faz kontrast tarafından biçilen) olarak düzleştirilmiş onların morfolojisi ve DNA yoğunlaşma onların eksikliği nedeniyle (H2B-GFP tarafından değerlendirildi gibi) tanımlamak (şekil 1A).
  4. Mitoz hücre (Faz kontrast optik kullanarak) yuvarlama gözlem tarafından girin hücrelerini tanımlamak ve/veya Kromozom yoğunlaşma (H2B GFP kullanarak) (şekil 1A-C). Her iki hücre yuvarlama ve kromozom yoğunlaşma kolayca göz tarafından görüntülenmiştir.
    1. Hücrenin mitoz girdiği zaman zaman ek açıklama ekleyebilirsiniz. Kendi kaderine (anafaz adım 3.5, kimden adım 3.6.1 olduğu gibi mitoz hücre ölümü veya olduğu gibi adım 3.6.2 Mitotik kayma olduğu gibi) ulaşıncaya kadar hücre izleme devam edin.
  5. Kontrol hücreleri verimli kromozomlarını hizalayın ve anafaz 1 h (şekil 1 d) içinde girin. Hücre iki alanlarına veya görselleştirme H2B-GFP ile (şekil 1A) etiketli poleward hareketli kromozomların çimdik başlar gibi anafaz faz kontrast optik tarafından görselleştirin. Ne zaman hücre anafaz geçer zaman açıklama ekleyin.
  6. Buna karşılık, Paklitaksel ile tedavi hücreleri birkaç saat (3-40 h) (şekil 1B-D) ile yoğun kromozomlar yuvarlak kalır.
    1. Hücre ölümü tabi mitotically tutuklandı hücrelerini tanımlamak.
      Not: hücreler mitoz sırasında ölmek Faz kontrast mikroskobu tarafından görüntülenmiştir, hücre bleb gibi shrink ve/veya (şekil 1B) rüptürü. H2B GFP Imaging, kromozomlar da hücre ölümü sırasında parçası.
    2. Hücre kayma geçmesi mitotically tutuklandı hücrelerini tanımlamak.
      Not: onlar Interphase geri doğrulmak ve anafaz (şekil 1 c) gören olmadan kromozomlar decondense Mitotik kayma geçmesi hücreleri faz kontrast mikroskobu tarafından gözlenir. Mitotik kayma geçmesi hücreleri artış büyük tetraploid hücrelere bu vermek are sık sık multinucleated (şekil 1 c).
  7. Özgün alan bakış hücreleri izleme devam edin. Bir kez tüm bir görüş alanı izlenir, bir ayrı aynı de alınan görüş alanı için hareket ve hücreleri izleme devam edin.

4. Mitotik kaymalarını aşağıdaki hücre kaderini belirlemek için video çözümlemesi

  1. Mitotik kayma (3.6.2 adımda anlatıldığı gibi) aşağıdaki hücre kader değerlendirmek RPE-1 hücreleri FUCCI sistem ifade kullanarak. Faz kontrast görüntüleme ek olarak, bu kırmızı Floresans (G1 faz gösterge) ve yeşil floresan (S/G2/ /M gösterge) görüntüleri elde etmek gereklidir).
    1. 3.7 ile 3.3. adımda açıklandığı gibi FUCCI RPE-1 hücreleri izlemek.
      1. FUCCI sistem düzgün şekilde çalıştığını onaylamak için kontrol canlı hücre görüntüleme veri analizi uygun şekilde gelen kırmızı ve yeşil flüoresan proteinlerin alternatif ifade hücreleri doğrulayın. Kontrol hücreleri Interphase sırasında tamamen nükleer yeşil floresan hücreleri ilerleme olarak G1 ' den S aşamaya sergilenmesi için tamamen nükleer kırmızı Floresans sergilenmesi geçiş. Hücreler mitoz tamamlanması boyunca yeşil Floresans sergilenmesi devam etmelidir. Hemen mitoz, hücreleri bir kez daha Interphase sırasında tamamen kırmızı Floresans göstermelidir.
        Not: floresan izlemeler49kullanarak Tek Kişilik hücrelerde FUCCI sisteminden RFP ve GFP Floresans yoğunluklarını ölçmek için yöntemleri var iken, bu floresan renk değişikliği sağlam ve göz tarafından görünür olduğu gerekli değildir kez.
  2. Faz kontrast mikroskobu kullanılarak mitoz tutuklandı hücrelerini tanımlamak ve Mitotik kayma, geçmesi kadar 3.4 ve 3.6.2 bölümünde açıklandığı gibi görüyor. SLIP mitoz ve geri Interphase mitoz (şekil 2A- C) G1 aşamasında kırmızı Floresans için sırasında yeşil Floresans sergilenmesi değişecek hücreler.
    1. Bu faz kontrast ve epifluorescent görüntüleme kullanarak hücreleri hücre kaderlerini (2D rakam) değerlendirmek için göz tarafından kaydı izlemek.
      1. Hücre döngüsü yeniden girin hücrelerini tanımlamak. Bu hücreler kırmızı yeşil değişiklik Floresans ifadedeki G1/S geçiş (şekil 2A) gösterir FUCCI sistemini kullanarak tanımlanır.
      2. G1 hücre döngüsü tutuklama geçmesi hücrelerini tanımlamak. Bu hücreler için devam ederse kırmızı Floresans ifade tarafından tanımlanan > 24 h (şekil 2B).
      3. Interphase içinde ölmek hücrelerini tanımlamak. Bu hücreler hücre yırtılması/blebbing/faz kontrast görüntüleme (şekil 2C) kullanarak daralma tarafından tanımlanır.

5. nükleer zarf rüptürü sıklığını belirlemek için video çözümlemesi

  1. H2B GFP ve TDRFP-NLS ifade RPE-1 hücreleri nükleer zarf rüptürü değerlendirmek için kullanın. Faz kontrast görüntüleme ek olarak, kırmızı Floresans (TRITC) ve yeşil floresan (FITC) görüntüleri elde etmek. Görüntüleri her 5 dk rüptürü görselleştirmek için kazanmak.
    Not: Hangi TDRFP NLS verimli bir şekilde çekirdeği ile en az sitoplazmik Floresans alınır hücre satırlarını oluşturmak için önemlidir.
  2. Adım üzerinden 3,4 3,3 açıklandığı gibi görüntü hücre. TDRFP-NLS Floresans sinyal ve H2B GFP Interphase sırasında co yerelleştirmeniz. (Olarak görüntülenmeyecektir faz optik ve/veya Kromozom yoğunlaşma H2B GFP tarafından kullanarak yuvarlama hücre) mitoz nükleer zarf aşağı kıracak ve sitoplazmik (şekil 3A) TDRFP-NLS sinyal olacaktır. Mitoz, nükleer zarf kızı hücrelerde reform ve TDRFP-NLS sinyal nükleer olacak.
  3. Kızı hücreleri sonraki Interphase boyunca canlı hücre görüntüleme tarafından takip. Nükleer rüptürü olayları çevreleyen sitoplazma lokalize nükleer TDRFP-NLS geçici bir patlama gözlemleyerek tanımlayın. Dakika içinde nükleer zarf tamir ve TDRFP NLS çekirdeği (şekil 3A) relocalized.
    Not: Çoğu zaman, nükleer DNA H2B-GFP tarafından görüntülenmiştir gibi küçük bleb olarak rüptürü sitesi dışında çıkıntı için görülecektir.
  4. Rüptürü olay sırasında Interphase geçmesi çekirdek kısmını puan. Bu kesir puanı için yırtılması olayı Paletli hücreleri toplam sayısı üzerinden geçmesi hücreleri saydırmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, H2B GFP ifade RPE-1 hücreleri bir anti-Mitotik ya da araç denetimi ile (DMSO) değerlendirilmesi ve canlı hücre görüntüleme tarafından analiz. Analiz kontrol Mitotik RPE-1 hücreleri % 100'ünü anafaz 22 dk ortalama mitoz (şekil 1A, 1b) girdikten sonra başlatılan saptandı. Buna karşılık, Paklitaksel ile tedavi RPE-1 hücreleri süren birkaç saat (şekil 1 d) derin Mitoti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

En önemli bir özelliği, uzun vadeli yaşamak-hücre görüntüleme görüntüsü hücrelerin sağlığını garanti etmektedir. Bu hücreler sıcaklık, nem ve/veya CO2 düzeyleri ile ilgili standartların altında koşulları gibi çok az yabancı çevresel stres maruz esastır. Stres Imaging hücre davranış50etkilediği bilinmektedir olarak da floresan uyarma aydınlatma, üzerinden duyarlilik sınırlamak önemlidir. Duyarlilik sınırlama başka bir yerde48ayrıntılı olarak birden fazla şekilde e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

AFB, MAV ve NJG Ryan Quinton el yazması ve Adrian Salic TDRFP-NLS inşa etmek için yorum için teşekkür etmek istiyorum. AFB ve MAV NIGMS biyomoleküler Farmakoloji eğitim Grant 5T32GM008541 tarafından finanse edilmektedir. NJG Shamim ve Eşref Dahod meme kanseri araştırma laboratuvarları üyesidir ve NIH hibe GM117150 ve CA-154531, Karin Grunebaum Vakfı, Smith aile ödül programı, Searle akademisyenler Program ve Melanom araştırma tarafından desteklenmektedir İttifak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
fenol kırmızısı içermeyen, DMEM: F12 ortamıHiklonSH3027202
% 10 fetal sığır serumu (FBS)Gibco10438026
100 IU / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin.Gibco15070063
PBSGibco10010049
%0.25 Tripsin/EDTAİkizler50-753-3104
12 kuyulu cam tabanlı görüntüleme kabıCellvisP12-1.5H-N
RS036
Dimetil Sülfoksit (DMSO)SigmaNC0215085
Çevre ChamberIn Vivo Scientific
%5 CO2AirgasZ03NI7432000201
15 mL Konik TüplerFisherbrand05-539-12
10 cm polistiren doku kültürü plakalarıFalcon08772E
10 mL Tek Kullanımlık Serolojik PipetFisherbrand4488
5804R 15 amp SantrifüjEppendorf97007-370
1000 mikrolitre PipetGilsonPipetman Classic
20 mikrolitre PipetGilsonPipetman Classic
p1000 Pipet UçlarıSharpp1126
p20 Pipet UçlarıSharpP1121
RPE-1 HücreleriATCCCRL-4000
Kuluçka Makinesi Galaxy 170SEppendorfCO17011005
Pipet Boy Integra156401
HemasitometreFisher Scientific0267110
Canlı Hücre Görüntüleme için Nikon Ti-E-PFS Ters MikroskopMicro Video Instruments, Inc.
Önceki XY Sahne Sistemi ve Beyaz Işık LED AydınlatıcıMicro Video Instruments, Inc.500-H117P1N4
Önceki Proscan 3 Kontrol Cihazı XYZ, EnkoderliMicro Video Instruments, Inc.500-H31XYZE
Andor Dijital KameraMikro Video Aletleri A.Ş.D10NLC
Nikon NIS Elements AR YazılımıMikro Video Enstrümanları, Inc.
Micro Video Instruments, Inc.için SOLA LED AydınlatıcıSOLA-E
InVivo CO2 Akış Kontrollü Çevre OdasıMicro Video Instruments, Inc.Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Mükemmel Odak Motorlu Burunluk MikroVideo Aletleri A.Ş.
Ti-C Sistemi Kondenser TaretMikro Video Aletleri A.Ş.
Sistem Kondenser Taret için Ti-C LWD LWD Lens Ünitesi MikroVideo Aletleri, Inc.
Te-C LWD Ph1 ModülüMikro Video Aletleri A.Ş.
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mmMikro Video Aletleri, Inc.
CFI Süper Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objektif MikroVideo Aletleri, Inc.
Paklitaksel TSZ Kimya MEA53100MQS31000Floresan MEP59391MEL51000MEL56200MEH41100MRH10101MRH48230

Kaynaklar

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411(2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724(2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564(2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7 (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101(2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Paklitaksel TedavisiHücre Kaderi DeğerlendirmesiMitotik KaymaNükleer Zar RüptürüFUCCI SistemiH2B-GFP EtiketlemeFaz Kontrast MikroskopisiUzun Süreli GörüntülemeTek Hücre Analizi
Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.