İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Embriyonik anöploidi infertilite insanlarda önemli genetik nedenidir. Bu olayların çoğu kadın mayoz sırasında kaynaklanan ve olumlu maternal yaşla ilişkili olsa yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil. Bu nedenle, gen türevleri yanlış kromozom ayrımı oogenesis sırasında hesap. Verilen bu insan yumurta erişimi sınırlı araştırma amaçlı, deneyleri dizi insan gen işlevi mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak eğitim için geliştirilmiştir. İlk olarak, mesajcı RNA (mRNA), gene ve gene değişken faiz profaz-tutuklandı fare yumurta microinjected. İfade için zaman tanıyacaktır sonra yumurtalar zaman uyumlu olarak yayımlanan mayoz tamamlamak için segregasyonun olgunlaşma ben. MRNA floresan bir muhabir, yeşil flüoresan protein (Gfp) gibi bir dizi ile etiketleyerek insan proteini lokalizasyonu fenotipik değişiklikler ek olarak değerlendirilebilir. Örneğin, kazanç veya fonksiyon kaybı segregasyonun hataları düzeltmek için gen ürünü meydan deneysel koşullar kurarak soruşturma olmaktır. Bu sistem oogenesis sırasında insan proteini işlevi soruşturma avantajlı olsa da, yeterli yorumu sonuçları göz önüne alındığında bu protein ifade endojen düzeylerde değildir ve (çaldıYani için kontrol sürece yapılmalıdır dışarı veya aşağı), fare homologs da sistemde.
Giriş
Kısırlık üreme çağındaki 1hangi neredeyse tıbbi tedavi 2yarım saniyeden aramak, insan nüfusunun % 10-15 etkileyen bir durumdur. İnfertilite etiyolojisi farklı olmasına rağmen ve birçok durumda multifaktöriyel insanlarda en sık görülen genetik anormallik embriyonik anöploidi 3' tür. Anöploidi kromozom hücrede doğru sayıda sapması (kazancı veya kaybı) olarak tanımlanır. İnsan embriyosu anöploidi olgusu yaygındır ve ileri maternal yaş 4,5ile artar. Dört randomize kontrollü çalışmaların artan implantasyon oranları, düşük oranları daha düşük ve daha kısa bir süre için bu strateji sonuçlandı çünkü tek kromozom normal (euploid) embriyolar rahim transfer için seçme yararı sermiştir gebelik 6,7,8,9ulaşmak. Bu nedenle, insan anöploidi etyolojisinde anlama önemli etkileri yardımcı üreme olabilir.
Aneuploidies için ön-implantasyon genetik test kısırlık tedavi sonuçlarının karşılaştırılması yararlı olmakla birlikte, nasıl aneuploidies kaynaklanan kapsamlı bir anlayış hala eksik. Bu yaygın segregasyonun aneuploidies (gamet üretim sırasında kökenli) ve maternal yaş, ancak, onların belirli yaş 4için ortalama oranı sapma bazı kadınlar mevcut embriyonik anöploidi oranları pozitif bir korelasyon olduğu kabul edilir. Bu gibi durumlarda yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil öneririz. Diğer faktörler gen türevleri gibi embriyonik anöploidi riski artan bir rol oynayabilir.
Bir gen varyantı anöploidi potansiyel katkısını oosit mayoz sırasında araştıran bir anahtar hızla segregasyonun gen işlevini değerlendirmek için bir sistem tasarımı için yönüdür. Etik kısıtlamaları ve sınırlı erişim nedeniyle, insan yumurta kullanılarak bu deneyler yapmak zordur. Bu sorunları fare yumurta kullanarak atlatılabilmişlerdir, ve deneyleri mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için bir dizi ben burada açıklanan. Mesajcı RNA (mRNA) faiz gen türevi için kodlama microinjecting tarafından fare yumurta insan protein lokalizasyonu olabilir görüntülenir ve vahşi-türü ve mutasyona uğramış insan proteini Ektopik ifade herhangi içinde sonuçları belirlemek için kullanılan fenotipik değişiklikler anöploidi için neden olabilir. Bu protokolü kazanç ve fonksiyon kaybı araştırmak için kullanılabilir, bu fenotipleri bir artış için uygun olmayan kız kardeşimin kinetochore ve metafaz, kromozom hizalamasını mayoz ı. önemlisi desteklemek için yetersizlik iliştirdiği mikrotübüller içerir. oosit mayoz önemli olaylar gibi meydan okumak için belirli deneysel koşullar kurarak genetik varyantların bina ve kromozom hizalama 10iğ.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Moleküler klonlama
- Gen faiz ve plazmid vitro transkripsiyon (pIVT) vektör11tam uzunlukta kodlama dizisi elde edilir.
Not: Tam uzunlukta cDNA klonlar çeşitli satıcılardan ticari olarak kullanılabilir veya ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yolu ile oluşturulabilir. Dışavurumu sıra (EST) veritabanları öğesini ve biyoteknoloji bilgi (NCBI) online kaynak için Ulusal Merkezi transkript dizileri genler için nükleotit sağlar. Protein kolaylığı için görselleştirme ve analiz ifade düzeyleri, füzyon yeşil flüoresan protein (Gfp) veya başka bir uygun floresan etiket klonlama stratejisinde istenen. - Doğrulanmış bir klonlama strateji kullanarak, ilgi genin kodlama dizisi pIVT birden çok klonlama bölgesine ekleyebilirsiniz. Moleküler klonlama ayrıntılı bir açıklama ve gerekli adımları daha önce açıklanan 12olmuştur.
Not: bir gen-füzyon ürün oluşturulacak ise, klonlama uygun okuma çerçevesi içinde olduğundan emin olun. - Doğru gen ekleme, uygun çerçeve fusion ve hiçbir polimeraz kaynaklı nokta mutasyonlar oluşturulan emin olmak için globin primerler kullanılarak inşa etmek sıra.
Not: Sanger DNA sıralama ekipman kullanılabilir değilse, birçok şirket düşük maliyetli DNA Sıralama seçenekleri sunuyoruz. - DNA tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) veya ekleme/silme (INDELS) üreten varsa mutagenize. DNA mutagenesis adımları 1.5-1.7 açıklanmıştır. Vahşi-türü yapıları için Doğrusallaştırma adım 1.7 ile devam edin.
- Mutagenesis astar tasarım ve üreticinin iletişim kuralı başına mutant yapı oluşturmak için mutagenesis PCR reaksiyon tamamlayın. PCR-aracılı site yönettiği mutagenesis yukarıda açıklanan 13oldu. Ayrıca, birçok şirket iletişim kuralları içerir sitesi yönetmen mutagenesis kitleri teklif.
- Mutagenized DNA'sı bakteriyel konak dönüşümü. İzole ve plazmid arındırmak.
Not: Birçok şirket kolayca ayırmak ve plazmid DNA arındırmak için kullanılan kitleri olun. Üreticileri Protokolü buna göre izleyin. E. coligibi gram-negatif bakteri zorlanma kullanıyorsanız, endotoxins kaldırır bir kit kullanılması önerilir. - Bakteriyel transformants getirilmesi istenen SNP veya INDEL onaylamak için standart Sanger DNA sıralama kullanarak izole DNA'dan sıra.
- Son ürünler tek restriksiyon enzimi sindirim saf DNA kullanarak linearize.
Not: PIVT vektör birden çok tek-enzim Addgene 14plazmid haritada listelenen siteler kesmek içerir. - Ürün özel Jel Elektroforez ile doğrusal olduğundan emin olun. Özel Jel Elektroforez yöntemi önceden tanımlanmış 14oldu.
Not: tüm kalan adımları için kararlı, yüksek kaliteli RNA üretimini sağlamak için bariyer (filtre) damlalıklı ipuçları ve RNase içermeyen malzemeler kullanın. - Doğrulanmış bir DNA temizlik Protokolü veya kit kullanılarak sindirilir ürün arındırmak ve 30 µL RNase/Dnaz-Alerjik suda elute.
Not: silikat-matrix spin sütunlara göre kitleri için yüksek kaliteli, tavsiye edilir saf DNA. Üreticileri Protokolü buna göre izleyin. - Vitro T7 polimeraz üreticinin protokol sonrası kullanarak DNA uyarlamak.
- Arındırmak ve RNA RNase/Dnaz ücretsiz su üreticinin protokol sonrası bir silikat-matrix spin sütunlara göre nükleik asit arıtma kit kullanarak 30 µL içinde elute.
- Denaturing özel Jel Elektroforez son RNA ürün boyutu onaylamak için formaldehit kullanarak gerçekleştirin. 14aşağıdaki adımları 1,13-1.22 bakın. (Şekil 1).
- Jel 72 ml 1 g özel Isıtma tarafından eriyene kadar su hazırlamak, sonra 60 ° C'ye serin
- 10 X 0.4 M BEZLERİ (pH 7,0), 0.1 M sodyum asetat ve 0.01 M EDTA ekleyerek tampon çalıştıran MOPS hazırlayın.
- 10 mL 10 X MOPS tampon ve % 37 formaldehit (12,3 M) 18 mL soğutmalı özel çözüm çalışan ekleyin.
- Kast özel çözüm bir jel şekillendirme konteyner içine dökme tarafından jel. 10 µL kapsayacak kadar geniş bir tarak kullanın. Jel belirledi ve dokunmak için sert olması sonra yavaşça tarak kaldırın.
- Jel Elektroforez tank montajı ve yeterli 1 X arabellek, çalışan jel tamamen kaplıdır sağlanması MOPS ekleyin.
- RNA örnek formaldehit içeren yükleme boya 0.5 X birimlerine RNA'ın 1 µg ekleyerek hazırlayın.
- Etidyum bromür 10 µg/mL bir konsantrasyon RNA çözüm ekleyin.
- RNA örnek çözümü 5 min için 70 ° C'de denatüre.
- Steril kullanarak 10 µL filtre ipuçları, molekül ağırlığı işaretleyicinin 5 µL yük ve RNA'ın 5 µL jel ayrı kuyu sample(s) ve boya jel uzunluğu en az üçte göç kadar 5 V/cm electrophorese.
- Bir UV trans ışığı üzerinde jel RNA görselleştirin. RNA moleküler ağırlık işaretçiyi karşılaştırarak doğru boyutu olduğundan emin olun.
- Konsantrasyon ve RNA saflığı ölçmek için steril 10 µL filtre ipuçları UV Spektrofotometre üzerine kullanarak arıtılmış RNA'ın 1.2 µL aktarın.
Not yüksek kaliteli RNA A260/280 (1.8-2.2) ve 260/230 Absorbans oranları olmalıdır (> 1,7) anılan sıraya göre. - 10 µL filtre ipuçları, aliquot kalan saf RNA steril 0.5 µL santrifüj tüpler içine (3-5 µL/tüp) kullanarak. Mikroenjeksiyon için hazır kadar tüpler-80 ° C'de depolayın.
Not: 500 ng/µL son enjeksiyon yoğunlukta bir en iyi başlangıç noktasıdır. Bu RNA 1: 2'RNase H20 RNA yapışkanlık mikroenjeksiyon pipet içinde azaltmak için mikroenjeksiyon öncesinde ücretsiz sulandırmak için tavsiye edilir.
2. kinetochore-Mikrotubul ek tahlil
- Yumurtalar mikroenjeksiyon için eşit gruplara bölün.
Not: Yumurta toplama, transfer, mikroenjeksiyon ve segregasyonun olgunlaşma tarif edilmiştir ayrıntılı olarak Jüpiter daha önce 15. - Deneysel mRNA içeren bir grup ve diğer grup WT denetim ve PBS veya Gfp ile microinject mRNA.
Not: 500 ng/µL 10ile başlamak için önerilen enjeksiyon bölgedir. Bir picoinjector enjeksiyon tutarları kontrol etmek için kullanılabilir. 5-10 pL bir enjeksiyon hacmi 15önerilir. - Bir yumurta (100-150 µm), transfer yumurta içine bir kültür ortamında milrinon içermeyen bir petri 100 µL damla çapı daha büyük embriyo kalitesi madeni yağ kaplı bir el ya da ağız nerede cam pipet açılış işletilen pipetting aparatı biraz olduğunu kullanarak ve yumurta yeterli olgunlaşma mayoz metafaz için izin vermek için %5 C02 37 ° C'de 7 h için kuluçkaya ben (Met) 15.
- Yukarıdaki gibi aynı pipet cihazları kullanarak kuluçka sonra yumurta önceden soğutulmuş minimum temel medya (MEM) koleksiyon orta iyi Center'da 700 µL ve 500 µL H20 dış halkası içeren bir merkezi-şey organ kültür çanak içine aktarmak ve 7 dakika buzda çanak yerleştirin.
Not: Önceden MEM medya soğuk ve de organ kültür yemekleri için en az 20 dk önce yumurta tedavisinde-20 ° C'de ortalamak için önerilir. - Yumurta % 2 paraformaldehyde 1 X PBS için oda sıcaklığında 20 dk içinde 400 µL içeren bir açık cam spot kalıbının kuyuya pipet cihazları kullanarak aktararak düzeltmek.
- Kullanarak pipet aparatı, yumurta başka bir kuyunun içine 400 µL engelleme çözüm (PBS + % 0,3 BSA + % 0,01 ara-20 + %0,02 NaN3) ve mağaza içeren spot bir tabağa aktarın. immunostaining için işlemek için hazır kadar 4 ° C'de.
Not: 4 ° c, cam spot plaka buharlaşma önlemek için parafilm ile yumurtalar depolamak için. - Aynı pipet cihazları kullanarak, bir yerde yeni bir kuyu için transfer yumurta içeren 400 µL permeabilization çözüm (PBS % 0,3 BSA + %0.1 TritonX-100 + %0,02 NaN3) plaka ve oda sıcaklığında 20 dakika süreyle üç üzerinden hızlı bir şekilde Transfer yumurtalar kuluçkaya 400 µL damla herhangi bir kalıntı deterjan kaldırmak için çözüm engelleme.
Not: Bir 9-şey açık cam spot tabak iyi grupları birden fazla tedavi ile tek bir yemek (Adım 2.4-2.5) üzerinde hareket etmek için çalışır. - Kalan immunocytochemistry yordamları bir oksijen odasında ışık oda sıcaklığında korunan gerçekleştirmek. Kullanım bir orta ölçekli plastik konteyner nemli kağıt havlu ve alüminyum folyo ile kapatın ile kaplı.
- Pipet cihazları kullanarak, yumurtalar için 30 µL transfer çözüm bir 96-şey plaka ve oksijen Odası 10 dk içinde yer kapağındaki engelleme.
Not: Damla plaka üzerinde dairesel boynundaki yerleştirilir. - Sentromerler ve Milli, pipet cihazları kullanarak etiket, yumurtalar için 30 µL transfer için anti-centromeric antijen (ACA, Crest) içeren çözüm engelleme (1:30) ve anti-acetylated tübülin (1: 1000) ve en az 1 h için kuluçkaya.
- Yumurtalar üç 30 µL damla 10 min için çözüm engelleme yoluyla aktararak durulayın.
- Pipet cihazları, transfer yumurta kullanarak için 30 µL engelleme çözüm ikincil antikorlar (Anti-insan IgG 1: 200, Anti-fare IgG 1: 200) kullanılan antikor için ücretsiz içeren bırakın ve 1 h için kuluçkaya.
- 3, 10 dk 30 µL durulama adımlarını yineleyin 2.11. adımda açıklandığı gibi çözüm engelleme.
- Pipet cihazları, 3-5 µL orta içeren DAPI montaj kullanarak yumurta transferi (5.9 µg/µL) cam mikroskop Slayt üzerindeki.
- Vazelin 4 küçük damla (bir PIN kafa boyutunu) Yumurta kırma önlemek için kapak Not köşelerinde yer.
- Yavaşça kapak notu vazelin yan slayt yerleştirin.
- Mühür kenarları ile tırnak cilası temizlemek ve 5 min için kurumasını alışverişi coverslip.
- Slaytları işleme confocal mikroskobu ile kadar gelen ışık, korumalı 4 ° C'de depolayın.
Not: montaj orta ve coverslip, maç Kırılma indisi kullanılmaktadır belgili tanımlık mikroskop objektif olun. Önerilen montaj malzemeleri daha önce olmuştur 15nitelendirdi. - Görüntü 40-63 x amaç küçük adımlar yakalama confocal mikroskobunun kullanarak yumurta (≤ 1 µm) z-uçak, optimize edilmiş çalışma amaç ve görüntü metafaz iğ tüm bölge için.
Not: 2.11 adımda kullanılan belirli ikincil antikorlar temel alan tüm 3 kanal görüntü emin olun. ≥ 4 ve zoom 3 ortalama görüntü için yeterli çözünürlük idealdir. 1 µm adım boyu mikrotübüller ve fare yumurta kinetochores açık görselleştirme sağlar. Yordamı fotoðraf çekmek için mikroskop mikroskop değişir. Lütfen nasıl mikroskop ayarlarını yapılandırmak için belirli adımlar için üreticileri confocal kullanıcı kılavuzuna bakın. - Aşağıdaki adımları 2.21 2,23 takip düşsel bilgisayar yazılımı kullanarak kinetochore-Mikrotubul eki durumunu tanımlar.
Not: Aşağıdaki adımlar, görüntü J (NIH) ücretsiz indirilebilir yazılım kullanarak bu yordamı açıklar, ancak, diğer düşsel bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış. Ek durum türleri daha önce olmuştur 16 tanımlı. - Dosya resim J araç çubuğuna sürükleyerek resmi aç.
- Açılan z-serisi, tüm kanallar görünür (DNA, kinetochore ve spindle) "renk" alt sekmesi altında "kanalları Birleştir", "görüntü" açılır menüsünde bulunan tıklayarak yapmak.
- Geçişi görüntü altındaki kullanarak, her z dilimli taşımak ve kinetochore Mikrotubul eki belirler. 16 ayrıntılı ek açıklamaları daha önce olmuştur açıklanan
3. kromozom hizalama Challenge tahlil
- Pipet aparatı 2.3. adımda açıklandığı gibi kullanarak, aktarım milrinon ücretsiz kültür orta petrol altında bir 100 µL damla içine yumurta ve yumurta yeterli olgunlaşma mayoz metafaz için izin vermek 7 h için kuluçkaya ben (Met) daha önce 2,3 17. adımda açıklandığı gibi .
Not: Oosit toplanması, mikroenjeksiyon ve olgunlaşma yordamlar özetlenen daha önce 15. Ek tahlil Protokolü adım 2.1-2.2 denetimleri ve RNA mikroenjeksiyon konsantrasyonları bakın. - Aynı pipet cihazları kullanarak, Merkezi-şey organ kültürüne transfer yumurta içeren 700 µL Kültür Merkezi iyi ve 400 µL H20 çevreleyen halka monastrol [100 µM] içeren orta çanağı ve 37 ° c 2 h için kuluçkaya.
- Yumurtalar, pipet aparatı olarak yukarıda, 100 µL CZB kültür orta, üç damla aracılığıyla kullanarak aktarma tarafından monastrol dışarı durulama ve yumurta içeren 700 µL kültür orta + MG132 yeni bir merkezi-şey organ kültür çanak transfer [5 mikron] Merkezi 3 h için yüzüğü. 400 µL H20 dış halka ekleyin.
- Yumurtalar, PBS içinde oda sıcaklığında 20 dakika için 400 µL % 2 paraformaldehyde içeren bir açık cam spot kalıbının kuyuya pipet cihazları kullanılarak aktarım tarafından tamir.
- Fiksasyon sonra yumurta transferi, pipet cihazları, şeffaf cam spot plaka 400 µL içeren yeni bir kuyunun içine kullanarak engelleme çözüm ve mağaza kadar 4 ° C'de işleme için immunostaining.
Not: 4 ° c, cam spot plaka buharlaşma önlemek için parafilm ile yumurtalar depolamak için. - Permeabilize ve yumurta immunocytochemistry via 2.6-2.16 adımlarda açıklandığı gibi etiket.
- Görüntü yakalama, 40-63 x amaç üzerinde confocal mikroskop kullanarak yumurta < 1 µm adım z-uçak metafaz iğ tüm bölge görüntü emin olmak istedim.
- Durum kromozom hizalamasını belirlemek için görüntüleme yazılımı kullanarak görüntü dosyaları açın.
Not: Aşağıdaki adımlar, görüntü J (NIH) ücretsiz indirilebilir yazılım kullanarak bu yordamı açıklar, ancak, diğer düşsel bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış. - Görüntü resmi J kontrol paneline sürükleyin.
- Açılan z-serisi, nokta aracını (görüntü J kontrol çubuğu noktası aracı simgesini tıklatarak bulunur) kullanın aracı görüntüdeki Milli direk üzerine yerleştirip resmine tıklayarak onların anılan sıraya göre z-dilim her işmili kutbunda sonunda Puan işaretlemek için. Bu noktalar, Command + t klavye tuşlarına basarak faiz (ROI) Yöneticisi bölgesine ekleyin.
- Her adım 3.10 ROI Yöneticisi'nde belirli nokta vurgulama ve ölçü birimi düğmesini tıklatarak ayarlama pozisyonlar için belirli koordinatları belirleyin. Bu bir sonuçları sağlayacaktır tabloyu içeren x ve y koordinatlarını her noktası için. Bunlar sırasıyla X1, Y1 ve X1, Y2, Puan olacaktır.
- Daha sonra gerçek Z Koordinat belirleyin. Bu hangi Milli direk tespit z yığınındaki belirli z-dilim dilim sayısı çarpılarak yapılır (Yani dilim #2 / 6) bireysel her noktası yığının kalınlığı (Yani 1 µm) tarafından olan (örnek: 2 x 1 µm dilim = 2). Bunlar sırasıyla Z1 ve Z2 noktalarında olacak.
- Pisagor teoremi denklemi kullanarak iğ uzunluğunu belirleyin (2 + b2 = c2) önceden tanımlanmış kullanarak x, y ve z koordinatları adımlardan 3.11-3.13. Son uzunluğu her mil için eşittir:
√((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - İğ midzone belirler. Bu yarım mil uzunluğu hesaplanır. Çizgi aracı görüntü J kullanarak, görüntü J araç çubuğunda çizgi simgesini tıklatarak bir Milli Kutbu'ndan iğ midzone olduğunu bir çizgi çizin. Uzunluğu görüntü J araç çubuğunda görüntülenir.
- Kromozom hizalama durum satırı ölçüm aracını kullanma iğ midzone kromozom Uzaktan değerlendirilmesi tarafından belirler. Görüntü J araç çubuğunda çizgi simgesini tıklatarak Çizgi aracını kullanarak, bir çizgi için kromozom iğ midzone çizin. Uzunluğu görüntü J araç çubuğunda görüntülenir. Kromozomlar iğ midzone üzerinden 4 µm den büyük hizalanmamış 18olarak kabul edilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Vitro sonra transkripsiyon kaliteli RNA (1.8-2.2) A260/A280 oranını ve ne zaman bir Spektrofotometre kullanarak ölçülen bir A260/A230 oranı ≥1.7 olacak. Şekil 1 ' deki resmi vitrogeçiş gösterir-RNA üzerinde denaturing bir özel Jel Elektroforez sonra üretilen. Desen veya çoklu boy bands sahip bir örnek bulaşmış bir grup kirlenme veya bozulması örnek gösterebilir. Alternatif olarak, birden çok grup mRNA değil tamamen denatüre veya başlangıç pl...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hastalığı ile ilişkili insan genetik varyantların hızlı ve artan tanımlaması yüzünden sistemleri biyolojik bunların önemini değerlendirmek için kurulan esastır. İnsan mayoz pozlar özel sorunlar işlevinde protein insan yumurta değerli ve nadir ve insan sperm genetik manipülasyon mükellef değildir çünkü anlama. Fare yumurta insan segregasyonun gen işlev 10,23değerlendirmek için değerli bir memeli modeli sistemi vardır. Bu model nasıl genetik varyantların anlamak iç...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser bir araştırma bursu American Society üreme tıbbı ve Charles ve Rutgers Johanna Busch Memorial Fonu tarafından desteklenen, State Üniversitesi, NJ K.S. A.L.N. için bir hibe N.I.H. (F31 HD0989597) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tüpü | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Merdiveni | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Merdiveni | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA yükleme Boyası | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9 oyuklu cam spot plaka | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agaroz | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Sığır serumundan elde edilen albümin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 konjuge anti-fare IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 seyreltme |
| Alexa-fluor-633 konjuge anti-insan IgG Thermo | Scientific | A21091 | 1:200 seyreltme |
| Ampisilin | VWR | AA0356 | |
| Titreşim önleyici tablo | Teknik İmalat A.Ş. | herhangi bir standart model | |
| Anti-asetillenmiş Tubulin antikor | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-sentromerik (CREST) antikor | Antikorlar Birleştirilmiş | 15-234 | 1:30 seyreltme |
| Bariyer (Filtre) Pipet uçları | Thermo Scientific | AM12635 | Pipetatör markanızla uyumlu olduğundan emin olun. Bunlar Eppendorf marka pipetörlerle uyumludur. |
| BD Difco Susuz Kültür Ortamı: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Susuz Kültür Ortamı: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Kılcal boru | Sutter | B100-75-10 | |
| Merkez Kuyu organ kültürü kabı | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tankı | İnkübatör için | ||
| Konfokal mikroskop | Zeiss | herhangi bir standart model | |
| Santrifüj (Soğutma kabiliyeti ile) | Thomas Scientific | herhangi bir standart model | |
| Kapak Camı 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Lameller | Thomas Scientific | 6663-F10 | kalınlığı belirli mikroskoplar için değişecektir |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Yaşam Teknolojileri | AM9922 | |
| Dijital Kuru Banyo | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high DNA klonlama için sadakat klonlama enzimi | Agilent | 600400 | |
| , New England, Biolabs | NdeI veya KasI'yi | doğrusallaştırmak için enzimler | |
| Etidiyum, Bromür | Termo Bilimsel | 155585011 | |
| Floresan Mikroskop | Herhangi bir Floresan mikroskobu kullanılabilir | ||
| Formaldehit (%37) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehit RNA yükleme boyası | Ambion | 8552 | |
| Buzlu Mikroskop Slaytları (Şarjsız) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Tam Boy cDNA Klonları | Açık okuma sağlayan herhangi bir satıcıdan temin edilebilir çerçeve klonları | ||
| Jel elektroforez aparatı | Bio-Rad | herhangi bir standart model | |
| Cam Pastör Pipetleri | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| pIVT Yapısı için Globin İleri Astar | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Özel oligonükleotidler üreten herhangi bir şirketten satın alınabilir | ||
| pIVT Construct | - ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Özel oligonükleotidler üreten herhangi bir şirketten satın alınabilir | ||
| Pipetleri tutan | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Nemlendirilmiş Oda | Tupperware kullanılabilir | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR boncukları | GE Yaşam Bilimleri | 27925901 | |
| CO2 ve su ceketli teknolojiye sahip herhangi bir standart model | |||
| Ters Mikroskop | Nikon cihazları | Herhangi bir Standart model | |
| Görüntü J (NIH) Yazılımı | NIH | Görüntü Analiz yazılımı | |
| 96 kuyulu plakanın kapağı | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Düşük Yapışma 0.5 mL mikrosantrifüj tüpü | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Dizi analiz yazılımı | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mikroskop slaytları | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Milenyum RNA Belirteçleri-Formaldehit | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | 2.5mM'de DMSO'da Yeniden |
| Askıya Alma Mineral Yağ | Sigma-Aldrich | M5310 | Yalnızca embriyo tarafından test edilmiş, steril filtrelenmiş |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | 100 mM Ağızlıkta DMSO'da Yeniden Askıya Alın |
| Biodiseno | MP-001-Y | ||
| N2 tankı | titreşim önleyici masa | ||
| için Oje; Temizle | Herhangi bir şeffaf oje kullanılabilir | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spektrofotometre | Thermo Scientific | herhangi bir standart model | |
| NorthernMax 10X Denatüre Edici Jel Tampon | Yaşam Teknolojileri | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Çalışan tampon | Yaşam Teknolojileri | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Çalışan tampon | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Kültürü Kabı 60x15mm | Yaşam Teknolojileri | 08-772-12 | |
| Paraformaldehit | Polysciences, Inc. | ||
| PCR Termal Döngüleyici | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Kabı 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri kabı 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Kabı 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Dijital Mikroenjektör | herhangi bir standart model | |
| Pipet çektirme | Alevli-Kahverengi Mikropipet çektirme | Model P-1000 | |
| pIVT plazmit | AddGene | 32374 | Oosit ekspresyonu için uygun boş vektör. |
| Hamile Kısrak Serumu Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kiti | Qiagen | 27104 | 20 uL'ye kadar plazmid DNA saflaştırılması |
| QIAquick PCR saflaştırma kiti | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II siteye yönelik mutajenez kiti | Agilent | 200523 | Eklemeler ve Silmeler için Mutajenez Kiti |
| Quikchange Yıldırım Çok Bölgeli Yönlendirilmiş Mutajenez Kiti | Agilent | Tek | bölge değişiklikleri için 210512 mutajenez kiti |
| Makas (İnce nokta) | Güzel bilim aletleri | 14393 | |
| Makas (Orta nokta) | İnce bilim aletleri | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slayt Isıtıcı | herhangi bir standart model | ||
| Spektrofotometre (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomikroskop | herhangi bir standart model | ||
| Alt Klonlama Verimliliği DH5a Yetkin Hücreler | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Şırınga | BD Bioscienes | 309623 1 ml, 27G (1/2) | |
| T4 DNA Ligaz | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Makinesi yüksek verim kapaklı RNA transkripsiyon kiti | Yaşam Teknolojileri | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Cımbız (İnce nokta - Boyut 5) | İnce bilim araçları | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnaz İçermeyen Damıtılmış Su | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Etidyum Bromür 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/Beyaz lite transilluminatör | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Montaj Ortamı | Vektör Laboratuvarları | H-1000 |
Kaynaklar
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24(2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
