İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Embriyonik anöploidi infertilite insanlarda önemli genetik nedenidir. Bu olayların çoğu kadın mayoz sırasında kaynaklanan ve olumlu maternal yaşla ilişkili olsa yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil. Bu nedenle, gen türevleri yanlış kromozom ayrımı oogenesis sırasında hesap. Verilen bu insan yumurta erişimi sınırlı araştırma amaçlı, deneyleri dizi insan gen işlevi mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak eğitim için geliştirilmiştir. İlk olarak, mesajcı RNA (mRNA), gene ve gene değişken faiz profaz-tutuklandı fare yumurta microinjected. İfade için zaman tanıyacaktır sonra yumurtalar zaman uyumlu olarak yayımlanan mayoz tamamlamak için segregasyonun olgunlaşma ben. MRNA floresan bir muhabir, yeşil flüoresan protein (Gfp) gibi bir dizi ile etiketleyerek insan proteini lokalizasyonu fenotipik değişiklikler ek olarak değerlendirilebilir. Örneğin, kazanç veya fonksiyon kaybı segregasyonun hataları düzeltmek için gen ürünü meydan deneysel koşullar kurarak soruşturma olmaktır. Bu sistem oogenesis sırasında insan proteini işlevi soruşturma avantajlı olsa da, yeterli yorumu sonuçları göz önüne alındığında bu protein ifade endojen düzeylerde değildir ve (çaldıYani için kontrol sürece yapılmalıdır dışarı veya aşağı), fare homologs da sistemde.
Giriş
Kısırlık üreme çağındaki 1hangi neredeyse tıbbi tedavi 2yarım saniyeden aramak, insan nüfusunun % 10-15 etkileyen bir durumdur. İnfertilite etiyolojisi farklı olmasına rağmen ve birçok durumda multifaktöriyel insanlarda en sık görülen genetik anormallik embriyonik anöploidi 3' tür. Anöploidi kromozom hücrede doğru sayıda sapması (kazancı veya kaybı) olarak tanımlanır. İnsan embriyosu anöploidi olgusu yaygındır ve ileri maternal yaş 4,5ile artar. Dört randomize kontrollü çalışmaların artan implantasyon oranları, düşük oranları daha düşük ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Moleküler klonlama
- Gen faiz ve plazmid vitro transkripsiyon (pIVT) vektör11tam uzunlukta kodlama dizisi elde edilir.
Not: Tam uzunlukta cDNA klonlar çeşitli satıcılardan ticari olarak kullanılabilir veya ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yolu ile oluşturulabilir. Dışavurumu sıra (EST) veritabanları öğesini ve biyoteknoloji bilgi (NCBI) online kaynak için Ulusal Merkezi transkript dizileri genler için nükleotit sağlar. Protein kolaylığı için görselleştirme ve analiz ifade düzeyleri, füzyon yeşil flüoresan protein (Gfp) veya başka bir uygun floresan etiket klonlama stratejisinde istenen.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Vitro sonra transkripsiyon kaliteli RNA (1.8-2.2) A260/A280 oranını ve ne zaman bir Spektrofotometre kullanarak ölçülen bir A260/A230 oranı ≥1.7 olacak. Şekil 1 ' deki resmi vitrogeçiş gösterir-RNA üzerinde denaturing bir özel Jel Elektroforez sonra üretilen. Desen veya çoklu boy bands sahip bir örnek bulaşmış bir grup kirlenme veya bozulması örnek gösterebilir. Alternatif olarak, birden çok grup mRNA değil tamamen denatüre veya başlangıç pl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hastalığı ile ilişkili insan genetik varyantların hızlı ve artan tanımlaması yüzünden sistemleri biyolojik bunların önemini değerlendirmek için kurulan esastır. İnsan mayoz pozlar özel sorunlar işlevinde protein insan yumurta değerli ve nadir ve insan sperm genetik manipülasyon mükellef değildir çünkü anlama. Fare yumurta insan segregasyonun gen işlev 10,23değerlendirmek için değerli bir memeli modeli sistemi vardır. Bu model nasıl genetik varyantların anlamak iç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser bir araştırma bursu American Society üreme tıbbı ve Charles ve Rutgers Johanna Busch Memorial Fonu tarafından desteklenen, State Üniversitesi, NJ K.S. A.L.N. için bir hibe N.I.H. (F31 HD0989597) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tüpü | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Merdiveni | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Merdiveni | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA yükleme Boyası | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9 oyuklu cam spot plaka | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agaroz | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Sığır serumundan elde edilen albümin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 konjuge anti-fare IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 seyreltme |
| Alexa-fluor-633 konjuge anti-insan IgG Thermo | Scientific | A21091 | 1:200 seyreltme |
| Ampisilin | VWR | AA0356 | |
| Titreşim önleyici tablo | Teknik İmalat A.Ş. | herhangi bir standart model | |
| Anti-asetillenmiş Tubulin antikor | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-sentromerik (CREST) antikor | Antikorlar Birleştirilmiş | 15-234 | 1:30 seyreltme |
| Bariyer (Filtre) Pipet uçları | Thermo Scientific | AM12635 | Pipetatör markanızla uyumlu olduğundan emin olun. Bunlar Eppendorf marka pipetörlerle uyumludur. |
| BD Difco Susuz Kültür Ortamı: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Susuz Kültür Ortamı: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Kılcal boru | Sutter | B100-75-10 | |
| Merkez Kuyu organ kültürü kabı | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tankı | İnkübatör için | ||
| Konfokal mikroskop | Zeiss | herhangi bir standart model | |
| Santrifüj (Soğutma kabiliyeti ile) | Thomas Scientific | herhangi bir standart model | |
| Kapak Camı 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Lameller | Thomas Scientific | 6663-F10 | kalınlığı belirli mikroskoplar için değişecektir |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Yaşam Teknolojileri | AM9922 | |
| Dijital Kuru Banyo | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high DNA klonlama için sadakat klonlama enzimi | Agilent | 600400 | |
| , New England, Biolabs | NdeI veya KasI'yi | doğrusallaştırmak için enzimler | |
| Etidiyum, Bromür | Termo Bilimsel | 155585011 | |
| Floresan Mikroskop | Herhangi bir Floresan mikroskobu kullanılabilir | ||
| Formaldehit (%37) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehit RNA yükleme boyası | Ambion | 8552 | |
| Buzlu Mikroskop Slaytları (Şarjsız) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Tam Boy cDNA Klonları | Açık okuma sağlayan herhangi bir satıcıdan temin edilebilir çerçeve klonları | ||
| Jel elektroforez aparatı | Bio-Rad | herhangi bir standart model | |
| Cam Pastör Pipetleri | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| pIVT Yapısı için Globin İleri Astar | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Özel oligonükleotidler üreten herhangi bir şirketten satın alınabilir | ||
| pIVT Construct | - ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Özel oligonükleotidler üreten herhangi bir şirketten satın alınabilir | ||
| Pipetleri tutan | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Nemlendirilmiş Oda | Tupperware kullanılabilir | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR boncukları | GE Yaşam Bilimleri | 27925901 | |
| CO2 ve su ceketli teknolojiye sahip herhangi bir standart model | |||
| Ters Mikroskop | Nikon cihazları | Herhangi bir Standart model | |
| Görüntü J (NIH) Yazılımı | NIH | Görüntü Analiz yazılımı | |
| 96 kuyulu plakanın kapağı | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Düşük Yapışma 0.5 mL mikrosantrifüj tüpü | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Dizi analiz yazılımı | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mikroskop slaytları | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Milenyum RNA Belirteçleri-Formaldehit | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | 2.5mM'de DMSO'da Yeniden |
| Askıya Alma Mineral Yağ | Sigma-Aldrich | M5310 | Yalnızca embriyo tarafından test edilmiş, steril filtrelenmiş |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | 100 mM Ağızlıkta DMSO'da Yeniden Askıya Alın |
| Biodiseno | MP-001-Y | ||
| N2 tankı | titreşim önleyici masa | ||
| için Oje; Temizle | Herhangi bir şeffaf oje kullanılabilir | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spektrofotometre | Thermo Scientific | herhangi bir standart model | |
| NorthernMax 10X Denatüre Edici Jel Tampon | Yaşam Teknolojileri | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Çalışan tampon | Yaşam Teknolojileri | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Çalışan tampon | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Kültürü Kabı 60x15mm | Yaşam Teknolojileri | 08-772-12 | |
| Paraformaldehit | Polysciences, Inc. | ||
| PCR Termal Döngüleyici | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Kabı 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri kabı 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Kabı 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Dijital Mikroenjektör | herhangi bir standart model | |
| Pipet çektirme | Alevli-Kahverengi Mikropipet çektirme | Model P-1000 | |
| pIVT plazmit | AddGene | 32374 | Oosit ekspresyonu için uygun boş vektör. |
| Hamile Kısrak Serumu Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kiti | Qiagen | 27104 | 20 uL'ye kadar plazmid DNA saflaştırılması |
| QIAquick PCR saflaştırma kiti | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II siteye yönelik mutajenez kiti | Agilent | 200523 | Eklemeler ve Silmeler için Mutajenez Kiti |
| Quikchange Yıldırım Çok Bölgeli Yönlendirilmiş Mutajenez Kiti | Agilent | Tek | bölge değişiklikleri için 210512 mutajenez kiti |
| Makas (İnce nokta) | Güzel bilim aletleri | 14393 | |
| Makas (Orta nokta) | İnce bilim aletleri | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slayt Isıtıcı | herhangi bir standart model | ||
| Spektrofotometre (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomikroskop | herhangi bir standart model | ||
| Alt Klonlama Verimliliği DH5a Yetkin Hücreler | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Şırınga | BD Bioscienes | 309623 1 ml, 27G (1/2) | |
| T4 DNA Ligaz | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Makinesi yüksek verim kapaklı RNA transkripsiyon kiti | Yaşam Teknolojileri | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Cımbız (İnce nokta - Boyut 5) | İnce bilim araçları | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnaz İçermeyen Damıtılmış Su | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Etidyum Bromür 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/Beyaz lite transilluminatör | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Montaj Ortamı | Vektör Laboratuvarları | H-1000 |
Kaynaklar
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
