Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

12.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57460

⸱

9 Ekim 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Crown Bioscience Inc., 2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Fare orthotopic PDAC homografts immunophenotyping deneysel ameliyat tümör IMMUNO-microenvironment profil oluşturma amaçlamaktadır. Tümör ameliyat ile implante orthotopically vardır. Tümör boyutu 200-600 mm3 hasat ve tek hücreli süspansiyonlar, çok bağışıklık marker FACS analizi farklı fluorescently etiketli antikorlar tarafından takip hazırlamak için ayrışmış.

Özet

Homogref (syngeneic) tümör beygir bugünün IMMUNO-Onkoloji (g/ç) preklinik araştırma vardır. Tümör microenvironment (TME), özellikle bağışıklık-bileşenleri, teşhis ve tedavi sonuçları, özellikle de immünoterapi tahmini için hayati önem taşımaktadır. TME bağışıklık-bileşenleri farklı bağışıklık hücreleri değerlendirilebilir tümör infiltre kümelerine çok renkli FACS tarafından oluşur. Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) iyi tedavi seçenekleri, böylece bir acil ve karşılanmayan tıbbi ihtiyaç eksik en ölümcül malignances arasında olduğunu. Sigara-yanıt verdiğini çeşitli terapiler (kemoterapi hedef,-, I/O) için bir önemli nedeni onun bol TME, fibroblastlar ve bu tedaviler tümör hücreleri korumak lökosit oluşan olmuştur. İmplante PDAC için daha doğru bir şekilde inanılır Orthotopically TME insan pankreas kanserlerinin daha geleneksel cilt altı (SC) modelleri yeniden ele geçirmek.

Homogref tümörler (KPC) çoğu fare spontan PDAC genetiği KPC-fareler kaynaklanan nakli (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cyeniden) (KPC-et). Birincil tümör doku küçük parçalara (~ 2 mm3) kesme ve subkutan nakledilen (SC) syngeneic alıcılara (C57BL/6, 7-9 haftalık). Homografts cerrahi olarak o zamanlar pankreas tümörü birimleri 300-1000 mm3 tarafından 16 gün ulaştı SC-implantasyon ile birlikte yeni C57BL/6 farelerin üzerine nakledilen orthotopically. Sadece tümör 400-600 mm3 onaylanmış otopsi yordamı hasat ve bitişik olmayan tümör doku kaldırmak için temizledim. Bir doku dissociator tek hücreli süspansiyonlar, çeşitli işaretleri farklı bağışıklık hücrelerinin fluorescently etiketli antikorların belirlenen panelleri ile boyama tarafından takip içine iletişim kuralı'nı başına ayrışmış (lenfoid, myeloid ve NK, DCs). Lekeli örnekleri farklı soy, hem de onların göreli yüzde tümörleri içinde bağışıklık hücrelerinin numaraları belirlemek için çok renkli FACS kullanarak analiz edildi. Orthotopic tümörlerin bağışıklık profilleri sonra o SC tümörler için karşılaştırıldı. İlk veri pankreas ve daha yüksek B-hücre infiltrasyonu SC tümör yerine orthotopic içine üzerinde önemli ölçüde yükseltilmiş infiltre TILs/TAMs tümörler olarak gösterdi.

Giriş

Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) yaklaşık yarım bir milyon Scotlan dünya çapında her yıl, ilk 5 kanser katillerden biri neden olur. Orada kaç etkili tedavi seçenekleri ve onaylanmış hiçbir immunotherapies; Bu nedenle, yeni tedaviler umutsuzca ihtiyaç vardır. Kanser giderek PDAC, bugün bilinen genetik hastalıklara ek olarak dahil immünolojik hastalıklar olarak tanınan ediliyor. İmmünolojik ve genetik faktörlerin yanı sıra tedavi hastalığı prognoz büyük olasılıkla belirlemek sonuçları. Tümörlerin konak immün gözetim evade ve sonunda ölüme neden ilerlemek. Bu bağışıklık süreçlerin pek çok farklı bağışıklık hücrelerinin tümör hücreleri ile birbirleriyle ve diğer tümör ile etkileşimde bulunduğu (TME)1,2,3,4 tümör microenvironment içinde meydana stromal bileşenleri, doğrudan veya dolaylı olarak sonuçta hastalık sonucu belirleyen sitokinler aracılığıyla. Bu nedenle, TME veya tümör immunophenotyping, subtyping, numaralama ve bağışıklık hücrelerinin farklı soy lokalizasyonu gibi tümör bağışıklık bileşenlerinin karakterizasyonu anti-tümör dokunulmazlık anlamak için önemlidir. PDAC söz konusu olduğunda, bu teklif edildi süpresif makrofajlar (TAM) tümör infiltre yüksek de B-hücreleri T-hücre infiltrasyonu ve/veya etkinleştirme önleme ve fibrozis5,6yüksek düzeyde yol açmıştır.

Bağışıklık br deneysel olarak araştırılması için ortak bir yaklaşım-cekti var olmak istimal vekil tümör preklinik hayvan modelleri, esas olarak ilgili fare tümör7, özellikle fare syngeneic (Homogref) ya da genetik fare modelleri (et) modelleri kanserleri, fare ve insan tümörler ve bağışıklık8,9için varsayılan benzerliği. Bu gerçekte iki tür10,11arasında içsel farklılıklar vardır anlaşılmaktadır.

Transplante fare tümörler spontan tümör7, yani eşitlenmiş tümör gelişimi, ebeveyn et spontan tümör geliştirme aksine önemli operasyonel üstünlükleri vardır. Homografts spontan fare tümörlerin birincil tümörleri asla edilerek manipüle vitrove yansıtma orijinal fare tümör histo - olarak kabul edilir / moleküler patoloji7yanı sıra olası bağışıklık profilleri. Bu fare homografts kez "hasta elde edilen xenografts (PDXs) bir fare sürüm" olarak kabul edilir. Bu nedenle büyük olasılıkla geleneksel syngeneic hücre satırı kaynaklı fare tümörler12' den daha iyi bir translatability var. Özellikle, birçok homografts nerede belirli insan hastalık mekanizmaları, Örneğin oncogenic sürücü mutasyonlar, mühendislik ve bu homografts bu nedenle onların klinik önemi avantajları olmalıdır belirli et türetilir. Özellikle, KPC et içinde 15-20 hafta-in yaş, hangi morfolojik insan hastalığı çoğunlukla iyi - için orta-Ayrıştırılan glandüler mimarisi ile recapitulates ve son derece stroma zenginleştirilmiş fare PDAC geliştirmek. Bu model Ayrıca insan PDAC, yani % 90 ve insan PDAC, sırasıyla5,%675'i de ortaya mutasyon ve P53 kaybı, işlev, aktive Kras en yaygın genetik özelliklerinin beyannamedir.

Nakli sitelerin de bir rol modeli translatability oynamak için önerilmiştir. Belirli doku çevreye, karşılık gelen bir orthotopic ortamı gibi bir niş sık transplante tümörler için Tekdüzen subkutan (SC) karşı ilerleme ortamlara belirli tümör olabilir. Bu özel ilgi olurdu eğer, ve/veya, e.gbağışıklık-microenvironment ve insan kanser, alaka düzeyi açısından iki nakli siteler arasında ne fark var. PDAC durumunda.

Bağışıklık profil oluşturma veya immunophenotyping, en önemli yönlerinden biri tümör infiltre bağışıklık hücreleri farklı soy, sayı, tümörler içinde göreli yüzde yanı sıra onların harekete geçirmek Birleşik ve yerleri tespit etmektir. Bu tümör-infiltratrating lymphoctyes içerir (TILs, hem T - ve B-), tümör infiltre makrofajlar (TAMs), tümör infiltre doğal katil hücreler (NKs) ve tümör yerleşik dendritik hücreleri3,13,14 , 15 , 16 , 17ve belirli hücreleri18,19,20, vbhücre altı lokalizasyonu. Floresans aktif hücre sıralama (FACS) veya akış sitometresi bir hücre belirli parametrelerini ölçmek için kullanılan bir tek hücre algılama teknolojisidir. Çok renkli bir tek hücre3,4,21 birden çok işaretçileri sitometresi önlemler akış ve numaraları ve bağışıklık hücrelerinin farklı alt kümelerini göreli yüzdesini belirlemek için en sık kullanılan yöntemdir, Bu tümörler içinde dahil.

Bu rapor bağışıklık hücreleri tümör infiltre profil oluşturma yordamları açıklar: 1) ile birlikte SC implantasyon; orthotopic PDAC fare tümör homografts implantasyonu 2) tümör doku hasat ve tek hücre hazırlık tümör ayrılma ile; 3) temel olarak tümör türetilmiş hücrelerin tümünü Akış Sitometresi Analizi; 4) temel profilleri her iki nakli yaklaşımın karşılaştırılması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm iletişim kuralları ve tadilat (lar) veya yordamlar içeren bakım ve hayvanların kullanımı incelenmeli ve Crown Bioscience kurumsal hayvan bakım ve kullanmak Komitesi (IACUC) tarafından çalışmalar yürütülmesi önce onaylanmalıdır. Bakım ve hayvanların kullanımı genellikle AAALAC (değerlendirme ve akreditasyon laboratuvar hayvan bakım Derneği) uluslararası kurallara uygun olarak bakım ve kullanmak of Laboratory Animals, ulusal araştırma için Kılavuzu'nda rapor olarak yapılacaktır Konseyi (2011). Tüm hayvan deneysel yordamlar SPF (özel patojen içermeyen) tesislerinde Steril koşullar altında olacak ve Kılavuzu ile farklı hükümet kurumları (Örneğin sıkı uygun bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları için yürütülen Ulusal Sağlık Enstitüleri). Protokol tesis Kurumu hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir (Örneğin kurumsal IACUC Komitesi).

1. tümör ekimi için hazırlık

  1. Hayvan konut
    1. Genel C57BL/6 fareler bir ticari üreme satıcısından edinin.
    2. Aşağıdaki koşullar, bireysel havalandırılmış kafeslerde ev fare (5): sıcaklık: 20-26 ° C; nem oranı % 30-70; döngüsü aydınlatma: 12 h ışık ve 12 h karanlık.
    3. Kullanım Mısır koçanı Yani yatak takımları haftalık değişti.
    4. Diyet için tüm çalışma döneminde sterilize ışınlama Kuru granül besin içerir.
    5. Su için hayvanlar steril içme suyu ücretsiz erişim sağlar.
  2. Donör tümör parçası hazırlama
    1. Vücut ağırlığı (BW), izleyerek bir denge ve tümör hacmi (TV), tarafından Halife ölçüm tümörü taşıyan donör fare kullanarak Tartı ile başlar.
    2. TV 500-1200 mm3ulaştığında, hayvan bir biohazard başlıklı Protokolü göre ötenazi.
    3. İodophor temizleme bezi kullanarak tümör çevresindeki deri sterilize.
    4. Cerrahi tümörü (3 bölümünde açıklanan ayrıntıları: Nekropsi ve tümör hasat) ve tümör PBS 20 mL içeren bir petri içinde yer (önceden medya veya arabellek hayvanlara ötenazi önce 4 ° c soğuk).
    5. Bulaşıcı kan varsa, tümör başka bir Petri kabına aktarın ve tümör PBS ile yıkayın.
    6. Tümör herhangi bir ilave cilt, gemiler, kalsifikasyon ve/veya nekroz kaldırma, yarıya.
    7. Tümör sadece sağlam parçalarını seçmek ve onları bir steril 50 mL santrifüj tüpüne yeri ve PBS 20 mL ekleyin sonra Farmakoloji araştırmaları ayrı bir hayvan odası tüp taşıma.

2. Orthotopic ve subkutan (SC) Engraftment

  1. SC aşı
    1. Tümör çapı parçalar her trokar, daha sonra orthotopic implantasyon (aşağıya bakın) veya SC implantasyon için 1 parça koyarak bir neşter kullanarak 2 mm kesilmiş.
    2. % 1'adlı bir burun konisi tarafından tutulan %5 isoflurane alıcı hayvanla anestezi. Hayvan dinlenmek, kendi iyileştiren refleks kaybetme başlar ve sonunda hareketsiz olur. Anestezi bu derinlikte onlar-kolayca var roused ağrılı uyaranlara tarafından; acı böyle yanıt yok olana derinleştirmek anestezi sağlar.
    3. Bir kez anestezi, fareler bir deneme tahtası değil lateral pozisyonda gidermek. Fare iodophor temizleme bezi, tümör çevresindeki alanlarda özellikle kullanılarak sterilize.
    4. Bir neşter ile sol kanatta, kalça için sadece kafatası 0.5-1.0 cm cilt kesi yapmak.
    5. Forelimb, 2-3 santimetre, doğru cilt altında künt forseps ile tünel.
    6. Aseptik tümör bir küp ortamından aktarmak ve derin subkutan tünel içinde yer.
    7. Görsel olarak tümörün derin tünel (ve değil belgili tanımlık deri kesme) olduğunu doğrulayın.
    8. Yara yara kliplerle kapatın.
    9. Onlar sternal recumbence korumak için yeterli kendine gelmek kadar hayvanlar sonrası aşılama izlemek. Onların kafes anestezi onların tam kurtarma sonra geri dönüş hayvanlara. Anestezi günlük tamamlamak ve hayvan sağlık grafik işlemini başlatın. Alıcı hayvan her gün üç gün boyunca tartmak
    10. Standart bir prosedür için 5-10 farelerde tümör büyüme izleme grubu başına aşılamak.
  2. Pankreas orthotopic implantasyon
    1. Anestezi ve analjezi
      1. Kullanma a 2 mL ketamin enjeksiyon ve 5,91 steril enjeksiyon su veya serum fizyolojik bir doz seste 0,06-0.1 karışık 0,42 mL xylazine enjeksiyon (20 mg/mL) mL/20-25 g vücut ağırlığı.
        Not: hayvan refahı için analjezi gereklidir According her iki öncesi ve işlem sonrası. 0,05-0,1 mg buprenorfin /kg, SC İlk doz öncesi bir işlemdir ve 3 kez her 4 saat post işlemi sürekli ilaç.
    2. Orthotopic implantasyon için cerrahi operasyon
      1. Kas içi enjeksiyon (IM) adım 2.2.1 başına üzerinden fare anestezi.
      2. Hayvanlar tam anestezi sonra fareyi sağ lateral pozisyonda bir deneme tahtası gidermek.
      3. Fareyi sağa yatay konumda tutun. Dalak iyot ile sonra de-iodinate % 75 etil alkol ile çevresindeki deri dezenfekte.
      4. Dalak orta nokta bulmak ve dalak ortaya çıkarmak için karın bölgesinde 1 cm dikey kesi yapmak.
      5. Dalak altında pankreas dokusunun bir parçası dışarı hafifçe düz uçlu cımbız ile çizin ve bir fare Homogref tümör parça pankreas üzerinde tohum fareden alıcı fare 9-0 tarafından absorbe Cerrahi dikiş dikiş.
      6. 6-0 ipek sütür ile karın tarafından çift dikiş kapatın. Homeostasis sıkıştırma tarafından elde.
      7. Ne kanama ne tümör doku sızıntı meydana gelirse, bitirme tümör implantasyon sonra hayvanlar sıcak bir kafeste tutmak.
      8. Sternal recumbency korumak için yeterli bilincinin tekrar yerine geleceğinden hayvan izlemek; hayvan anestezi tam kurtarma sonra hayvan odasına dönün. Tümör karın dalak yakınındaki palpating tarafından fareler taşıyan izlemek ve orthotopic tümörü taşıyan fareler seçin.
  3. Tümörü taşıyan fareler sağlık izleme
    1. Su ve yiyecek tüketimi her gün kontrol edin.
    2. Fare görünüm bir koşusu saç ceket, topaklar, inceliği, anormal nefes veya asit için inceleyin.
    3. Karaciğer ve dalak spontan tümörler olup olmadığını denetlemek için karın muayene et.
    4. Haftalık bir denge kullanarak fare tartın.
    5. Eğer herhangi bir aşağıdaki klinik belirtiler gözlenir, fareler örnek toplama ve Nekropsi için feda: BW kaybı > % 20; Engelliler hareketlilik (yemek veya içmek mümkün değil); yapamaz-e doğru normalde önemli asit ve genişlemiş karın nedeniyle hareket eder; Solunum çaba.

3. Nekropsi ve tümör hasat

  1. Görsel ve sona ermeden önce elle tutulur tümörlerin varlığı için palpasyonla tarafından bakarak kontrol edin.
  2. Fesih, ilk ötenazi başı olarak onaylanmış protokolü, fareler ve karın açın ve pankreas tümörleri için görsel olarak inceleyin.
  3. Yazı ölümlü cerrahi ile tümör kesti ve soğuk PBS'ye ekleyin. Bütün hayvanlar bir bağlantı noktasıyla'dır karbondioksit kullanılmak üzere özel bir kapak ile temiz, doldurulmamış, yarı saydam ötenazi odası yerleştirin.
  4. Gaz odasına hayvan için en az sıkıntı ile hızlı bilinçsizlik üreten bir akış hızı, akıntı. CO2 için optimum akış hızı yaklaşık 2-2.5 L/dak olmalıdır.
  5. Görsel olarak her hayvan bütün hayvanlar yeterli gaz konsantrasyonları almak ve kendine euthanize işlem sırasında gelmek değil sağlamak için ötenazi yordamı sırasında gözlemlemek.
  6. Gaz akışı için en az 1 dk bir hayvan kurtarmak olasılığını en aza indirmek için belirgin klinik ölümünden sonra bakımını (Eğer apneic ama ölmedi).
  7. Bitişik olmayan tümör doku kaldırın. Temizlenmiş tümör hızlı bir şekilde fotoğrafı olabilir.
    Tümör doku RPMI-1640 koymak ve ayrılma önce buz üzerinde tutun.
    Not: Hayvan leşleri Torbalı ve kaldırma beklemek üzere uygun dondurucu içinde depolanır.

4. tümör doku ayrılma ve tek hücre hazırlık

  1. Reaktif hazırlık
    Not: Tümör ayrılma seti 2 şişe enzim d (liyofilize toz), enzim R (liyofilize toz), 1 şişe enzim A (liyofilize toz) ve arabellek A. 1 mL 1 şişe içerir.
    1. Enzim D her flakon RPMI-1640 3 mL ile lyophilized toz başlamaktan tarafından hazırlayın. Aliquots tekrarlanan donma-çözülme-döngüsü önlemek için uygun bir farenin hazırlayın.
    2. Enzim R ile RPMI 1640 2.7 mL flakon lyophilized toz başlamaktan tarafından hazırlayın. Aliquots tekrarlanan donma-çözülme-döngüsü önlemek için uygun bir farenin hazırlayın.
    3. Enzim A ile arabellek kiti ile birlikte A 1 mL flakon lyophilized toz başlamaktan tarafından hazırlayın. Değil girdap yapmak. Aliquots tekrarlanan ücretsiz tezcan-döngülerini önlemek için uygun bir farenin hazırlayın.
    4. Enzim karışımı her gentleMACS C-tüp 2.35 mL RPMI-1640, enzim d 100 µL, enzim r 50 µL ve enzim a 12.5 µL ekleyerek hazırlayın.
  2. Tümör ayrılma
    1. Bir C-tüp tümör sindirim karışımı ile her tümör için hazırlamak, sindirim arabellek seyreltme ve hazırlık için 4.1 bölümüne bakınız.
    2. Kullanım 3 mL sindirim arabellek tümör parçaları için < 0.8 g ve tümör tamamen sindirilmiş emin olun.
    3. Çalışma kodu, tümör, fare Kımlığı, tedavi grubunda ve tümör ağırlık ile etiketleyin.
    4. Tümör fare toplamak, tümör soğuk PBS yıkama ve tümör (örneğin, kan damarları, yağ, fasya, vb) üzerinde bağlı doku temizlemek.
    5. Tümör sindirim medya steril 6 iyi plaka bir iyi koymak.
    6. Tümör steril cımbız/forseps ile yer ve dilim bir neşter ile tutun. Tümör yeterince küçük parçalar halinde (~ 1 mm3) kırmak için dilim.
    7. Geri C-tüpün içine tümör alin ve kalan sindirim arabellek plaka yıkayın ve ardından buza kadar sindirim yerleştirilir C-tüp içine sıvı aktarmak için kullanın.
    8. Dissociator üzerinde ısıtıcılar ile geçin.
    9. Boş pozisyonların tümör ayrılma C-tüpler kollu baş aşağı içine yerleştirin ve tüp pozisyonlardan serbest seçili durumunu ayarlayın. Programlar listesinde görüntülendiği gerekli klasör seçerek takip bir ayrılma programı (37_c_m_TDK_1) seçin.
    10. Program sona ermesi sonra C-tüpler dissociator ve spin kısaca (300 x g, 4 ° C) örnek cips alır.
    11. Örnekleri yeniden askıya alma ve bir hücre süzgeç yukarıda 50 mL tüp içine koyun. Hücreleri tek hücre süspansiyon sağlamak için yıkama arabellek 10 mL ile hücre süzgeç ile yıkayın.
    12. 300 x g 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve yıkama arabelleği, 5 mL hücrelerle trypan mavi ve/veya hücre sayaç tarafından kullanarak sayısı hücrelerin yeniden askıya alma ve tüp ya da örnek başına 1 x 106 hücrelere hücre concentraton ayarlayın. Boyama belirli olduğundan emin olmak için doğru izotip kontrol antikorları içerir

5. bağışıklık Panel Tasarım ve akış veri toplama

  1. Panel Tasarım
    1. Lütfen bkz. Tablo 1.
  2. Immunostaining
    1. FC-blok örnek hücreleri: 1 µg/mL Fc-taş, kuluçka karanlıkta 15 dakika buz veya 4 ° C soğutma üzerinde takip ile tampon boyama 200 µL hücrelerde yeniden askıya alma.
    2. Leke hücreleri kullanarak istenen antikor/floresan panelleri (Örn. T-Cell panel, makrofaj paneli, vb.): Fc engelleme arabelleği her örnek için en az 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık buzda leke için seyreltilmiş antikor karışımı ekleyin.
    3. Buz soğuk PBS 1 mL her tüpün ekleyin ve hücreleri nazikçe, 300 x g 5 dk. atma elde edilen süpernatant de Santrifüjü ardından yeniden askıya alma.
      1. Hücreleri iki kez yıkamak için yineleyin.
    4. Leke gerekirse hücre içi işaretçileri için aşağıdaki adımları 6-10, aksi takdirde adım 10'a geçin.
    5. Hücre Pelet darbe girdap tarafından yeniden askıya alma ve her örnek için hazırlanan fiksasyon/Permeabilization çalışma çözümü 200 µL ekleyin. Nabız girdap tekrar ve daha sonra 4 ° C'de kuluçkaya (tercih edilen) bir gecede veya karanlık oda sıcaklığında 30 dakika.
    6. Hücreleri aşağı spin ve süpernatant kaldırın.
    7. İki kez 1 mL 1 x (10 x Permeabilization arabellek, distile H2ile O seyreltilmiş yapılmış) Permeabilization arabellek Santrifüjü tarafından takip ekleme ve süpernatant ile decanting yıkayın.
    8. Hücre içi marker antikor 1 x Permeabilization arabellek ekleyin ve 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
    9. Hücreleri iki kez 1 mL 1 x Permeabilization arabellek ile yıkayın. Santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
    10. Boyama arabelleği 150 µL hücrelerde resuspend ve bir sitometresi çözümleyebilirsiniz. Fiksasyon ve permeabilization yordamı, FSC (ileri-ışık dağılım) nedeniyle / hücre nüfus dağılımı SSC (sidelight dağılım) hücreleri yaşamak için farklı olacak. Bu nedenle, kapı ve gerilimleri değiştirilmesi gerekecektir.
  3. FMO denetimleri (floresan bir denetim eksi)
    Not: Çok renkli akışı analizi özellikle bağışıklık hücreleri tümör infiltre analiz için önemlidir. Bu nedenle, tanımlamak ve hücreleri belirli bir panel birden çok fluorochromes nedeniyle yayılan veri bağlamında kapı için bir yol bulmak için bir ihtiyaç vardır. FMO (floresan eksi bir) denetim bu amaç için önemli bir yaklaşımdır.
    1. Bu amaçla, her grup için FMO denetimleri (en az 2 Rx başına) ve işlem her doku için tek tek ek farelerin bulunur. Ayrılma sonra havuzu dokular. Örneğin, 4 Rx gruplarla bir çalışmada, 8 ek tümörleri ayrı ayrı işlenir ve FMOs için bir örnek havuza alınmış.
  4. Akış Aracı Kurulum
    1. Tazminat boncuk yaparken, makine (en az 20 dk kadar) ısınıyor.
    2. CS & T boncuk performans denetlemek için kullanın.
    3. Gerilim ve tazminat ayarları: UltraComp boncuk, girdap Comp boncuk iyice kullanmadan önce kullanın.
    4. Her fluorochrome Birleşik antikor için ayrı 12 x 75 mm2 örnek tüp etiketleyin.
    5. Her tüpün arabelleğe boyama 100 µL ekleyin. 1 tam damla (yaklaşık 60 µL) her tüp boncuk ekleyin.
    6. Antikorlar ekleyin ve tam olarak 4 bölümünde belirtilen örnek işlem olarak boyama yordamı gerçekleştirin.
    7. Tamamen boncuk granül yeniden girdap ile askıya alma arabellek her, boyama 0.5 mL ekleyin.
    8. Akış Sitometresi Devresel_ödeme gerilim başına hedef doku verilen deney için ayarlayın.
    9. Akış Sitometresi veri toplama, FSC ve SSC okuma başına singlet boncuk nüfus çoğunluğuna tarafından çalıştırın.
    10. Set akış oranı çevresinde 200 – 300 olaylar/s.
    11. Ayarlamak için verilen floresein [FITC] uygun tazminat-Konjüge antikor, kullan bir FL1 vs FL2 nokta arsa.
    12. Dörtgen Bölümlü kapısı böylece negatif boncuk içinde sol alt çeyrekte ve olumlu boncuk üst ya da alt yer değil çeyreği. (MFI) medyan floresan yoğunluğu (çeyreği İstatistikleri penceresinde gösterildiği gibi) her nüfus yaklaşık olarak eşit olana tazminat değerlerini ayarlayın (yani FL2-% FL1 için her iki boncuk FL2 MFI-meli var olmak benzer).
    13. Adım 5.4.11 ve 5.4.12 tüm tüpler için yineleyin.
    14. Gerçek elde etmek örnekleri lekeli devam edin. Tazminat sihirbazını çalıştırın ve ayarları "tarihi deney adınızın baş harfleri" biçimiyle kaydetmek.

6. akış veri analizi ve sunum

  1. Flowjo ve/veya Kaluza veri analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hızlı tümör büyümesi için SC implantasyon görülen benzer PDAC implantasyonu Orthotopic sonuçlandı. Donör tümör parçaları alıcı fareler implante edildi sonra hem subkutan ve orthotopically iletişim kurallarına göre açıklanan adımları 2,1 ve 2,2, implante KPC Homogref tümörler Şekil 1A'gösterildiği gibi benzer hızlı büyüme gösterdi . Farklı zaman noktalarda hasat KPC Homogref tümör Şekil 1B adımında gösterilir ve temsilcisi H &...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

SC tümörler kullanarak çalışmaları daha kolay yapılmaktadır rağmen implante orthotopically tümör modelleri potansiyel olarak gelişmiş translatability sağlamak için preklinik Farmakoloji çalışmalar (özellikle I/O araştırmalar) için daha alakalı olabilir. Bu rapor baktılar okuyucu/izleyici-doğrudan ilgili kendi araştırmalarında kullanılan teknik prosedürler görselleştirmek için yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Bizim iletişim kuralları bu orthotopic göstermektedir PDAC implantasyonu verimli tümör büyüme, SC implantasyon için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Geçerli tam zamanlı çalışan Crown Bioscience, Inc tüm yazarlar vardır

Teşekkürler

Yazarlar Dr Jody Barbeau - kritik okuma yazması düzenleme için teşekkür ve Ralph Manuel sanat tasarlamak için teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca taç Bioscience Onkoloji IMMUNO-Onkoloji biyomarker ekibi ve onkoloji In Vivo takımı, büyük teknik çabaları için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anestezi makinesi\SAS3119\
Trokar 20\\2 mm
Petri kabı\\20 mm
100x antibiyotik ve antimikotik\\\
İyodofor sürüntüleri\\Günlükeczane alımı
Alkollü swablar\\Günlük eczane alımı
Sıvı nitrojenHava kimyasalı\\Biyogüvenlik
başlığıAIRTECHBSC-1300IIA2\
FACS makinesi LSRFortessa X-20BDLSR Fortessa\
antikorlarBD\\
Trevigen MD veya BD Matrigel Temel Membran Matrisi Yüksek konsantrasyonluBD354248\
FACS tamponlarıBD554656Kıyma tamponu
Parlak Boyama TamponuBD563794\
Fare BD Fc BlokBD553142\
hücre filtreleriBD-Falcon35235070 & mikro; m
rutin kan tüpüBD-Vacutainer3659742 mL
KaluzaBeckmanvs 1.5
6 oyuklu plakalarCorning3516\
Foxp3 Fix/Perm kitebioscience00-5523-00\
UltraComp eBeadsebioscience01-2222-42\
Santrifüjeppendorf5810R,5920R\
FlowJo yazılımıFlowJo LLC\vs 10.0
PBSHycloneSH30256.0150 mL
RPMI 1640HycloneSH30809.01\
Tek kullanımlık, steril neşterlerJin zhongJ1210011#
bıçak sapıJin zhongJ11010\
göz makası ve cımbızJin zhongY00030Göz makası 10 cm
göz makası ve cımbızJin zhongJD1060Göz cımbızı 10 cm dişli
Taşınabilir sıvı nitrojen tankıJinfengYDS-175-216\
Elektronik dengeMetter ToledoAL2040-100 g
Miltenyi C-tüpleriMiltenyi130-096-334\
Miltenyi Isıtıcı bloklu nazik MACSMiltenyi120-018-306\
Tümör Ayrışma KitiMiltenyi130-096-730\
Hücre sayacıNexcelomCellometerCellometer Otomatik T4
kriyoprezervasyon tüpüNunc3754181.8 mL
Cultrex Yüksek Protein Konsantrasyonu (HC20+) BMEPathClear3442-005-01\
şırıngalarŞanghay MIWA tıp endüstrisi\1-5 mL
Studylog yazılımıStudylog\yazılımı
Studylog-Balance ve USB desteğiOHAUSSE601FTerazi ve USB desteği
Studylog-Sürmeli kaliperlerin veri hattıSylvac926.6721Sürmeli kaliperlerin veri hattı
Sylvac910.1502.10Sylvac S-Cal pro
Sterilize santrifüj tüpleriThermo33965350 mL
Sterilize santrifüj tüpleriThermo33965115 mL
Buz kovasıThermoKLCS-2884 & derece; C
Buz kovasıThermoPLF-276-20° C
Buz kovasıThermoDW-862626-80& C
RNAlaterTermoam7021\

Kaynaklar

  1. Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
  2. Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
  3. Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
  4. Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316(2016).
  5. Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
  6. Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
  7. Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
  8. Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
  9. Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
  10. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  11. von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
  12. Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
  13. Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
  14. Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
  15. Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
  16. Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
  17. Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
  18. Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
  19. Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
  20. Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
  21. Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Fare ModelleriTümör MikroçevresiTümör İnfiltre Edilmiş İmmün HücrelerÇok Renkli FACSHücre DisosyasyonuFlorışanlı Antikorlar
Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.