Bu iletişim kuralı virüs teslim edilmek üzere fare prostat yeni kurulan bir yöntem açıklanır. CRISPR/Cas9 teknolojisi, gen overexpression veya Cre recombinase teslim kullanarak, teknik gen ifadesinin orthotopic değişiklik sağlar ve prostat kanseri için bir roman fare modeli uygular.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini
Bu makalede
Özet
Özet
Artan bir prostat kanseri insidansı ile yeni tümör sürücüleri veya modülatörler kimliği çok önemlidir. Prostat kanseri için genetik fare modelleri (et) tümör heterojenite ve onun karmaşık microevolution dynamics tarafından engel vardır. Geleneksel prostat kanseri fare modelleri içerir, diğerleri arasında germline ve koşullu altını gizleme, oncogenes ve xenograft modelleri transgenik ifadesi. Bu modeller de novo mutasyonların, zaman alıcı, karmaşık ve pahalı olduğunu. Ayrıca, insan prostat kanseri hücreleri yalnızca küçük bir bölümünün içinde izole bir olay olarak gelişmeye bilinen ise geleneksel modellerin çoğu prostat epiteli, çoğunluğu hedef. Prostat kanseri başlatma, hem de gelişmiş hastalık ilerleme benzetimini yapmak değerli modelleri gerekir.
Burada bir kaç prostat epitel hücrelerinde transducing hücreleri tarafından tarafından viral parçacıkların hedeflemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare prostat için tasarlanmış bir virüs teslim prostat epiteli gen ekspresyonu değiştirilmesini sağlar. Bu vesile ile virüs türü ve miktarı gen değişikliğini için hedeflenen hücreleri kanser başlatılması için birkaç hücre ve gen tedavisi için birçok hücre transducing tarafından tanımlayacaktır. Cerrahi tabanlı enjeksiyonuyla ön LOB, idrar izlemek, distal tümör bu modelde hayvan idrar işlev bozulması olmadan genişletebilirsiniz. Ayrıca, yalnızca alt küme küme küme prostat epitel hücrelerinin hedefleyerek teknik tümör klonal genişleme sağlar ve bu nedenle insan tümör başlatma, ilerleme gibi işgal Bazal membran aracılığıyla taklit eder.
Bu roman tekniği geliştirilmiş fizyolojik alaka ile güçlü prostat kanseri modeli sağlar. Hayvan acı sınırlıdır ve hiçbir ek ıslahı gerekli olduğundan, genel olarak hayvan sayısı azalır. Aynı zamanda, yeni aday genler ve yolları analizi, hızlandırılmış hangi sırayla daha fazla etkili maliyetidir.
Giriş
Algılama ve prostat kanseri tedavisinde son on yıl içinde önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Hala, prostat kanseri insidansı, yaşam beklentisi artıyor. Bir tahmini 1.1 milyon yeni vaka ile dünya çapında, kanserle ilgili ölüm erkekler 1' deki en yaygın nedenleri arasındadır. Prostat kanseri gelişimi içinde yavaş, ama ne zaman kanser için gelişmiş bir metastatik devlet ilerlemiştir, sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle prognozu kötüdür. Şimdiye kadar sadece birkaç genler bu kanserde ortak sürücüleri olarak tespit edilmiştir ve onun heterojenite ve multifocality engellemektedir, biyolojik ve targetable hastalığı sürücüleri2
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu iletişim kuralı laboratuvar fareler cerrahi prosedürde içerir. Tüm hayvan deneyleri tek tek gözden geçirilmiş ve bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış gerekir. Yaklaşım hayvan kurtarma ve hayatta kalma dayalı olarak uygun anestezi, ağrı yönetimi ve aseptik cerrahi ortam her zaman emin olun. Bir Isıtma yastığı cerrahi ve anestezi kurtarma kadar hipotermi engellemek için kullanın.
1. başlangıç konuları
- Kullanılan virüs bağlı olarak, farklı titresi gereksinimleri uygulanabilir; virüs buna göre oranında seyreltin.
Not: Bu örnekte, 1 x 1012 IU/mL titresi PBS içinde seyreltilmiş bi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Virüs teslim fare prostat için değerlendirmek için örnekleri ameliyattan sonra üç ay analiz edildi. Rosa26-LSI-Cas9-EGFP fareler12 GFP virüs tarafından ifade edilen Cre protein maruz kalmış olan hücrelerde hızlı. Prostat örnekleri GFP sinyal (şekil 2A) ile alanları tanımlamak için bir Floresans mikroskobu ile incelendi. GFP sinyal prostat epiteli ama olsun gene düzenleme CRISPR Kılavuzu tarafından uyarılan değil Cre faaliyet gösterir. .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol için biz ön lobunda gen ekspresyonu fare prostat virüs enjeksiyonu ile değiştirmek için bir yöntem prostat kanseri (Şekil 2) bir güçlü yeni fare modeli oluşturma açıklanmaktadır. Bir Adenovirus başarılı yönetim ilk Leow ve ark. 20058tarafından tanımlanmıştır. Biz daha önce nasıl bir Adenovirus için Cre recombinase protein kodlama zaman alıcı çarpı işareti-doğurmak için doku özgü silme 9 (şekil 2B
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bay Danimarka Kanser Derneği (R146-A9394-16-S2) bir bursu tarafından finanse edildi. MFB ve MKT AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) tarafından finanse edilmiştir. Bay ve MFB co finanse edilmiştir Graduate School, sağlık, AU. E.F.W. laboratuvar İspanyolca Bakanlığı Ekonomi (SAF2015-70857, eş ERDF-AB tarafından finanse edilen) ve grant (741888 - olay yeri inceleme-eğlenceli) gelişmiş bir ERC gelen hibe tarafından desteklenmektedir.
Liliana Fajardo Mellor (genler, geliştirme ve hastalık; teşekkür etmek istiyorum Ulusal Kanser Araştırma Merkezi) için eleştirel okuma şekilde alt alta yazılmalıdır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ekipman< / güçlü > | |||
| B6J.129 (B6N) -Gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-cas9 *, -EGFP) Fezh< / sup> / J fareler | Jackson Laboratuvarı | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insülin şırıngası | BD | 324825 | enjeksiyonu için |
| 1 ml şırınga | BD | 300013 | enjeksiyonu için |
| 30 G 1/2' ' anestezi | enjeksiyonu için | BD | 304000 |
| 6-0 Polisorb Sütür | Medtronic | GL889 | peritonu kapatmak için |
| Tek kullanımlık sterilize cerrahi örtü | birden fazla tedarikçi | ||
| Isıtma yastığı | birden fazla tedarikçi | ||
| Povidon-İyot Hazırlık Pedi | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Süsleme Karın | tıraşı için | Aesculap | GT415 |
| Dumont Forseps | FST | 11252-00 | |
| Halsey Mikro İğne Tutucu | FST | 12500-12 | |
| İris Makası | FST | 14094-11 | |
| Dar Model Forseps | FST | 11002-12 | |
| Halka Forseps | FST | 11106-09 | |
| Yara Klipsi Sistem Kolu, Klipsler dahil | F.S.T | 12030-01 | kapatmak için |
| Yara Klipsi Sistem Sökücü | FST | 12030-04 | |
| Mikroskop | Leica | farklı modeller kullanılmıştır | |
| Reaktifler | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | Hayvan tesisinden elde edilen | ||
| Butorphanol | Hayvan tesisinden elde edilen | ||
| Medetomidinhidroklorid | Hayvan tesisinden elde edilen | ||
| Midazolam | hayvan tesisinden elde edilen | ||
| %100 Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Göz merhemi | Takeda | 7242 | |
| Virüs (AAV, AV) | çoklu tedarikçi | virüsü, kurum içi üretim | |
| pAKT antikorudur | CST | 4060 | kullanılan 1:200 dilüsyon |
| GFP anitbody | CST | 2956 | kullanılan 1:100 dilüsyondur |
Kaynaklar
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evoluti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
