Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

8.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57525

⸱

27 Nisan 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2GDD, Cancer Cell Biology Program, National Cancer Research Center (CNIO)

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı virüs teslim edilmek üzere fare prostat yeni kurulan bir yöntem açıklanır. CRISPR/Cas9 teknolojisi, gen overexpression veya Cre recombinase teslim kullanarak, teknik gen ifadesinin orthotopic değişiklik sağlar ve prostat kanseri için bir roman fare modeli uygular.

Özet

Artan bir prostat kanseri insidansı ile yeni tümör sürücüleri veya modülatörler kimliği çok önemlidir. Prostat kanseri için genetik fare modelleri (et) tümör heterojenite ve onun karmaşık microevolution dynamics tarafından engel vardır. Geleneksel prostat kanseri fare modelleri içerir, diğerleri arasında germline ve koşullu altını gizleme, oncogenes ve xenograft modelleri transgenik ifadesi. Bu modeller de novo mutasyonların, zaman alıcı, karmaşık ve pahalı olduğunu. Ayrıca, insan prostat kanseri hücreleri yalnızca küçük bir bölümünün içinde izole bir olay olarak gelişmeye bilinen ise geleneksel modellerin çoğu prostat epiteli, çoğunluğu hedef. Prostat kanseri başlatma, hem de gelişmiş hastalık ilerleme benzetimini yapmak değerli modelleri gerekir.

Burada bir kaç prostat epitel hücrelerinde transducing hücreleri tarafından tarafından viral parçacıkların hedeflemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare prostat için tasarlanmış bir virüs teslim prostat epiteli gen ekspresyonu değiştirilmesini sağlar. Bu vesile ile virüs türü ve miktarı gen değişikliğini için hedeflenen hücreleri kanser başlatılması için birkaç hücre ve gen tedavisi için birçok hücre transducing tarafından tanımlayacaktır. Cerrahi tabanlı enjeksiyonuyla ön LOB, idrar izlemek, distal tümör bu modelde hayvan idrar işlev bozulması olmadan genişletebilirsiniz. Ayrıca, yalnızca alt küme küme küme prostat epitel hücrelerinin hedefleyerek teknik tümör klonal genişleme sağlar ve bu nedenle insan tümör başlatma, ilerleme gibi işgal Bazal membran aracılığıyla taklit eder.

Bu roman tekniği geliştirilmiş fizyolojik alaka ile güçlü prostat kanseri modeli sağlar. Hayvan acı sınırlıdır ve hiçbir ek ıslahı gerekli olduğundan, genel olarak hayvan sayısı azalır. Aynı zamanda, yeni aday genler ve yolları analizi, hızlandırılmış hangi sırayla daha fazla etkili maliyetidir.

Giriş

Algılama ve prostat kanseri tedavisinde son on yıl içinde önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Hala, prostat kanseri insidansı, yaşam beklentisi artıyor. Bir tahmini 1.1 milyon yeni vaka ile dünya çapında, kanserle ilgili ölüm erkekler 1' deki en yaygın nedenleri arasındadır. Prostat kanseri gelişimi içinde yavaş, ama ne zaman kanser için gelişmiş bir metastatik devlet ilerlemiştir, sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle prognozu kötüdür. Şimdiye kadar sadece birkaç genler bu kanserde ortak sürücüleri olarak tespit edilmiştir ve onun heterojenite ve multifocality engellemektedir, biyolojik ve targetable hastalığı sürücüleri2,3.

Klasik teknikleri üreten GEMMs kez onların karmaşıklığı, zamanında giderleri ve masrafları tarafından Engelli. Koşullu nakavt modelleri ne zaman germline4' te inaktive embriyonik ölümcül neden prostat kanseri aday genler, eğitim için yaygın olarak kullanılmaktadır. En yaygın modelleri tarafından değiştirilmiş Probasin5 tahrik Prostat spesifik Cre recombinase veya ek çarpı işareti-doğurmak tarafından et entegre bir PSA6 organizatörü içerir. Bu modellerinde gen ilgi Hiperplazi hayvanın idrar yolu işlev7bozabilen tüm organ içinde üreten çoğu prostat epitel hücrelerinin hedeflenecektir.

Fare prostat ön LOB içine enjeksiyonla Cre proteinin viral teslim sadece birkaç hücre8hedefleyerek bu sorunu çözebilirsiniz. Laboratuvarları teknik önkoşulları, uzmanlık ve hedefler yöntem yarar--dan çok çeşitli olası değişimler dikkate alarak. Başarılı yaklaşımlar Adenovirus JunB ve Pten9 veya Lentivirus Pten ve Trp5310 Hedefleme hedefleme kullanan diğerleri arasında göstermiştir. Transgenes, luciferase gibi viral yapı veya et ekleme Ayrıca11Imaging bioluminescence yoluyla hastalık progresyon non-invaziv izleme olanak sağlar.

Genom CRISPR/Cas9 teknolojisini temel alan düzenleme yeni ve hızlı bir fırsat kanser hızlı somatik knockouts12nesil aracılığıyla çalışma ortaya koymaktadır. İçin fare prostat LOB anterior yönettiği tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) viral teslimini prostat kanseri fizyolojik olarak daha alakalı bir model oluşturur. Bu şekilde, seçilen mutasyonlar taşıyan tek hücreleri istila ve genişleme verebilir klonlar oluşabilir. Ayrıca, birden çok hedef genlerin için Kılavuzu RNA'ların kullanımını farklı genler Hücre klonlar değişiklikler ile oluşturur. Bu tümör heterojenite ve doğal seleksiyon basınç her gen değişikliğini veya epistatic mekanizmalar önemini ortaya çıkarabilir kanser ilerlemesine izin verir.

Burada fare prostat gen ekspresyonu İLETİMLERİNİZE için viral parçacıkların sunmak için bir yöntem mevcut. Karın küçük bir kesi, fare ön prostat LOB maruz ve viral parçacıkların LOB enjekte edilir. Beş gün sonrası cerrahi, cerrahi klipleri deriden kaldırılabilir ve prostat kanseri 8 hafta sonra analiz edilebilir. Genel olarak, bu küçük etkisi: fare ve fare ödün vermeden geliştirmek daha büyük tümör sağlayan bir hızlı ve maliyet-etkin yordamdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu iletişim kuralı laboratuvar fareler cerrahi prosedürde içerir. Tüm hayvan deneyleri tek tek gözden geçirilmiş ve bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış gerekir. Yaklaşım hayvan kurtarma ve hayatta kalma dayalı olarak uygun anestezi, ağrı yönetimi ve aseptik cerrahi ortam her zaman emin olun. Bir Isıtma yastığı cerrahi ve anestezi kurtarma kadar hipotermi engellemek için kullanın.

1. başlangıç konuları

  1. Kullanılan virüs bağlı olarak, farklı titresi gereksinimleri uygulanabilir; virüs buna göre oranında seyreltin.
    Not: Bu örnekte, 1 x 1012 IU/mL titresi PBS içinde seyreltilmiş bir Adeno ilişkili virüs enjekte edilir. Virüs serotip 9 vardır ve Kılavuzu RNA Pten ve Cre protein Ubikuitin promotor (şekil 1) altında ifade içerir. Pten kaybı pAKT ve Prostatik epitel13yayılması arttı.
  2. Yeterli prostat geliştirme sağlamak için ameliyat esnasında 8 haftalık bir yaşta erkek fare kullanın.
    Not: gösterilen bu deneyde fareler Rosa26-LSI-Cas9-EGFP knockin fareler C57BL/6J arka plan12 (şekil 1) değildir.
  3. Taze bir genel anestezi karışım hazırlamak ve mümkünse steril tutmak.
    Not: ameliyat sonrası daha iyi hayvan kurtarma için bir anestezi panzehir önerilir.
    1. Toplam hacmi 5 mL anestezik hazırlamak için 0.15 mL medetomidine hidroklorid (1 mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL) ve 0.25 mL butorphanol (10 mg/mL) ile 4,2 mL steril tuzlu su karıştırın.
      Not: Hayvan Kurulusları kurallarına göre inhalable isoflurane gibi alternatif anestezi yöntemleri kullanılabilir.
    2. Medetomidine hidroklorid ameliyat sonrası etkisini tersine çevirmek için 0.1 mL atipamezole (5 mg/mL) ile 4.9 mL steril tuzlu su karışımı.
  4. Aseptik cerrahi ortama uygun dezenfeksiyon ve sterilizasyon hazırlayın. Otoklav cerrahi aletler kullanmadan önce.

2. fare prostat için virüs-teslim

  1. Hayvan mayi enjeksiyonu ile steril 1 mL şırınga ve iğne 27G x ½" ile anestezi. Bir anestezi doz 0,01 mL/g vücut ağırlığının kullanın. Yordamı 30 dk daha uzun sürerse, anestezi enjekte edilerek korumak başlangıç 1/3 doz her 30 dak.
  2. Anestezi derinliği tarafından değerlendirilmesi kas gevşeme, pedal çekilmesi ve palpebral refleksleri inceleyin. Reflekslerin kaybı gözlenen zaman hayvanın alt karin tıraş.
  3. Dikkatle hayvanın gözleri veteriner oftalmik merhem Korneal refleks yetersizliği nedeniyle körlüğü önlemek için bir steril pamuklu çubukla kullanarak kapak.
  4. Cerrahi alan dezenfekte için % 70 etanol ve % 10 povidone iyot ile traş karın silin. Cerrahi alan çevre doğru cerrahi alanının merkezinden fırçalayın.
  5. Bir dikey cilt kesi düşük karın orta hat, yaklaşık 1 cm steril Cerrahi makas kullanarak gerçekleştirin.
  6. Karın zarını altında döşeme organlara zarar verme önlemek için para cezası nokta forseps kullanarak kaldırın. Periton ile Cerrahi makas kullanarak bir < 8 mm kesik dikkatli olun.
    Not: insan aksine, bir kemirgen 's prostat bezi dört ayrı loblar oluşmaktadır. Ön lob seminal vezikül eklenir.
  7. Yavaşça kenara yağ dokusu seminal vezikül ortaya çıkarmak için hareket ettirin. Bir halka forseps kullanarak dikkatli bir şekilde yukarı kaldırın (şekil 1) ön prostat olana kadar seminal vezikül tespit.
  8. Toplam hacmi 30 µL virüs (3 x 1010 viral parçacıkların) 0.5 mL insülin 30G x 8 mm iğne ile kullanarak ön prostat epiteli çözümde enjekte. Sızıntı en aza indirmek ve sıvı küçük bir kabarcık oluşturan doku içinde absorbe emin olun. Seminal vezikül karın boşluğunda yerleştirin.
  9. Periton ile 13 mm, 3/8 daire ve konik noktası iğne ile 6-0 absorbe dikiş kullanarak 2-3 basit kesintiye uğramış Dikiş dikiş.
  10. Cilt cilt toparlama Forseps ile karın zarını zarar görmesini önlemek için 3 steril 4.8 x 6,5 mm kliplerle zımbala.
  11. Daha iyi kurtarma için steril 1 mL şırınga ve iğne 27G x ½" kullanarak mayi enjeksiyonu ile anestezi panzehir 0,01 mL/g vücut ağırlığının bir doz uygulanır. Dikkatle hayvan geri onun kafes içinde yer.

3. sonrası cerrahi prosedürler

  1. O kafesi ameliyat 1 h bir Isıtma yastığı üzerinde işlemden sonra tamamen iyileşti kadar hipotermi önlemek için fare ile tutun. Panzehir uygulanırsa, hayvan birkaç dakika enjeksiyon sonra uyanık olmalıdır.
  2. Hayvanlar her gün için uygun yara iyileşmesi ve ağrı göstergeler izleyin. Gerekirse, ek ağrı kesici hayvan Kurulusları esaslarına göre yönetmek.
  3. Cilt klipleri 4-5 gün sonra yara kapatıldıktan sonra kaldırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Virüs teslim fare prostat için değerlendirmek için örnekleri ameliyattan sonra üç ay analiz edildi. Rosa26-LSI-Cas9-EGFP fareler12 GFP virüs tarafından ifade edilen Cre protein maruz kalmış olan hücrelerde hızlı. Prostat örnekleri GFP sinyal (şekil 2A) ile alanları tanımlamak için bir Floresans mikroskobu ile incelendi. GFP sinyal prostat epiteli ama olsun gene düzenleme CRISPR Kılavuzu tarafından uyarılan değil Cre faaliyet gösterir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol için biz ön lobunda gen ekspresyonu fare prostat virüs enjeksiyonu ile değiştirmek için bir yöntem prostat kanseri (Şekil 2) bir güçlü yeni fare modeli oluşturma açıklanmaktadır. Bir Adenovirus başarılı yönetim ilk Leow ve ark. 20058tarafından tanımlanmıştır. Biz daha önce nasıl bir Adenovirus için Cre recombinase protein kodlama zaman alıcı çarpı işareti-doğurmak için doku özgü silme 9 (şekil 2B

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bay Danimarka Kanser Derneği (R146-A9394-16-S2) bir bursu tarafından finanse edildi. MFB ve MKT AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) tarafından finanse edilmiştir. Bay ve MFB co finanse edilmiştir Graduate School, sağlık, AU. E.F.W. laboratuvar İspanyolca Bakanlığı Ekonomi (SAF2015-70857, eş ERDF-AB tarafından finanse edilen) ve grant (741888 - olay yeri inceleme-eğlenceli) gelişmiş bir ERC gelen hibe tarafından desteklenmektedir.

Liliana Fajardo Mellor (genler, geliştirme ve hastalık; teşekkür etmek istiyorum Ulusal Kanser Araştırma Merkezi) için eleştirel okuma şekilde alt alta yazılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman< / güçlü >
B6J.129 (B6N) -Gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-cas9 *, -EGFP) Fezh< / sup> / J farelerJackson Laboratuvarı26175
0,5 ml U-100 insülin şırıngasıBD324825enjeksiyonu için
1 ml şırıngaBD300013enjeksiyonu için
30 G 1/2' ' anestezienjeksiyonu içinBD304000
6-0 Polisorb SütürMedtronicGL889peritonu kapatmak için
Tek kullanımlık sterilize cerrahi örtübirden fazla tedarikçi
Isıtma yastığıbirden fazla tedarikçi
Povidon-İyot Hazırlık PediFisher Scientific06-669-70
Süsleme Karıntıraşı içinAesculapGT415
Dumont ForsepsFST11252-00
Halsey Mikro İğne TutucuFST12500-12
İris MakasıFST14094-11
Dar Model ForsepsFST11002-12
Halka ForsepsFST11106-09
Yara Klipsi Sistem Kolu, Klipsler dahilF.S.T12030-01kapatmak için
Yara Klipsi Sistem SökücüFST12030-04
MikroskopLeicafarklı modeller kullanılmıştır
Reaktifler
1x PBSGibco10010-023
AntisedanHayvan tesisinden elde edilen
ButorphanolHayvan tesisinden elde edilen
MedetomidinhidrokloridHayvan tesisinden elde edilen
Midazolamhayvan tesisinden elde edilen
%100 EthanolFisher Scientific22-032-103
Göz merhemiTakeda7242
Virüs (AAV, AV)çoklu tedarikçivirüsü, kurum içi üretim
pAKT antikorudurCST4060kullanılan 1:200 dilüsyon
GFP anitbodyCST2956kullanılan 1:100 dilüsyondur
virüs anestezi iğne makine cildi bu protokolde kullanılan

Kaynaklar

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
  3. Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454(2015).
  4. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
  5. Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
  6. Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
  7. Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
  8. Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
  9. Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
  10. Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
  11. Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
  12. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
  13. Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
  14. Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
  15. Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
  16. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
  17. Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
  18. McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
  19. Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Prostat Kanseri ModeliAdeno-ilişkili VirüsRosa26-LSL-Cas9-EGFP FareCerrahi EnjeksiyonAnterior Prostat LobuGFP Ekspresyonu
Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.