Burada, köklerinin genç farelerin kültürlü yumurtalık içinde seri kesit olmadan ölçmek için bir protokol mevcut. Ayirt bütün organ ve doku takas kullanarak, fiziksel kesit optik kesit ile değiştirilir. Bu yöntem örnek hazırlama ve görselleştirme organ bütünlüğü korur ve belirli hücre otomatik miktar kolaylaştırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar
Bu makalede
Özet
Özet
Memeli üreme biyolojisi alanında araştırma sık sık yumurtalıklar ve testis genel sağlık değerlendirme içerir. Özellikle, kadın, yumurtalık fitness kez görselleştirme ve köklerinin ve yumurta miktarının değerlendirilir. Çünkü yumurtalık opak bir üç boyutlu dokusu, geleneksel yaklaşımlar zahmetle doku hücreleri tüm organ boyunca görselleştirmek için çok sayıda seri bölümlere Dilimleme gerektirir. Ayrıca, miktar tarafından bu yöntem genellikle yalnızca bir alt kümesini bir oosit yaklaşık çapı tarafından ayrılan bölümler puanlama gerektirir çünkü yanlışlık için eğilimli olduğunu. Burada, bir iletişim kuralı yerine tüm organ doku takas ve köklerinin ve yumurta görselleştirmek için fare yumurtalık ayirt boyama kullanan açıklanmıştır. Daha geleneksel yaklaşımlar, bu iletişim kuralını yumurtalık hücrelerde çok sayıda nedenlerle görselleştirme için avantajlı karşılaştırılır: 1) yumurtalık numune hazırlama ve işleme; bozulmadan kalır 2) bölüm için zor olan küçük yumurtalıkların, kolaylıkla incelenebilir; 3) hücresel miktar daha kolay ve doğru bir şekilde elde edilir; ve 4) yansıma tüm organ.
Giriş
Hücresel kompozisyon ve memeli yumurtalık morfolojik özelliklerinin çalışması için bilim adamları çoğunlukla parafin gömülü yumurtalık immunohistological boyama tarafından takip vivo deneyler kullanır. Son zamanlarda tüm yumurtalık organı kültür tekniği daha iyi görselleştirme ile birleştiğinde olabilir çünkü yumurtalık işlev1,2,3,4 çalışma için etkili bir alternatif olduğu ispatlanmıştır rağmen daha fazla ve miktar araçları. Geleneksel olarak, yeniden inşa üç boyutlu yumurtalık mimari gömülü parafin seri bölümlerden ama zahmetli ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Cornell Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) burada, JCS iletişim kuralına 2004-0038 altında açıklanan tüm yöntemleri onayladı.
1. hazırlanması kültür ortam ve aygıtlar
- Çalışma alanı % 10 çamaşır suyu ile temiz ve en az 5 min için çalışma alanı yüzeyinde kalır çamaşır suyu izin silin. 5 dk sonra fazla çamaşır suyu temiz kağıt havlu ve % 70 etanol (alkol) ile kaldırın. % 70 ile iyice diseksiyon mikroskop temiz alkol.
Not: Bu çalışma alanının en az yarı steril organ kültürlerin kirlenmesini önlemek için önemlidir. - Şal temiz forseps ve makas % 70 ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu ile alkol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu iletişim kuralı 6 önemli adımları içerir diseksiyon yumurtalıklar, şekil 1' de özetlenen takip. Resim 2 , Şekil 3 , Şekil 4 optimizasyonu yumurtalıklar ve FIJI-ImageJ kullanarak tüm doku oosit miktar için Temizleme doku dahil en yeni şekil-in bu protokolü. Şekil 2A (sağ
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Memeli üreme çalışma kullanarak ve hücre kültürü için rutin olarak mükellef olmayan özel hücreler miktarının gerektirir. Ancak, ex vivo kültür sistemleri yumurtalık ve folikül canlılık1,15Bakımı etkilidir. Yumurtalık kültür sırasında doku Difüzyon yoluyla besin alışverişini için geniş bir yüzey alanı gerektirir. Bu nedenle, yumurtalık boyutunda idealdir ve şekil organ kültür için 5 - gün eski fare. Bu iletişim kuralı yumurtalık kültür yedi gün boyunca mu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Biz Rebecca Williams ve Cornell BRC görüntüleme Johanna Dela Cruz ve Andrew Recknagel yararlı öneriler ve teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Sağlık grant Enstitüleri için desteklenen S10-OD018516 (için Cornell tesis görüntüleme), T32HD057854 J.C.B. için ve R01-GM45415 J.C.S. için
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Mikro diseksiyon makası 4.5", düz, keskin noktalar | Roboz | RS-5912 | Mikro diseksiyon makası |
| Kuyumcular tarzı forseps 4-3/8", stil 5 | Integra Miltex | 17-305X | İnce uçlu forseps |
| Mikro İris Makası 4", düz, keskin noktalar | Integra Miltex | 18-1618 | Mikro diseksiyon iris makas veya mikro diseksiyon yaylı makas |
| 1X Minimal Temel Medya (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Sığır Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiyotik-Antimikotik (100X) | 1.3.1'de Kullanılan | Gibco | 15240062 |
| 35mm Doku Kültürü Uygulanmış Çanak | Corning | 430165 | |
| Nunc&ticaret; Hücre Kültürü Ekleri için 24 Kuyulu Taşıyıcı Plaka | ThermoFisher Scientific | 141006 Gözenek boyutu: 8μ m | |
| Paraformaldehit (PFA) | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | %16 çözelti |
| 1X Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutatör karıştırıcı GyroTwister & trade; | Labnet | S1000-A-B | üç boyutlu çalkalayıcı |
| Normal Keçi Serumu | VWR | 103219-578 | |
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodyum Azid (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodyum borhidrür çözeltisi (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | yerine çözeltiyi kullanın. tablet veya toz form |
| Polivinil Alkol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Soğuk suda çözünür |
| Triton ve ticaret; X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polietilen glikol tert-oktilfenil eter |
| Şırınga filtreleri | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Şırıngalar | BD | 309695 | |
| Fare anti-p63 antikoru (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Seyreltme 1:500 |
| Tavşan anti-MVH antikoru | Abcam | ab13840 | Seyreltme 1:600 |
| Alexa Fluor® keçi anti-fare 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Seyreltme 1:1000 |
| Alexa Fluor® keçi anti-tavşan 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Seyreltme 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Gliserol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Üre | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Görüntü işleme yazılımı | ||
| Tek kullanımlık plastik transfer pipetleri | VWR | 414044-034 |
Kaynaklar
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
