Yöntem makalesi

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

DOI:

10.3791/57653

⸱

8 Haziran 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Bristol Medical School, Translational Health Sciences, University of Bristol

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çift iplikçikli tatili (DSBs) DNA tamiri oluşumu ve kararlılık-in çok protein onarım kompleksleri gerektiren son derece koordineli bir süreçtir. Bu işlem sayısız Dernek teşvik protein ve protein bu lezyonlar için ayırma tarafından düzenlenmiştir. Büyük ölçüde geniş bir kütüphane proteinlerin fonksiyonel ekranları gerçekleştirme olanağı sayesinde, iki iplikçikli DNA sonu tamiri için gerekli genler daha büyük bir takdir. İnhibitörü kez nakavt veya kimyasal ekranlarında proteinlerin tamir süreçlerinde yer alan kalem DSB onarım için gerekli olan bir protein için artan toksisite kullanarak tanımlayın. Tanımlayıcı roman hücresel proteinler genom sadakat korunmasında yer için yararlı olmasına rağmen fonksiyonel analiz olup faiz protein yerelleştirme, oluşumu veya onarım kompleksleri çözünürlüğü teşvik belirlenmesi gerekir.

Onarım proteinleri birikimi kolayca farklı nükleer foci ayirt mikroskobu tarafından tespit edilebilir. Böylece, dernek ve bu proteinler DNA hasarı sitelerdeki ayırma bu nükleer foci temsilcisi aralıklarla çift iplikli kırılmalara DNA indüksiyon sonra gözlemci tarafından erişilebilir. Onarım hataları tamir eksik gecikmeler ile aynı anda gerçekleşmez ise bu yaklaşım de yanlış yerelleştirilmiş onarım faktör proteinler, tanımlayabilir. Bu senaryoda, uzun süreli iki iplikçikli DNA kırılmalar nadir kesme endonükleaz (Örneğin, SCEI) ifade ederek nerede tanıma site dedi enzim için hücresel genom entegre edilmiştir hücrelerdeki mühendislik. Elde edilen bu lezyon özellikle sadık onarım enzim tanıma sitesi, dekolte bir tur isteyen reintroduce çözmek zordur. Sonuç olarak, onarım kinetik farklılıkları ortadan kalkar. Onarım kompleksleri oluşur değil ise, yerelleştirme engelledi. Bu iletişim kuralı onarım kinetik hem de onarım protein yerelleştirme değişiklikleri tanımlamak gerekli yöntemleri açıklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her gün, insan vücudundaki her hücre bir tahmini 10.000 ile alı DNA lezyonlar1. Bu tehdit bize mutasyonlar, oncogenesis gibi hücre riski koyar ölüm. Genom sadakat korumak için memeli hücreleri DNA hasarı protein dernekler ve değişiklikler karmaşık bir dizi ile yanıtlamak için evrim geçirmiş. Bu yanıtı birden çok yolları, topluca bilinen DNA hasarı yanıt (DDR)2,3düzenlenmiştir. DDR DNA onarım proteinler, DNA lezyonlar, geçici ve dağınık şekilde koordine birikimi oluşur. DDR sık yayma veya hasarlı DNA2,4,5çoğaltma işlemi sırasında oluşabilecek hasar yoğunlaştırılması önlemek için hücre döngüsü tutuklama neden olmaktadır. Buna karşılık, aynı zamanda hücre döngüsü tutuklama onarım tamamlandıktan sonra onarım kompleksleri kesilmesi açmak hücresel canlılık için gereklidir.

Çeşitli DNA hasarı arasında DSBs en zararlı türleridir. DSBs onarmak için hata kromozom düzenlemeler veya kaybı gibi büyük ölçekli silme tüm kromozom silah neden olabilir. DSBs tamiri iki yolları6,7,8ayrılmıştır. Homolog rekombinasyon (HR) gerektirir bir kardeş kromozom DNA şablon olarak kullanmak ve böylece geç S ve G2/M hücre döngüsü9,10için aşama sınırlıdır. Sigara homolog sonunda (NHEJ) katılmadan bu kısıtlamalar yoktur ancak küçük silme DSBs11,12tamirinde neden olabilir.

DSB onarım özellikle ve DDR genel olarak soruşturma etkin alanı vardır. Elverişli bir konuma sahip ayrılmış yollar organize rağmen büyük bir fazlalık var. Gerçekten de, birçok protein (BRCA1, BRCA2 ve örneğin karmaşık RPA) birden çok yolları13,14,15,16' söz konusu. Tarafından bir yolu, bir lezyonu tamiri için başka bir yolu14tarafından onarılması bir hasar ara yol açabilir. Zaman gerekli, kesin miktar için doğru yere doğru protein alımı onların karmaşık bir görev ile birlikte bu yollar intertwining çok katmanlı bir yasal işlem gerektirir.

Bir rapora DDR inceliklerini onarım karmaşık oluşumu, çözünürlük ve yerelleştirme her ayrı olarak Engelli17olabilir göstererek vurgulamaktadır. Aşağıdaki protokol genel yetenek hücre DSB onarmak için kesin olarak incelemek için hedeftir. Ayirt mikroskobu kullanılarak, sitelerde hasar onarım proteinlerin birikimi DSBs indüksiyon takip temsilcisi zaman noktalarda görüntülenmeyecektir.

Bu teknik yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar için birçok avantajı vardır. Sık sık, onarım incelenen tek zaman noktalarda ve derleme dinamik bir süreç ve onarım kompleksleri ayrışma temsil eden aciz. İlk harekete geçirmek gelen onarım dolu kararlılık için tam kapsamlı gözlem onarım gecikmeden tam inhibisyon tanımlanmış değil sağlar. Diğer taraftan, dedi yanıt devre dışı bırakma için bir onarım yanıt indüksiyon normal ya da aşırı harekete geçirmek tanımlanmış değil garanti eder.

Gecikmeli protein kompleksi oluşumu ve onarım proteinlerin mis yerelleştirme ancak, belirsizliğe yer bırakmadan bu yaklaşım ile ayırt edilebilir değil. Onların yerelleştirme gecikmeli onarım proteinler karşı yanlış lokalize olup olmadığını belirlemek için hücresel DNA enzimatik bölünme bir "uzun ömürlü" DSB tanıttı olabilir. Elde edilen bu lezyon, farklı büyük nükleer onarım odakta kaynaklanan ve zamansal kısıtlama işe kaldırma onarılana her zaman yüreği. Bu uzun ömürlü DSB ikna etmek için bir nadir kesme endonükleaz (Örneğin, SCEI) kullanımı ile mevcut yaklaşım değiştirerek elde edilebilir. DSBs uzun ömürlü ayirt mikroskobu tarafından zor tamir proteinlerin görselleştirme sağlar. Gelişmiş bereket da algılama sınırlama antikor kalitesinde az çalışılmış proteinler DNA tamiri üzerinde bir etkiye sahip olarak tanımlanan zaman yararlı olabilir bir özelliği tarafından engel görselleştirme artırmak.

Özellikle, bir ücretsiz görüntü işleme ve analiz yazılımı (Örneğin, ImageJ) için açık yönergeler sağlar. Bu DNA hasar tamiri daha geniş bir kitleye sorgulama açılış görüntü analizinde büyük bir finansal engelini ortadan kaldırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lütfen dikkat, bu iletişim kuralı bir ben-SCEI tanıma sitesi18içeren U2OS hücreler için bulunmakta. Hücreleri U2OS olması gerekmez ama ben-SCEI sitenin içermesi gerekir. Protokol ayarlanmış (Örneğin, numaralı seribaşı hücreleri ve kuluçka süreleri sayısı) olması gerekebilir kullanılan hücre türüne bağlı olarak.

1. kinetik DSB onarım karmaşık oluşumu tanımlama

  1. U20-DRGFP hücreleri 10 cm doku kültürü tabakta 85-%90 kadar konfluent büyümek.
  2. Medyayı çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) EDTA 3 ml 2 min için kuluçkaya.
  3. Tripsin ile 1 mL EDTA değiştirin ve 5 dk. hücreleri mikroskop altında görüntüleyerek plaka yüzeyinden ayrılır sağlamak için 37 ° C'de kuluçkaya. Tripsin 5 mL, Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM) ile nötralize.
  4. Bir hemasitometre ve trypan mavi dışlama yöntemi kullanarak bu süspansiyon hücre konsantrasyonu belirlemek.
  5. 6 x 103 hücreleri/iyi bir cam alt 96-şey plaka 200 µL'tohum. Alternatif olarak, tohum 4 x 10 8 mL 12 mm coverslips üzerinde6 hücrelerde bir 10 cm tabak içinde yerleştirilir.
    Not: Her şey veya coverslip denetimi de dahil olmak üzere bir seferinde noktasını temsil eder.
  6. Gece saat 37 ° C ve % 5 CO2hücrelerin büyümesine.
  7. DSBs inducing
    1. H2O2 DMEM + % 10 ile 25 µM bir konsantrasyon için seyreltilmiş 96-şey plaka/10 cm çanak medyadan yerine FBS ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. 3 x 1 x PBS ile ve eski yerine koymak ile taze DMEM % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş hücreleri yıkayın. Kuluçkaya hücreleri 37 ° C için 0, 1, 4, 8, 24 ve 48 h. H2O2 taze dilutions her deneme için kullanılan emin olun.
      Not: burada kullanılan H2O2 konsantrasyon hücreleri öldürmek önlemek için öyle ki yeterince hücreleri toplu apoptozis ve yaşlanma önlemek olacaktır hasar doz düşük olduğundan emin olun. Kurtarma işleminin gözlemlemek için önemlidir. Bu en iyi duyarlılık doz aralığına ölçerek elde edilir. Bir ÇMT tahlil veya diğer hücre canlılığı tahlil kullanılabilir hidrojen peroksit en az konsantrasyonu belirlemek için gerçekleştirin.
  8. Sabitleme ve hücre permeabilizing
    1. Hücreleri 3 kez 1 x PBS ile yıkayın. 10 cm plaka her zaman için bir coverslip kaldırmak ve tamir için bir 24-şey plaka tek bir kuyu yerleştirebilirsiniz. İğne ve forseps dikkatle coverslip ve hücreleri coverslip yüzey dışına kaşıma kaçınarak kaldırmak için kullanın.
    2. Düzeltme kere 1 h H2O2 pozlama ve taze DMEM yerine (0, 1, 4, 8, 24 ve 48 s) sonra hücrelerin % 4 paraformaldehyde (PFA) ile 15 dakika, kuluçka tarafından belirlenmiş.
    3. Sabit coverslips 3 kez PBS ile yıkayın. 1 x PBS içinde seyreltilmiş %0,5 non-iyonik deterjan ile hücreleri permeabilize. 15 dakika, RT, 3 x PBS ile yıkama önce kuluçkaya.
      Not: permeabilization sonra coverslips en az bir hafta için 4 ° C'de PBS içinde olası saklanmasıdır.
  9. Karmaşık görsel öğeyi onar
    1. 96-şey plaka/coverslips %3 Sığır serum albumin (BSA) ve %0,1 non-iyonik deterjan 1 x PBS içinde seyreltilmiş bir çözümde engellemek (% 3 BSA çözüm) RT. 1 h için
    2. Onarım protein % 3 BSA çözüm RT, 1 h için üreticinin belirtimlerine göre daha önce 3 kez 1 x PBS ile yıkama seyreltilmiş ilgi hedef birincil antikorlar ile kuluçkaya.
    3. 96-şey plaka/coverslips %3 BSA çözüm üreticinin protokolüne göre seyreltilmiş ikincil antikor ile kuluçkaya. İkincil fluorophores örtüşen uyarma veya emisyon spectra var mı onaylayın.
    4. PBS 3 kez hücrelerle yıkadıktan sonra DAPI, 1 x PBS üreticinin belirtimlerine göre seyreltilmiş ekleyin ve 5 min için RT kuluçkaya.
    5. Coverslips montaj Ajan, hücre-yan yüzleri aşağı emin bir damla ile slaytlar üzerine monte. Coverslips dikkatle basın ve herhangi bir aşırı montaj Ajan bir bezle ıslatın.
    6. Hızlı kuruyan şeffaf oje ile coverslips mühür ve coverslip slayt ile tam bir mühür emin olun.
    7. Confocal mikroskop görüntüler önyargı deney tanıtımı önlemek için diğer kanallar (ile DNA onarım gen ilgi sinyalleri) önce DAPI kanal üzerinde odaklanarak tutar.
    8. Alternatif olarak, görüntüleri Z-istenen bölge bölümlerini alarak ve tüm tespit foci görselleştirmek için tek bir uçağı görüntü yoğuşmalı elde edilebilir.
      Not: DSB çözünürlük veya protein ilgi seçilen zaman noktalarda görülmektedir değil, ne zaman DSBs zaman puan geniş bir başlangıçta seçerek çözmek belirleyin (0 – 48 h DSB indüksiyon sonrası). Zaman ilgi DSB indüksiyon yöntemi ve onarım protein ilgi tarafından değişir.
  10. Ücretsiz ImageJ yazılım çekirdeklerin ayirt mikroskobu Albümdeki tanımlamak için kullanın.
    Not: mikroskop görüntüleri açmak için Bio-biçimleri eklenti ImageJ içinde yüklü olmalıdır.
    1. Resim dosyasının ImageJ penceresine sürükleyerek veya "Biyo-biçimleri ithalatçı" seçerek ImageJ "Eklenti" araç çubuğundan açmak confocal görüntüleri (.czi veya .tif).
      Not: "Biyo-formatları içe aktarma seçeneği" pencere-ecek gözükmek.
    2. "Bölünmüş görüntü bünye DAPI ve floresan görüntüleri"Biyo-formatları içe aktarma seçeneği"penceresi içinde içine bölmek için kanallar" seçin.
    3. "Colorized" "Renk seçenekleri" açılır menüsünden seçin. Seçin "Tamam" DAPI açıp histon H2AX (H2AX) görüntüler olarak ayrı windows ve DAPI resim seçin.
    4. Çekirdeklerin seçmek için "Eşik ayarlamak" seçeneği ve "Görüntü" araç çubuğunu seçin.
      Not: "Eşik" pencere-ecek gözükmek.
    5. Görüntü eşik "Eşik" penceresinin alt bar tamamen sağa doğru kaydırarak ayarlayın. Çekirdeklerin tamamen farklı özetliyor ve arka plan siyah ile kırmızı görününceye kadar üst çubuğunda ayarlayın. Seçmeyin uygulamak. "Eşik ayarlamak" penceresini kapatın.
    6. "Analiz" araç çubuğu ve "Parçacıklar analiz" seçeneğini seçin. Ekranda görünen bir "Parçacıklar analiz" penceresini görebilirsiniz.
    7. Bir çekirdek en küçük boyutunu girin.
      Not: Parçacıklar sunucularımıza boyutu aşağıda çekirdek sayılmayacaktır.
    8. "Göster" açılan menüsünden "Ana hatlarıyla" seçin. "Yöneticisi Ekle" seçeneğini seçin. Bir "ROI Yöneticisi" penceresini açmak için "Tamam" düğmesini tıklatın.
      Not: Ana hatlarını çekirdekleri ve ayrı bir pencerede görünür.
    9. "ROI Yöneticisi" penceresinden seçilebilir çekirdeklerin numaraları atamak.
  11. ImageJ H2AX foci ayirt mikroskobu görüntülerde ölçmek için kullanın.
    1. (Fluorescently konjuge ikincil antikor ile lekeli) "H2AX" foci pencereyi seçin. Ardından "Süreci" araç çubuğunu seçin ve "Maxima çekirdeklerin içindeki resimde bulmak için bul" seçin.
      Not: "Maxima bulmak" penceresi açılacaktır.
    2. "Çıktı türü" açılan menüsünden "Tek nokta" seçeneğini seçip "Önizleme noktası seçimini" seçin maxima/foci görselleştirmek için. Resim (resim 1) Floresan yoğunluğuna bağlı olarak bir "Gürültü hoşgörü" değeri girin. Küçük siyah noktalar ile beyaz pencerenin görünümünü denetlemek.
      Not: Bu noktalar H2AX foci/maxima algılanmış temsil ediyor. Gürültü tolerans değeri analiz ediliyor tüm resimler için sürekli muhafaza edilmelidir. Düşük/yüksek gürültü hoşgörü çok çok/az maxima (resimde) çekirdek içinde tasvir ve çekirdek içinde foci bir doğru bir şekilde temsil olmayacaktır.
    3. Kendisi için H2AX foci için "ROI Yöneticisi" penceresinden sayısal gerekir çekirdeği seçin. Tüm çekirdeği "tümünü göster" seçeneğini işaretleyerek seçin.
    4. "Maxima/foci seçili hücre çekirdeği içinde sayısını ölçmek için ölçü birimi" seçin.
      Not: Maxima/foci sayısı 255, yanikatları görünür, bir en fazla 255 bir "RawIntDen" (entegre yoğunluk) okuma vardır.
    5. "RawIntDen" değerlerini kopyalayın ve veri analizi için yazılım içine yapıştırın.

2. uzun süreli iki iplikçikli DNA mola için yerelleştirme analiz

  1. Tohum hücreleri 96-şey plakaları/coverslips açıklandığı gibi bölümlerde 1.1 ve 1.2 üzerinde.
  2. Çift iplikli kırılmalara DNA indüksiyon
    1. Üreticinin belirtimlerine göre lipid tabanlı transfection reaktif kullanarak-SCEI ifade vektör ile hücreleri transfect. 24-72 h transfection sonra endonükleaz ifade en üst düzeye çıkarmak için bekleyin. Transfection tekil büyük nükleer γ-H2AX odak içeren hücreleri bularak başarılı olup olmadığını belirlemek.
  3. Görüntüleri edinimi
    1. Tamir, permeabilize, engellemek ve 96-şey plaka/coverslips 1.8 bölümünde açıklandığı gibi yıkayın.
    2. Bir antikor γ-H2AX ve onarım protein ilgi karşı hücrelerle birlikte kuluçkaya (burada, birincil bir antikor RAD51 karşı % 3 BSA çözüm üreticinin belirtimlerine göre seyreltilmiş kullanılmıştır).
    3. 96-şey plaka/coverslips 3 kez 1 x PBS ile yıkayın. 96-şey plaka/coverslips %3 BSA çözüm üreticinin protokolüne göre seyreltilmiş ikincil antikor ile kuluçkaya. İkincil fluorophores örtüşen uyarma veya emisyon spectra var mı onaylayın.
    4. Bir büyük nükleer γ-H2AX odak içeren hücreleri tanımlamak. Sadece önyargı önlemek için bu hücreleri resimlerini çekmek.
  4. Uzun süreli ben-SCEI analizini foci indüklenen
    1. Uzun süreli foci el ile her iki büyük γ-H2AX foci ve ortak yerelleştirilmiş foci ilgi onarım proteinin hücre sayısını sayarak analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 ImageJ kullanarak maxima/foci miktar için doğru gürültü ayrımcılığı yelpazesi gösteriyor. Sol panelde DAPI birleştirilmiş görüntüleri ve faiz onarım protein vardır. Şekil 1A gürültü ayrımcılığı 90 gösterir ve foci doğru sayıda işaretler. Çekirdek (pembe bir okla tasvir) kenar ve foci (sarı bir ok ile tasvir) çekirdeği dışında sırasında miktar sayılmaz. Şekil 1B 50 düşük gürültü hoşgörü göster...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA analizi zarar onarım genel ve temel biyoloji6,20tumorigenesis sonuçları span çünkü çift iplikçikli DNA sonları tamiri özellikle etkin araştırma alanıdır. Bu el yazması Ayrıntılar doğru RAD51 ve γ-H2AX proteinleri DSBs saatlik seyir ileri, bu yöntemi yoluyla çözümlenmesi için katkısını dissects bir yaklaşım DSBs14onarım proteinlerin ek işlevler aydınlatmak için kullanılabilir. Onarım kinetik karşılaştırılması ve onarım makineleri kontro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Joel Sanneman ve Dr Philine Wangemann tarafından Kansas State Üniversitesi Veteriner Tıp Fakültesi, çabaları bu tekniği geliştirmek için destek için finanse Confocal mikroskobu çekirdek, teşekkür ederim. pCBASceI Maria Jasin (Addgene plazmid # 26477) bir hediye oldu 30. U2OS DR-GFP hücreleri Maria Jasin18tür bir hediyeydi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12 mm LamellerVWR89015-725
%16 Paraformaldehit (PFA)ThermoFisher Scientific28908
24 oyuklu plakaVWR82050-892
96 oyuklu cam alt plakaCellvisP96-1.5H-N
Anti-H2AX Alexa488EMD Kırlangıç05-636-AF488
Anti-Rad51 (D4B10) Hücre Sinyalleme Teknolojisi8875S
Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH)için biyo-format eklentisihttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
Sığır Serumu Albümini (BSA)VWR97061-416
DAPIThermoFisher ScientificD1306
DMEM, Yüksek GlikozluThermoFisher Scientific12100046
EDTAInvitrogen15576-028
Fetal Sığır Serumu (FBS)VWR89510-194
Keçi Anti-Tavşan IgG Alexa594ThermoFisher Scientific  A-11012 
Hidrojen Peroksitsigma-Aldrich216763-100ML
ImageJ YazılımıUlusal Sağlık Enstitüsü (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
I-SceI İfade VektörüAddgene26477
Oje- Insta DriSally ve HansenAçıkça Hızlı (103)
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Bio BasicPD8117
ProLong Altın Antifade ReaktifiYaşam TeknolojileriP36930
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Tripsin-EDTASigma-AldrichT4049-500ML
TurboFect Transfeksiyon ReaktifiThermoFisher ScientificR0531
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
ImageJ  

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  2. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
  3. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  4. Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
  5. Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
  6. Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
  7. Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
  8. Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
  9. Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501(2011).
  10. Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9(2012).
  11. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  12. Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
  13. Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
  14. D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
  15. Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
  16. Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
  17. Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
  18. Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
  19. Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
  20. Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
  21. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687(2015).
  22. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
  23. Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957(2010).
  24. Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617(2017).
  25. Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
  26. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
  27. Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
  28. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237(2015).
  29. Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ift Zincir K r lmalarOdak Olu umuProtein LokalizasyonuI SceI EkspresyonuGamma H2AXKonfokal MikroskopiImageJ AnaliziKolokalizasyon Deneyi

İlgili makaleler