Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

8.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57664

⸱

13 Haziran 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth, 3Department of Musculoskeletal Oncology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4Women's Health Institute, Cleveland Clinic Foundation, 5Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for the Prevention of Human Diseases, The University of Texas Health Science Center at Houston, 6Center for Precision Health, School of Biomedical Informatics and School of Public Health, The University of Texas Health Science Center at Houston

Bu makalede

Özet

Burada, bir protokol indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretimi için Li-Fraumeni sendromu (LFS) hasta türetilmiş fibroblastlar, iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) yoluyla farklılaşma üzerinden dokusunu ve modelleme içinde vivo mevcut LFS hasta kaynaklı dokusunu kullanarak tumorigenesis.

Özet

Li-Fraumeni sendromu (LFS) bir otozomal dominant kalitsal kanser hastalıktır. LFS hastalarda tümör, osteosarkom--en sık birincil olmayan hematolojik maligniteler çocukluk ve ergenlik de dahil olmak üzere çeşitli tür yatkındır. Bu nedenle, LFS bu malignite eğitim için ideal bir model sağlar. IPSC yöntemlerden yararlanarak osteosarkom LFS ilişkili başarılı bir şekilde örnek alınarak LFS hasta iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) ve ardından dokusunu--menşei osteosarkom hücreleri ayırt tarafından. Bu LFS dokusunu osteosarkom, osteosarkom patogenezinde operasyona için bir çekici model sistemi sağlayan oncogenic özelliklerini özetlemek. Bu el yazması bir protokol LFS hasta fibroblastlar, farklılaşma MSCs, MSCs farklılaşma dokusunu ve LFS dokusunu kullanarak vivo içinde tumorigenesis için iPSCs dan iPSCs üretimi için gösterir. Bu IPSC hastalık modeli potansiyel biyolojik veya LFS ilişkili osteosarkom için tedavi hedefleri tanımlamak için genişletilebilir.

Giriş

2006 ve 2007 arasında laboratuvarları Drs. Shinya Yamanaka ve James A. Thomson birkaç atılım bulgular indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs)1,2,3gelişmesine yol açtı. Somatik hücre formu iPSCs için tanımlanmış transkripsiyon faktörleri ile yeniden programlama tarafından araştırmacılar yani anahtar özelliklere sahip hücreleri elde edebilecektir, Nanog ve daha önce sadece için düşünüldü kendini yenileme, insan embriyonik kök hücre var (hESCs). iPSCs herhangi bir birey ya da hasta oluşturulabilir ve embriyo, büyük ölçüde elde edilebilir hastalıklar ve arka planlar çalışma için repertuar genişleyen türetilen gerek yoktu. O zamandan beri iPSCs hasta kaynaklı çeşitli insan hastalıkları, Alzheimer hastalığı4 ve amyotrofik lateral skleroz5 uzun QT sendromu6,7, fenotip özetlemek için kullanılmıştır 8.

Bu gelişmeler IPSC araştırma Ayrıca kanser araştırmaları için yeni yollar açtı. Çeşitli gruplar son zamanlarda bugüne osteosarkom9gösterdiği başarılı uygulama modeli kanser geliştirme altında bir duyarlı genetik arka plan9,10,11, hasta iPSCs kullanmış, Lösemi10,11,12ve kolorektal kanser13. IPSC kaynaklı kanser modelleri hala onların bebeklik olmakla birlikte, patolojik mekanizmalar elucidating ve terapötik bileşiklerin14tanımlayan phenocopying maligniteler, hastalık ilişkili büyük potansiyel göstermiştir.

Li-Fraumeni sendromu (LFS) TP53 germline mutasyon15tarafından neden olduğu bir otozomal dominant kalitsal kanser hastalıktır. LFS hastalarda osteosarkom, dahil olmak üzere maligniteler çeşitli bir tür LFS iPSCs ve türetilmiş hücrelerine özellikle iyi bu malignite16eğitimi için uygun hale yatkındır. LFS hasta kaynaklı iPSCs9 daha sonra kullanarak Ayrıştırılan mezenkimal kök hücre (MSCs) ve sonra kaynaklanan dokusunu için hücreleri bir IPSC tabanlı osteosarkom modeli ilk 2015 yılında kuruldu osteosarkom. Bu LFS dokusunu Osteojenik farklılaşma osteosarkom ilişkili kusurlar ve oncogenic özellikleri, bir "bir tabak içinde kemik tümörü" platform olarak potansiyel modeli gösteren özetlemek. İlginçtir, genom-wide transcriptome analizleri bir osteosarkom gen İmzada LFS dokusunu yönlerini açığa vurmak ve bu şekil-in bu LFS gen ifade profil osteosarkom9, kötü prognoz ile ilişkili gösteren LFS iPSCs hastalık modelleri potansiyelini klinik özellikleri ortaya çıkarmak için.

Bu el yazması LFS hasta kaynaklı iPSCs modeli osteosarkom için kullanmak hakkında ayrıntılı bir açıklama sağlar. LFS iPSCs, iPSCs MSCs ve dokusunu için sonra farklılaşma ve LFS dokusunu kullanarak bir in vivo xenograft modeli kullanımı nesil ayrıntıları. LFS hastalık modeli birçok avantajı, özellikle mekanik çalışmaları, biyomarker teşhis ve ilaç9,14eleme için her aşamasında osteosarkom gelişme sınırsız hücreler oluşturma yeteneği oluşur, 16.

Özetle, LFS osteosarkom IPSC tabanlı modeli osteosarkom araştırma ilerlemek için çekici bir tamamlayıcı sistem sunar. Bu platform da bir kanıtı-of-concept hasta kaynaklı iPSCs kullanarak kanser modelleme için sağlar. Aşağıda açıklanan bu strateji modeli maligniteler kanser eğilimlerin ile diğer genetik bozuklukları ile ilişkili için kolayca genişletilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu eser Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Houston (UTHealth) hayvan refahı Komitesi tarafından kabul edildi. Deneyler ile laboratuvar hayvan Tıp & bakım (hangi Amerikan Derneği tarafından akredite olmuştur laboratuvar (AAALAC International) için hayvan bakım CLAMC) için UTHealth Merkezi tarafından belirlenmiş standartlara sıkı uygun olarak gerçekleştirilir. Bu çalışmanın insan denekler bir ("Hayır insan konularda araştırma") senaryosunda NIH SF424 belgeleri tarafından tanımlandığı gibi düşmek. Bu nedenle, UTHealth insan Araştırma Etik Komitesi tarafından herhangi bir onay gerektirmez.

1. nesil LFS iPSCs (Şekil 1A)

  1. -2 günde 2 x 104 LFS hasta fibroblastlar 6-şey plaka bir kuyunun içine plaka ve fibroblast Orta (Tablo 1) içeren hücreleri oksijen %5 37 ° C'de kültür CO2 kuluçka makinesi. Fibroblastlar iletim (0 gün) günde % 50-60 izdiham ulaşmak emin olun.
  2. Sendai virüs iletim gün 0 gerçekleştirin. Bunu yapmak için önceden ısıtılmış fibroblast orta ile harcanan orta yerine. Virüs yeniden programlama kiti ( Tablo malzemelerigörmek) buz üzerinde ticari Sendai çözülme. LFS fibroblastlar üretici yönergelerine göre karışık Sendai virüs ile enfekte.
  3. Bakım transduced hücre fibroblast Orta (gün 1-6):
    1. Günde 1, 24 h iletimi sonra kalan Sendai virüs içeren fibroblast orta kaldırın ve 2 mL taze fibroblast orta ile değiştirin. Oksijen %5 37 ° C'de transduced fibroblastlar kültür CO2 kuluçka makinesi.
    2. Fibroblast orta ile Orta 2-6 günden beri her gün değiştirin.
  4. Bakım transduced hücre besleyici kültür koşulu (7-28 gün):
    1. Radyasyonlu CF1 fare embriyonik fibroblast (MEF) kültür yemekleri gün 6 hazırlamak. Bu kat yapmak kaplama sonra % 0,1 jelatin altı 100 mm doku kültürü yemekleri her plaka, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 5 mL %0,1 jelatin ekleyerek Aspire edin.
    2. MEFs sıvı azot kapsayıcıdan kaldır. Üreticinin yönergelerini izleyerek ticari olarak mevcut çözülme sistemi kullanarak MEFs çözülme. Hücreleri jelatin kaplı plakalar üzerinde bir tohumlama yoğunluğu 6.7 x 100 mm doku kültürü çanak başına 105 hücre çevresinde, MEF/MSC kültür orta (Tablo 1) plaka.
    3. MEF plakaları (7 gün) transduced hücreleri aşılamak: 1 mL % 0.25 kullanarak transduced hücre Trypsinize tripsin-EDTA 100 mm çanak için oda sıcaklığında 2-4 dakika başına. Tripsin fibroblast orta 9 mL ile etkisiz hale getirin. Konik tüpler hücrelere transfer ve santrifüj hücreleri vasıl 230 x g 4 dk. 37 ° C'de gün 6 tarihinde hazırlanan altı MEF yemekleri transduced fibroblastlar plaka ve onları fibroblast orta çanağı başına 8 ml kültür.
      Not: MEFs confluency % 20 transduced hücre MEF plakalar üzerinde tohum önce civarındadır.
    4. Günde 8, fibroblast orta atmak ve hESC Orta (Tablo 1) ile değiştirin.
    5. Gün 9-28 IP'leri klonlar (Şekil 1C) ortaya çıkması için bekleyin. İzlenme hESC orta her gün değiştirin ve IPS klonlar mikroskop altında ortaya çıkması izlemek. İPSCs klonlar çıplak gözle uyması gereken büyük gözlemek ve IPS klonlar besleyici-Alerjik kültür durumda genişletmeye devam edin.
  5. Ortaya IP'leri genişlemesi klonlar besleyici-Alerjik kültür durumda (gün 29-79 ~ 99):
    1. Matris kaplı plaka hazırlamak için çözümün membran matris kaplama (Tablo 1) iyi başına 120 µL 48-şey plakalı kat. Membran matris kaplama çözüm de kapsar ve kültür çanak yüzeyi kat emin olun. Kaplama çözüm kullanımdan hemen önce oda sıcaklığında 1 h. aspiratı için bırakın ve hESC Orta 2 µM ROCK inhibitörü Thiazovivin iyi başına 250 µL ekleyin.
    2. Gün 28 izlenme hESC orta Aspire edin ve IPS klonlar 1 x DPBS ile yıkayın. 1 mL pipet ucu ve tedavi 48-şey plaka (adım 1.4.1) bir kuyuya transferi ile görünür IP'leri klonlar almak. 48-şey plaka kuyu başına tohum bir koloni.
    3. Plaka vasıl 230 x g hücre eki kolaylaştırmak 4 dakika santrifüj kapasitesi. Kültür IP'leri klonlar oksijen %5 37 ° C'de CO2 kuluçka makinesi.
    4. Ertesi gün (gün 29), harcanan hESC orta kaldırın ve ticari olarak mevcut IPSC orta 250 µL her kuyuya ekleyin.
    5. IPS klonlar oksijen %5 37 ° C'de korumak CO2 kuluçka ve değişim IPSC orta her geçen gün.
    6. IPS klonlar % 85 izdiham ulaştığınızda, bir 1:10 at alt kültür hücreleri kültür alanına göre oranı. 60 µL hücreleri ayırmak ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya ticari passaging çözüm ekleyin.
    7. Bir membran matris kaplı 12-şey plaka hESC Orta 2 µM ROCK inhibitörü Thiazovivin ile 1 ml üzerinde müstakil iPSCs yarısı tohum. Kültür IP'leri klonlar bir 12-şey plaka ile piyasada bulunan IPSC orta iyi ve alt kültür iPSCs başına 1 mL 1:10, geçit 10 ulaşana kadar oranı.
      Not: iPSCs 5-7 günde bir 1:10 kültürlü alt vardır oranı. IPS klonlar geçit 10 ulaşmak 10 haftaya kadar sürer. IPSC karakterizasyonu hücre morfolojisi, alkalen fosfataz (AP) aktivite ve pluripotency faktörler ve hESC işaretleri, ifadesi de dahil olmak üzere (genellikle yaklaşık 10'dan sonra gösterdi iPSCs Sendai virüs kaldırılması onayladıktan sonra incelenebilir pasajlar) (Şekil 1B-E). Antikor ve astar bilgi IPSC karakterizasyonu için Tablo 2 ve 4' de dahil edilir.

2. farklılaşma LFS iPSCs için mezenkimal kök hücre (MSCs) (Şekil 2A)

  1. Kültür IPSC klonlar MEF tabaklarda en az 2 hafta (gün ~ -14-0): daha önce açıklandığı gibi MEF yemekleri (100 mm doku kültürü yemekleri) hazırlamak (1.3.1 - 1.3.2). İPSCs hESC ortamda korumak ve orta her gün değiştirin. Ne zaman iPSCs ulaşmak % 90 izdiham, alt kültür iPSCs 1:10 seyreltme.
  2. İPSCs (0 gün) MEFs kaldırılması:
    1. İPSCs MEFs üzerinde 2 hafta sonra sürdürmek, kültür iPSCs 100 mm doku kültürü yemekleri kadar hücreleri % 80-90 izdiham ulaşmak. İzlenme hESC orta kaldırmak ve iPSCs 1 x DPBS 5 mL ile yıkayın. 1 mL hücreleri ayırmak ve 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya hücre dekolmanı çözeltisi ekleyin.
    2. MEF/MSC kültür ortamının 9 mL hücre dekolmanı çözüm etkinliği etkisiz hale getirmek ve herhangi bir kaplama olmadan yeni bir 100 mm doku kültürü tabak müstakil hücreleri aktarmak için plaka ekleyin.
    3. Hücreleri plakasına eklemek MEFs izin vermek 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    4. Dikkatle bekâr iPSCs ve 4 dk için 230 x g 4 ° c de santrifüj içeren süpernatant toplamak.
      Not: Dikkatsizce plaka alt reçeteye göre sarf MEFs dekolmanı yol açar.
  3. MSCs (gün 0 - 28) doğru iPSCs farklılaşma:
    1. 6-şey plaka üç wells ile 1 mL %0.1 jelatin iyi, oda sıcaklığında 30 dakika başına kat.
    2. Toplanan iPSCs süpernatant 2.2.4 kaldırın.
    3. (Gün 0) başına 2 mL ile MSC farklılaşma Orta (Tablo 1) ve tohum hücrelerinin üç kaplamalı Wells 6 ml iPSCs resuspend.
    4. MSC farklılaşma orta iki günde bekâr ve/veya ölü hücreleri (gün 1 - 28) kaldırmak için değiştirin.
  4. Olgunlaşma IPSC kaynaklı MSCs (gün 28-45):
    1. Harcanan MSC farklılaşma orta kaldırmak ve 1 mL 1 x DPBS hücrelerle yıkayın.
    2. MSCs %0.25 0.5 mL ile trypsinize tripsin-EDTA iyi 3 dakika oda sıcaklığında başına.
    3. Tripsin tarafından 1.5 mL MEF/MSC kültür ortamının nötralize ve MSCs Üç kuyusundan bir 15 mL konik tüp içine toplamak. 230 x g 4 ° c de santrifüj 4 dk için.
    4. Süpernatant kaldırmak ve MSCs MEF/MSC kültür orta ve plaka üzerinde bir 60 mm % 0,1 jelatin kaplı levha (28 gün) 3 ml resuspend.
    5. MSCs MEF/MSC kültür ortamda kültür ve orta iki günde değiştirin. Ne zaman hücreleri ulaşmak % 100 izdiham, alt kültür MSCs kullanarak %0.25 1:3 oranında tripsin-EDTA.
      Not: MSCs fibroblast benzeri morfoloji (Şekil 2B) görüntüler. MSCs bir yüksek yoğunluklu büyüdüğünde, uzamış MSCs bir girdap benzeri desen (Şekil 2B) oluşabilir.
    6. MSC yüzey işaretleyicileri CD44, CD73, CD105 ve CD166 inceleyerek IPSC kaynaklı MSCs değerlendirmek için immünfloresan boyama gerçekleştirmek (Şekil 2C).
      Not: Antikor seyreltme Tablo 2' de gösterilmiştir. Canlı hücrelerin immünfloresan boyama üretici yönergelerine göre gerçekleştirilir.
    7. Onay alındıktan sonra 100 mm doku kültürü yemekleri 1:3 oranında MSCs genişletin. Şişeleri (100 mm doku kültürü çanak başına 3 şişe) aşağı dondurma dondurucu orta % 10 DMSO ve % 90'ı içeren kullanarak FBS.
      Not: MSC nüfus zenginleştirmek için MSCs CD105 kullanarak sıralayabilirsiniz+, CD24-ölçüt akış sitometresi9,17. Ayrıştırılan IPSC kaynaklı MSCs PDGF AB-tabanlı yöntemi yaygın olarak kullanarak 2-3 ay kültür MSC kimlik9kaybı olmadan sürdürülebilir. MSCs MSC özellikleri onayladıktan sonra erken bir geçit numarasından dondur.

3. farklılaşma LFS MSCs dokusunu (Şekil 3A) için

  1. Osteojenik farklılaşma (gün -1) için MSCs hazırlanması
    1. Hücre Osteojenik farklılaşma Protokolü tamamlamak için yeterli bir miktar emin olmak için 100 mm doku kültürü yemekleri için % 95 izdiham kültürlü MSCs başlar. Harcanan kültür orta kaldırmak ve MSCs 1 x DPBS 5 mL ile yıkayın.
    2. MSCs % 0.25 tripsin-EDTA başına 100 mm çanak 3 dakika oda sıcaklığında 1 mL ile trypsinize. Hücreleri değil üzerinde trypsinized emin olmak için hücre dekolmanı % 50'si mikroskop altında görülmektedir trypsinization durdurur.
    3. Tripsin tarafından 9 mL MEF/MSC kültür ortamının nötralize ve MSCs 3 kuyulardan bir 15 mL konik tüp içine toplamak. 230 x g 4 ° c de santrifüj 4 dk için.
    4. Süpernatant Aspire edin, MSCs 5 mL MSC orta resuspend ve bir hemasitometre tarafından hücreleri saydırmak.
    5. Plaka uygun sayıda MSCs kültür plaka üzerinde.
      Not: Hücre sayıları 12-şey plaka, 6 iyi-plaka ve 100 mm doku kültürü yemekleri detayını Tablo 3' te özetlenmiştir.
  2. İndüksiyon Osteojenik farklılaşma osteoblast farklılaşma Orta (ODM) (Tablo 1) (gün 0 - 24):
    1. MEF/MSC kültür orta Aspire edin ve ODM uygun hacmi ile değiştirin (1 mL, 2 mL ve 8 mL 12-şey plaka her şey, her şey 6-şey plaka ve 100 mm doku kültürü için çanak, sırasıyla) MSCs dokusunu (0 gün) ayırt etmek için.
    2. Harcanan ODM Aspire edin ve Osteojenik farklılaşma işlemi sırasında her iki günde ODM uygun hacmi ile değiştirin.
    3. Alkalen fosfataz (AP) gerçekleştirmek ve alkalen fosfataz kemik ilişkili preosteoblasts tarafından üretilen ve mineral ifade tarafından üretilen algılamak için boyama Alizarin Red S (ARS) dokusunu, sırasıyla, günde 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 ve 24 ( Olgun Şekil 3B).
      Not: AP boyama ve ARS boyama üretici protokol sonrası ticari olarak mevcut kit kullanılarak gerçekleştirilir.
    4. Preosteoblast ve olgun osteoblast işaretleri (ALPL ve COL1A1 preosteoblasts için; ifade düzeyde incelemek PTH1R ve BGLAP için olgun dokusunu) qRT-PCR (Şekil 3 c) tarafından.
      Not: Gün 9'dan sonra Osteojenik farklılaşma beklenen olumlu AP boyama ve olumlu ARS boyama Osteojenik farklılaşma 21 gün sonra beklenebilir. MEF/MSC kültür ortamında büyüyen MSCs AP boyama ve ARS boyama negatif bir kontrol servis edilebilir.

4. LFS MSC kaynaklı dokusunu (Şekil 4A) in vivo Tumorigenesis çalışmaya Xenograft modeli

  1. LFS MSCs farklılaşma dokusunu için:
    1. Tohum 3-4.5 x 100 mm doku kültürü tabak içinde 105 MSCs. Beş yemekleri bir Subkutan Enjeksiyon için hazırlamak.
    2. Kültür MSCs ODM 3.2 gün 14 kadar açıklandığı gibi dokusunu için MSCs ayırt etmek içinde.
  2. Subkutan Enjeksiyon için farklılaştırılmış dokusunu hazırlanması:
    1. Osteoblast dekolmanı çözüm (Tablo 1) hazırlamak için 1 g tip II collagenase αMEM orta collagenase II çözüm (1 mg/mL) yapmak için 1000 ml geçiyoruz. -20 ° C'de collagenase II çözüm tutmak Mix % 0.25 tripsin-EDTA ve collagenase II çözüm 1:1 oranında dokusunu yapmak müfrezesi eriyik için.
    2. Harcanan ODM kaldırmak ve farklılaştırılmış dokusunu 1 x DPBS 5 mL ile 100 mm çanak yıkayın.
    3. Osteoblast dekolmanı çözüm 100 mm çanak başına 1,5 mL ekleyin ve yemekleri 30 dk. incelemek için 37 ° C'de kuluçkaya ve osteoblast dekolmanı mikroskobu tarafından olun.
    4. Dokusunu dekolmanı çözüm ODM tarafından etkisiz hale getirmek ve 50 mL konik tüp içinde müstakil dokusunu toplamak. 5 min için 230 x g 4 ° c de santrifüj.
    5. Süpernatant kaldırmak ve ODM orta 25 mL hücrelerde resuspend. Hücreleri toplanan hücre kaldırmak için bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek. Bir hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak.
    6. 1 x 107 dokusunu Subkutan Enjeksiyon ve santrifüj hücreleri 230 x g 4 ° c de başına 4 min için hazırlayın.
    7. 1 x 107 dokusunu 50 µL buz gibi 1 resuspend x DPBS. Mix dokusunu fenol kırmızısı ücretsiz membran Matrix (süspansiyon ve membran matris bir 1:1 oranında karışık dokusunu) 50 µL ile Ayrıştırılan ve enjeksiyon önce buzda dokusunu korumak.
  3. LFS MSC kaynaklı dokusunu in vivo xenograft tümör modeli:
    1. 8-hafta-yaşlı kadın immün NU/NU fareler inhale %5 (v/v) isoflurane 1 L/min (CLAMC tarafından sağlanan) oksijen sağlayan bir odasında anestezi. Hayvan yaslanmış olduktan sonra anestezik iletim sistemi %2 (v/v) inhale isoflurane 200 mL/dak (CLAMC tarafından sağlanan) oksijen sağlayan burun konisi geçin. Anestezi derinliği fareler yapmak için kornea ve pedal refleksleri yeterince anestezi ve rahatsızlık işlem sırasında acı değil kontrol ederek izlemek.
    2. Klorheksidin ve % 70 isopropanol alternatif temizleme bezi ile enjekte edilir bölgeyi dezenfekte. 26 G iğne membran matris karışık LFS dokusunu Subkutan Enjeksiyon 8 haftalık immün NU/NU fare (Şekil 4A) arka ayakları bir tarafı içine gerçekleştirmek için kullanın.
    3. Fareler subkutan Nodüler yoğunlukları büyümesi için enjeksiyon sitelerdeki haftalık palpasyonla gerçekleştirerek izlemek. Tümör oluşumu yaklaşık 6-10 hafta sonra enjeksiyon (Şekil 4B) görülebilir.
    4. Servikal çıkığı tarafından takip karbon dioksit boğulma yöntemi tarafından fareler ötenazi. Gelişmiş tümör incelemek. Tümör sınıf ve farklılaşma Dizin, preosteoblasts ve olgun dokusunu tarafından çeşitli boyama yöntemleri (Örneğin Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama, boyama Picro Sirius kırmızı ve von Kossa sırasıyla boyama) belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı LFS IPSC üretimi, MSC farklılaşma, osteoblast farklılaşma ve in vivo tumorigenesis tahlil LFS MSC kaynaklı dokusunu kullanarak da dahil olmak üzere yordamları sunar.

LFS iPSCs piyasada bulunan Sendai virüs seti yeniden programlama kullanarak fibroblastlar gelen nesil için şeması Şekil 1Aile gösterilir. Sendai virüs alan teslim Yamanaka dört faktörlerin bir sigara entegre ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Daha yüksek MSC farklılaşma verim elde etmek için çeşitli yönleri önemlidir. Bir kültür iPSCs MSC ayırt etme işlemini başlatmadan önce bir durumdur. El yazması sunulan Protokolü önceki çalışmalar 9,17at dayanır. iPSCs en az 2 hafta MEFs üzerinde kültürlü olmanız gerekiyor. İPSCs iyi bakımı MEFs koşullara hücreler MSC farklılaşma için jelatin kaplı tabakta iliştirmek için kritik öneme sahiptir. Bir başka önemli yönü farklılaşma önce MEFs üzerinde iPSCs yoğunluğudu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

R. Z. UTHealth yenilik tarafından kanser önleme araştırma eğitim programı Pre-Doctoral bursu için (kanser önleme ve RP160015 vermek Texas Araştırma Enstitüsü) desteklenir. J.T. ilk bağlı hastane, Sun Yat-sen üniversite Ke Lin Program tarafından desteklenir. Ö-Tayback kanser araştırma'CPRIT uzman ve NIH için yol bağımsızlık Ödülü R00 CA181496 ve CPRIT Ödülü RR160019 tarafından desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< > Plastik eşya< / güçlü>
100 mm ÇanakCorning430107
60 mm ÇanakCorning430166
6 Kuyulu PlakaŞahini353046
12 KuyuluPlaka Şahini353043
48 KuyuluPlaka Şahini353078
1 mL Pipet UcuUSA Scientific1111-2721
200 & L Pipet UcuUSA Scientific1111-0706
10 & L Pipet UcuUSA Scientific1111-3700
5 mL Serolojik PipetSARSTEDT86.1253.001
10 mL Serolojik PipetSARSTEDT86.1254.001
25 mL Serolojik PipetSARSTEDT86.1685.001
50 mL Tüp, PPSARSTEDT62.547.100
15 mL Tüp, PPSARSTEDT62.554.100
Kültür malzemeleri ve Reaktifleri
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Yeniden Programlama KitiInvitrogenA16517Ticari Sendai virüsü yeniden programlama kiti
Corning hESC Nitelikli MatrisCorning354277Bazal membran matrisi
CF1 MEF'ler, ışınlanmışThermoFisherA34180
DMEMSigma-AldrichD5671
DMEM / F12Corning10-090-CV
ve alfa; MEMCorning10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368Ticari iPSC ortamı
Nakavt DMEM/F-12ThermoFisher12660012
FBS Opti-GoldGenDEPOTF0900-050
Nakavt Serum DeğiştirmeThermoFisherA3181502
Penisilin-StreptomisinSigma-AldrichP4333
MEM Esansiyel Olmayan Amino AsitlerCorning25-025-CI
L-Glutamin ÇözeltisiSigma-AldrichG7513
2-MerkaptoetanolSigma-AldrichM3148
İnsan FGF-temel (bFGF)PEPROTECH100-18B
Rekombinant İnsan PDGF-ABPEPROTECH100-00AB
beta;-GliserofosfatSigma-AldrichG9422
DeksametazonSigma-AldrichA4902
Askorbik AsitSigma-AldrichA5960
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin, 1x (DPBS)Corning21-031-CV
StemMACS Pasaj Çözümü XFMiltenyi Biotec130-104-688Ticari pasaj çözeltisi
Accutatse Hücre Ayırma ÇözeltisiCorning25-058-CIHücre ayırma çözeltisi
Tiazovavivin (ROCK İnhibitörü)Calbiochem420220
%0.25 Tripsin-EDTA ÇözeltisiSigma-AldrichT4049
Kollajenaz, Tip II   ThermoFisher17101015
İnsan NANOG AntikoruR& D SistemiAF1997
OCT4 Antikoru (H-134)Santa Cruzsc-9081
İnsan / Fare SSEA-4 PE konjuge AntikorR& D SistemiFAB1435P
Alexa Fluor 555 Fare Anti-İnsan TRA-1-81 AntijenDB Biosciences560123
Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Keçi IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch705-545-003
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch111-545-144
PE Fare Anti-İnsan CD105eBioscience12-1057-42
FITC Fare Anti-İnsan CD44DB Biyolojik Bilimler555478
PE Fare Anti-İnsan CD73DB Biyolojik Bilimler550257
PE Fare Anti-İnsan CD166DB Biyolojik Bilimler560903
FITC Fare Anti-İnsan CD24DB Biyolojik Bilimler555427
Eşek SerumuJackson ImmunoResearch017-000-121
Keçi SerumuJackson ImmunoResearch005-000-121
Alkalin Fosfataz Boyama Kiti IIStemgent00-0055
Alizarin Kırmızı SSigma-AldrichA5533
TRIzol ReaktifiThermoFisher15596018
KloroformThermoFisherC298-500
2-PropanolThermoFisherA416-4
Etanol, Mutlak, Moleküler Biyoloji SınıfıThermoFisherBP28184
DNaz I, RNaz içermez (1 U/&mikro; L)ThermoFisherEN0521
iScript cDNA Sentez KitiBioRad1708891BUN
iQ SYBR YeşilSupermix BioRad1708884
Matrigel Matrisi Yüksek Konsantrasyon (HC), Fenol-Kırmızı İçermeyenCorning354262
1 mL Kayma Uçlu Şırınga, 26 Gauge x 5/8 İnçDB Biosciences309597
, ,

Kaynaklar

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  4. Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
  5. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  6. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  7. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  8. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  9. Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
  10. Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
  11. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  12. Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  13. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
  14. Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
  15. Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
  16. Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
  17. Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
  18. Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

iPSC DiferansiyasyonuMezenkimal K k H crelerOsteoblast DiferansiyasyonuIn Vivo T m rijenezAlkalen Fosfataz BoyamasAlizarin K rm z S Boyamasmm nofloresan BoyamaSubk tan EnjeksiyonN da Fare Modeli
Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.