Burada, TGF-β/Smad3 sinyal faaliyet bir adenovirus muhabir sistemi kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu sistem gerçek zamanlı olarak transkripsiyon etkinlikleri izler ve her iki tek hücreleri vitro ve canlı hayvan uygulanabilirmodelleri.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal dönüştüren hücresel homeostazı için gerekli birçok önemli işlevleri düzenleyen ve yaygın kanser de dahil olmak üzere birçok hastalıklarda overexpressed bulunur. TGF-β şiddetle geç sahne kanseri ilerleme sırasında metastaz göçmen ve invaziv tümör hücre alt grubunu aktive karıştığı. Sinyal yolu analiz için geçerli yöntemleri kez sinyal post-hoc biyolojik olay ölçmek girişimi ve hastalık ilerici doğası yansıtmamaktadır bitiş noktası modellerde odaklanmak. Burada, canlı hücrelerde transkripsiyon harekete geçirmek algılayabilir TGF-β/Smad3 sinyal yolu için belirli bir roman adenovirus muhabir sistemi göstermektedir. Bir Reklam-SIÇ12-Td-Tom muhabir kullanmak, MDA-MB-231 hücre içinde 24 saat içinde in vitrobir % 100 enfeksiyon hızı elde edebilirsiniz. Floresan muhabir canlı tek hücre içinde görüntüleme için kullanılmasına doğrudan kimlik transcriptionally etkin hücre ile gerçek zamanlı. TGF-β ile enfekte hücreleri uyarılması yalnızca bir alt kümesini transcriptionally aktif ve belirli Biyolojik işlevleri dahil olan hücreleri görüntüler. TGF-β sinyal vitroiçin ilgili biyolojik fonksiyonlar anlayışı geliştirmek için yüksek özgüllük ve bir tek hücre düzeyinde duyarlılık için bu yaklaşım sağlar. Transkripsiyon etkinliği de olabilir Smad3 bildirilen in vivo olarak uygulanması yoluyla gerçek zamanlı bir Ad-SIÇ12- Luc muhabir. Reklam-SIÇ12- Luc ve geleneksel stabil transfected luciferase hücre hatları ile aynı şekilde ölçülebilir. İmplante hücreleri içinde vivo Smad3 transkripsiyon faaliyet geleneksel IVIS görüntüleme ile analiz ve canlı tümör ilerleme, TGF-β sinyal yolu dinamikleri içine benzersiz fikir veren sırasında izlenen. Canlı hücre sinyal yolları hızlı yüksek üretilen iş görüntüleme için izin veren bir avantajlı gazeteci dağıtım sistemi bizim protokolünü açıklar vitro ve içinde vivo. Bu yöntem bir dizi görüntü dayalı deneyleri ve temel biyoloji ve terapötik geliştirme için hassas ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak hediye için genişletilebilir.
Giriş
Transforming büyüme faktörü β (TGF-β) olduğunu bir heterodimeric tip II oluşan karmaşık sinyaller insan gelişiminde karıştığı bir temel sitokin ve reseptörleri1yazın. Bağlama II reseptör yazın sonuçları işe alım ve fosforilasyon türü ben sırayla aşağı akım Smad2/3 proteinler2,3phosphorylates reseptör. Bunlar Smad4, Smad2/3 proteinler bağlama çekirdeği translocates ve Gen transkripsiyonu4düzenleyen bir kompleksi oluşturan aktif. Homeostatik koşullarda TGF-β/Smad sinyal sıkı bir şekilde düzenlenmiştir; Ancak, birçok hastalığın, sinyal yolu kuralsız ve genellikle il....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Melbourne hayvan Etik Komitesi üniversite tarafından kabul edildi.
Not: PReklam-CMV-Td-Tomadenoviral için sıra, inşaat ve üretimi iletişim kuralı vektörler, pReklam-CMV-GFP ve pReklam-SIÇ12- Luc/Td-Tom yukarıda açıklanan11,12olmuştur, 13. Piyasada bulunan tüm vektörleridir.
1. virüs titresi belirlenmesi % 50 doku kültürü bulaşıcı doz (TCID50) kullanma
- 1 x 106 DMEM + % 10 FBS medya 10 mL HEK293A hücreleri hazırlayın.
- Hücr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Vitro Imaging tek hücreli canlı
TGF-β/Smad dayalı adenovirus reaktifler kullanarak tek kişilik hücrelerde sinyal aktif doğru değerlendirmek için ilk en iyi çokluğu, enfeksiyon (MOI) her hücre satırı için belirlemek önemlidir. 0 hücre mevcut hiçbir cytopathic veya sitotoksik etkisi ile adenoviral enfeksiyon için pozitif olduğunda en iyi MOI belirlenir. Bunu belirlemek için biz pozitif enfeksiyon bir işareti olarak hareket y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz tek canlı hücreler TGF-β/Smad3 sinyal, gerçek zamanlı görüntüleme için izin vermek için bir teknik geliştirdi. Roman bu yöntemi kullanarak, biz daha önce hücre alt nüfus gelişmiş işgali ve geçiş8ile ilişkili dinamik TGF-β/Smad3 transkripsiyon aktivite ile belirledik. Bu yöntem TGF-β, Smad3 fosforilasyon Batı lekesi gibi sinyal için geleneksel deneyleri geliştirir ve TGF-β heterojenite yakalayarak gen ekspresyonu, hedef, TGF-β/Smad3 tümör nüfus içinde sinyal ve vurgulama tek hücre biyolojisi ön.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları rapor.
Teşekkürler
Bu eser Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) dan gelen hibe için H-JZ tarafından desteklenmiştir. TMBW Avustralya hükümeti bir Avustralya yüksek lisans Ödülü ve Ann Henderson kontör Burs Avustralya Rotary sağlık bir alıcı Templestowe Rotary ve Dine tedavi için ortak olduğunu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | 37 °C &°C; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Fetal Sığır Serumu | Scientifix Life | FBS500-S Kullanmadan | önce ısı inaktive |
| edildi Rekombinant İnsan TGF-β 1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot, 10 mg / mL'de son konsantrasyonu sağlamak için DDW'de |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | 1 & mu'da nihai konsantrasyon yapmak için PBS'ye seyreltin; L/mL |
| Lusiferaz Raportör Test Kiti | Promega | 197897 | Kullanmadan önce PBS'de 5 kez seyreltin |
| Luminometre | Promega | 9100-002 | |
| Faz kontrast floresan mikroskobu | OLYMPUS | IX50 | |
| Santrifüj | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Görüntüleme Sistemi | PerkinElmer | CLS136334 | |
| %0,5 Tripsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | PBS Hücre Kültürü Lizizinde %0,05 (1x) Diltue |
| 5x Reaktif | Promega | E153A | DDW'de 1x'e Seyreltin |
| %10 Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Hayvan Kaynakları Merkezi | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| İzofluran | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Etanol | Kimyasal tedarik | EA043-10LP | |
| Yenile Gece | Alerjisi | 1750D | Kayganlaştırıcı Göz Merhemi |
| Çözelti | Bileşim | ||
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | % 5 ısı inaktive edilmiş FBS; 10 & mu; g/mL penisilin; 100 ve mu; g/mL streptomisin |
Kaynaklar
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
