Yöntem makalesi

Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

DOI:

10.3791/57950

⸱

3 Temmuz 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology I, Heart Center Freiburg University, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine, Monash University, 3Department of Medicine I, Lighthouse Core Facility, Medical Center, University of Freiburg, 4Department of Cardiology, Augustinerinnen Hospital, Academic Teaching Hospital, University of Cologne

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dolaşımdaki mikroRNA'lar söz biyolojik kalp-damar hastalıkları ve akut miyokard enfarktüsü olarak göstermiştir. Bu çalışmada, bir protokol miRNA ayıklama, Ters transkripsiyon ve kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda serum miRNAs mutlak miktar için dijital PCR için açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dolaşımdaki serum mikroRNA (miRNAs) kalp-damar hastalıkları ve akut miyokard infarktüsü (AMI), biyolojik olarak kardiyovasküler hücrelerden dolaşıma serbest bırakılması söz göstermiştir. Dolaşımdaki miRNAs son derece istikrarlı ve sayısal. Belirli miRNAs nicel ifade patoloji ve bazı miRNAs gösteri yüksek doku ve hastalık özgüllük bağlanabilir. Roman biyolojik kalp-damar hastalıkları için bulma tıbbi araştırma için önem taşıyor. Oldukça yakın, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) icat etti. dPCR, floresan hidroliz probları ile birlikte belirli doğrudan mutlak miktar sağlar. dPCR düşük değişkenliği, yüksek doğrusallık ve nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) göre yüksek hassasiyet gibi üstün teknik nitelikleri sergiler. Böylece, dPCR doğrudan miRNAs, özellikle büyük çok merkezi kardiyovasküler klinik çalışmalarda kullanılmak miktarının bir daha doğru ve tekrarlanabilir yöntemdir. Bu yayında nasıl etkili serum numuneleri mutlak kopya sayısında değerlendirmek için dijital PCR gerçekleştirmek açıklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dolaşımdaki miRNAs hastalıkları, kardiyovasküler hastalık1de dahil olmak üzere bir dizi için umut verici işaretler olarak tespit edilmiştir. MiRNAs küçük, kodlama-tek iplikçikli RNA molekülleri (yaklaşık 22 nükleotit uzun) söz konusu olursa çoğu düzenleme yoluyla değişiklik mesajcı RNA çeviri ve etkileyen gen ifade2, içinde ve içine fizyolojik ve patolojik durumları dolaşımda serbest bırakılır. Belirli miRNAs nicel ifade patolojiye bağlanabilir ve yüksek doku ve hastalık özgüllük1bazı miRNAs göstermektedir. Kardiyovasküler hastalıklarda miRNAs onlar serum içinde son derece kararlı olduğu ve kolayca yeni biyolojik PCR metodoloji3yardımı ile sayısal gibi çekici aday olmuştur. Miyokard infarktüsünde biyolojik olarak miRNAs potansiyel değeri küçük çalışmalarda değerlendirilmiştir ama büyük tabur bir doğrulama2eksik. Örneğin, miR-499 son derece miyokardiyal kas ifade bulunur ve bir amı4,5,6' önemli ölçüde artış gösterilmiştir. Ayrıca, düzenleyen programlanmış hücre ölümü (apoptoz) ve cardiomyocytes farklılaşma ve böylece bir amı7takip çeşitli mekanizmalar ilgilenmektedir. Bir üstünlük ve miRNAs AMI tanısı için artımlı değerini raporlama bazı küçük çalışmalar dışında üstünlük veya eşitlik yüksek-duyarlı kardiyak troponins için henüz büyük ölçekli çalışmalar2',5 kanıtlanmamıştır ,6,8. Bu nedenle, ileriye dönük çalışmalarda daha büyük tabur miRNAs olası tanı değerini değerlendirmek için gereklidir. Ayrıca, miRNA miktar yöntemleri optimize edilmiş olması gerekir ve standart karşılaştırılabilir kullanarak9protokolleri. Standart deneyleri tutarsız sonuçlar azaltabilir ve biyolojik kendi klinik uygulanabilirliği sağlamak için tekrarlanabilir bir şekilde sayısal gerek rutin klinik uygulama için potansiyel biyolojik olmak için miRNAs yardımcı olabilir.

Son zamanlarda, dPCR bir son nokta analiz olarak tanıttı. Yaklaşık 20.000 bireysel tepkiler10örnek bölümleri. DPCR sistemi standart eğri10olmadan mutlak bir miktar etkinleştirme bir matematiksel Poisson istatistiksel analiz floresan sinyallerini (pozitif ve negatif tepkiler), sonra kullanır. DPCR floresan hidroliz probları ile birleştirilirken, miRNAs çok özel doğrudan mutlak miktar mümkün olmaktadır. Dijital polimeraz zincir reaksiyonu miRNA seviyelerinde miktarının için (azalan bir değişkenliği, artan bir gün-gün tekrarlanabilirlik, doğrusallık yüksek derecede ve yüksek bir hassasiyet de dahil olmak üzere) üstün teknik özellikleri sergilemek göstermiştir nicel gerçek zamanlı PCR10,11' e göre dolaşım. Bu üstün teknik nitelikleri dolaşımdaki miRNAs biyolojik kullanma mevcut kısıtlamaları hafifletmek için yardımcı olabilir ve miRNAs kurulması için biyolojik büyük çok merkezi kardiyovasküler klinik çalışmalarda ve bir tanı yöntemi olarak neden olabilir Genel. Bir önceki çalışmada son zamanlarda dPCR miRNAs bir AMI hastalarında dolaşımdaki mutlak miktar için uygulanan ve miRNAs miktar için qPCR12ile karşılaştırıldığında üstün tanılama potansiyel göstermek başardık.

Bu yayında, dPCR kullanarak doğrudan kardiyovasküler miRNAs dolaşan miktarının için doğru ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu ispat etmek istiyoruz. MiRNA düzeyleri kullanarak dijital PCR, serumda mutlak miktar büyük çok merkezi kardiyovasküler klinik deneylere kullanım için potansiyel gösterir. Bu yayında, etkili bir şekilde dijital PCR gerçekleştirmek ve serum içinde mutlak miRNA kopya numarası tespit ayrıntılı olarak anlatan.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. plazma/Serum üzerinden miRNA çıkarımı

Not: miRNAs uygun bir şekilde ölçmek için plazma/serum doğru mikroRNA izolasyonu önemli bir adımdır. Özellikle farklı protokoller bulunmaktadır çünkü, dikkat edilmesi gereken önemli bir şey için aynı iş akışı örnekleri işlenirken uygun etmektir. Bu protokol için miRNA 50 µL serum elde edilir. 200'den fazla µL bu sınıra doğru ayıklama işlemi kullanmayın.

  1. Serum hazırlamak veya donmuş numuneler çözülme.
  2. 250 µL (5 cilt) ticari lizis reaktif için 50 µL serum ekleyin. Lizis vortexing tarafından destekler. Tüp lysate ile 5 min için oda sıcaklığında bankta yerleştirin.
  3. Spike-kontrol (1.6 x 107 kopya/µL) 3.5 µL ile lysate spike ve vortexing tarafından mix onları.
  4. Kloroform (yani, eşit miktarda başlangıç serum örneği olarak) 50 µL faz ayrılması için ekleyin. Tüp 15 s. yer, oda sıcaklığında 2-3 dakika için bankta tüp için şiddetle çalkalanır.
  5. Faz ayrılması için santrifüj kapasitesi 12.000 x g 15dk için 4 ° C'de, tüp.
    Not: Örnekleri şimdi RNA, beyaz bir interfaz ve daha düşük, pembe Organik faz içeren bir üst sulu aşamaya ayrılır.
  6. Üst sulu faz (100 µL) RNA içeren yeni bir tüp içine aktarın. Bu doğru RNA sayısı onu gibi herhangi bir beyaz Interphase malzeme aktarılmaz.
  7. % 100 etanol 150 µL (yani, Transfer edilen örnek hacmi x 1.5) ekleyin. Onları yukarı ve aşağı pipetting tarafından malzemeleri karıştırın. Değil onları santrifüj kapasitesi ve hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin.
  8. 250 µL üzerine 2 mL toplama tüp ticari spin sütununda örneğinin pipet. Kapağı kapatın. Adresindeki sütun santrifüj kapasitesi > 8.000 x g akışı aracılığıyla 15 s. atma için oda sıcaklığında.
  9. Ticari çamaşır arabellek sayının 1 700 µL spin sütununu ekleyin. Kapağı kapatın ve sütun sırasında santrifüj kapasitesi > 8.000 x g 15 s. atma çalışma çamaşır arabellek için oda sıcaklığında.
  10. Ticari çamaşır arabellek sayının 2 500 µL spin sütununu ekleyin. Kapağı kapatın ve sütun sırasında santrifüj kapasitesi > 8, 000 x g 15 s. atma çalışma çamaşır arabellek için oda sıcaklığında.
  11. 500 µL % 80 etanol spin sütuna pipet. Kapağı kapatın, adresindeki sütun santrifüj kapasitesi > 8, 000 x g 2 dakika süreyle oda sıcaklığında toplama tüp akışı aracılığıyla ile atmak.
  12. Spin sütun için yeni bir 2 mL toplama tüp aktarın. Sütun membran kuruması için açılan bir kapak ile tam hızda santrifüj kapasitesi. Toplama tüp akışı aracılığıyla ile atmak.
  13. Spin sütun yeni bir 1,5 mL toplama tüp içine aktarın. RNA membran merkezine doğrudan RNase free su 30 µL uygulayarak elute. Kapağı kapatın. Sütun 1 dk. için tam hızda santrifüj kapasitesi.
  14. RNA-70 ° C'de depolayın
    Not: RNA hiçbir bozulma için 1 yıl-70 ° C ile-20 ° C arasında RNase free suda arıtılmış RNA depolanmasını sağlar. Üreticinin RNA sulandırmak için su RNase free en az 10 µL. 10 µL yeterince membran hidrat ve toplam RNA verim azaltmak daha az kullanarak iletişim kuralıdır.

2. Ters transkripsiyon

Not: Tamamlayıcı DNA (cDNA) (Toplam reaksiyon cilt) aşağıdaki 15 µL ters Transkripsiyon (RT) iletişim kuralını kullanarak sentez.

  1. RT kiti buz çözme. Enzimler dondurucu sürece onları aşağılayıcı önlemek ve onları kullanmadan önce spin mümkün unutmayın. RT astar buz çözme ve onları kullanmadan önce spin.
  2. Ana mix Tablo 1' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
  3. Ana Mix 10 µL ve 96 iyi tabakta bir kuyu başına ayıklanan RNA'ın 5 µL birleştirir.
  4. 2.000 x g 2 min için 4 ° C'de de iyi plaka santrifüj kapasitesi.
  5. Tablo 2 ' de açıklanan Ters transkripsiyon için termal döngü protokolünü kullanır.
    Not: aşağıda açıklandığı gibi cDNA doğrudan dijital PCR makinada işleme (bkz. Tablo reçetesi); Alternatif olarak,-20 ° C'de depolanmış olabilir

3. damlacık üretimi ve dijital PCR

Not: Dijital PCR aşağıdaki 40 µL protokolü kullanılarak gerçekleştirilen.

  1. Ticari dPCR mix, hazırlanan cDNA ve PCR astar buz çözme. Onları kısa bir süre kullanılmadan önce santrifüj kapasitesi.
  2. Açıklandığı gibi ana karışım hazırlamak Tablo 3.
  3. 1.33 μL/iyi RT ürün ekleyin ve kısa bir süre santrifüj kapasitesi.
  4. 20 μL örnek 8-şey kaset (orta satır) her kuyuya pipet.
    Not: 8-şey kaset tamamen dolu değil, kalan wells cDNA (yani, suyu ayıklanan RNA yerine ile üretilen RT ürün) ihmal şablonu olmayan denetimleri (NTCs) ile doldurmak veya dPCR ticari arabellek. NTC kontaminasyon kontrolü hizmet vermektedir. Bu damlacık oluşumu kalitesini bozabilir çünkü su içinde kalan wells, kullanılmamış olması gerekir.
  5. 70 μL sondalar damlacık üretimi petrol petrol kuyuları (alt satır) 8-şey kaset pipet.
  6. 8-şey kaset üstüne bir conta yeri ve damlacık Jeneratör ' kaset yerleştirin. Damlacık jeneratörü kapatın. 3 gösterge ışıkları sürekli yeşil kadar bekleyin.
    Not: Şimdi damlacıkları oluşturuluyor.
  7. Dikkatli ve yavaş 40 μL damlacık kurulan örnek (üst satır) pipetting tarafından bir 96-şey plaka ayrı kuyu aktarın.
  8. Damlacık oluşumu örnekleri üzerinde tamamladıktan sonra 4 için 180 ° C'de pierceable dPCR folyo ile PCR plaka mühür s.
  9. Folyo mühürlü PCR-plaka cycler yerleştirin ve rampa 2.5 oranında Tablo 4 ' te açıklandığı gibi döngüsü ° C/s.

4. damlacık okuma ve analiz

  1. Plaka, plaka sahibi tabanına termal cycler aktarın. PCR plaka plaka sahibi PCR plaka üzerine üstündeki yerleştirerek sıkıştırın.
  2. Ticari dPCR yazılımını başlatın.
  3. Örnek adı, deneme ve hedef adını kurulumunda girin. Mutlak miktar seçin.
  4. Çalıştır' ı tıklatarak okuma damlacık başlatın. FAM/HEX veya FAM/VIC hidroliz probları ile çalışırken algılama Kimya seçin.
    Not: Ticari dPCR yazılım sonra auto-verileri analiz eder.
  5. Doğru damlacık üretimi sağlamak için sonuçları tablosunda damlacık numaralarını denetleyin.
  6. Bütün wells ile aynı quantified miRNA seçin ve Çözümle' yi tıklatın. 2D leke olumlu damlacıkları işaretlemek ve el ile otomatik analiz verileri (Şekil 1) düzeltmek için kullanın.

5. doğru hesaplama örneği

  1. Örnek örnek normalleştirme faktörüyle (NF) çarparak normalleştirmek.
    NF medyan [C. elegans miR-39 ölçümleri]tüm örnekleri= / [C. elegans miR-39]verilen örnek
  2. Seyreltme faktörler (DF) için ayarlama son miRNA serum konsantrasyonu hesaplayın.
    [miRNA] son DFRT DFdPCR DFEx x x x [miRNA]satır değeri =
    Nerede:
    [miRNA] satır değeri ticari dPCR yazılımların; sayısal miRNA =
    DFRT = seyreltme faktörü şablonunun Ters transkripsiyon;
    DFdPCR = dPCR; şablonunda seyreltme faktörü
    DFEx = seyreltme faktörü çıkarma içinde.

6. sentetik oligonükleotid seyreltme serisi

  1. Sentetik oligonükleotid liyofilize buz çözme. Kısaca santrifüj kapasitesi.
  2. Lyophilized sentetik oligonükleotid nükleaz ücretsiz su 10 pmol son bir konsantrasyon içinde seyreltik / µL. kısaca santrifüj kapasitesi bu.
  3. Tablo 5' te açıklandığı gibi nükleaz ücretsiz suda sulandırmak. Kısaca 8.000 x g 10 seyreltme her adımda arasında seyreltme santrifüj kapasitesi s.
  4. 2. adımda açıklandığı gibi ters transkripsiyon ile devam etmek ve adım 3 ve adım 4 bölümünde açıklandığı gibi dijital PCR ile örnekleri analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dijital PCR floresan hidroliz probları ile kombine araştırmacılar doğrudan belirli miRNAs kopya/µL mutlak miktarı ölçmek için sağlar. DPCR örnekte içinde yaklaşık 20.000 bireysel PCR reaksiyonları, dPCR teknik gerektirmeyen bölümlere gibi10çoğaltır. DPCR sistemi (pozitif ve negatif tepkiler arasında farklı) Floresan sinyallerini bir matematiksel Poisson istatistiksel analizi kullanır eğri bir standart için ihtiyaç olmadan10mutlak bir miktar ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dijital PCR nükleik asitler bir örnek içinde doğrudan mutlak miktar sağlar PCR nispeten roman son nokta yöntemidir. Yöntemi belirli avantajları, azalan bir değişkenliği, artan bir gün-gün tekrarlanabilirlik ve üstün hassasiyet11,12de dahil olmak üzere sahiptir. Ayrıca, örnek yaklaşık 20.000 tek reaksiyonlar ve bitiş noktası analizleri bölümleme nedeniyle, dPCR için daha sağlam olur kantitatif RT-PCR16için karşılaştırıldığında PCR sokan mad...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir ilgili kaynaklar var.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RNA Ekstraksiyonu< / güçlü >
miRNeasy Serum / Plazma Kiti (50)Qiagen-Numune & MikroRNA ekstraksiyonu için Assay Technologies, Hilden, Deutschland217184Kit. Kit, ticari tampon RWT içerir (el yazmasında bir numara olarak adlandırılır)  ve RPE (el yazmasında iki numara olarak adlandırılır).
miRNeasy Serum/Plazma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmolQiagen-Örnek & Assay Technologies, Hilden, Deutschland219610Normalizasyon için Spike-in, Sıra: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Ters Transkripsiyon
TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti (1000 Reaksiyon)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD4366597MicroRNA ters transkripsiyon kiti
TaqMan MicroRNA Testleri MApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD4440887Ters transkripsiyonda kullanılan tahliller
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD4440887Tahlil Numarası 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD4440887Tahlil Numarası 000200
PCR Plakası, 96 kuyulu, segmentli, yarı etekliThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABDAB0900Ters transkripsiyon için 96 kuyulu plaka
Microseal ' B’ mühür MühürlerBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABDMSB1001Uygun depolamayı sağlamak için folyo
C1000 Dokunmatik Termal DöngüleyiciBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1851196Ters transkripsiyon için kullanılan
Damlacık Dijital PCR
100 nmol RNA oligo has-miR-499-5pEntegre DNA TeknolojileriÖzelSıra: Problar için 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGUUU-3'ddPCR
Süper Karışım (dUTP yok)Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1863024Damlacık üretiminde kullanılan süpermiks
TaqMan MicroRNA Testleri AppliedBiosystems, Inc., Foster City, CA, ABD4440887Dijital PCR'de kullanılan testler (floresan hidroliz probu)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD4440887Tahlil Numarası 001352, ticari primerler
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD4440887Tahlil Numarası 000200, ticari astarlar
DG8 Kartuşlar ve ContalarBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1864007Kartuş, damlacık üretimi için 8 adede kadar numune alır
DG8 Kartuş HolderBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1863051Damlacık üretiminde kartuşları tutar
Problar için Damlacık Üretim YağıBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1863005Damlacık üretiminde kullanılan yağ
ddPCR 96 Kuyulu PlakalarBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD12001925ddPCR PCR Plakası için 96 kuyulu plaka
Isı Yalıtımı, folyo, delinebilirBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1814040Delinebilir folyo, damlacık okuyucu
ddPCR ile uyumlu Damlacık Okuyucu YağıBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1863004Damlacık okumada kullanılan yağ
QX100 veya QX200 Damlacık JeneratörüBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1863002Damlacık Jeneratörü, numune/yağ emülsiyonu PX1 PCR'den damlacıklar üretir
Plaka KapatıcıBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1814000PCR
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABDddPCR
QX100 veya QX200 Damlacık OkuyucuBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1863003Optik dedektör
ile PCR pozitif ve PCR negatif damlacıkları okurProblar için ddPCR Tampon KontrolüBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1863052Boş kontrol  ve kalan 8 kuyulu kaset
Software
QuantaSof SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD1864011Damlacık okuma programı
Prizma Windows 5GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ABDİstatistiksel analiz programı
döngüleyici öncesi plakayı kapatır için kullanılan 1851196 Döngüleyici

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
  2. Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
  3. Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
  4. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
  5. Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
  6. Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
  7. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
  8. Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
  9. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
  10. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
  11. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
  12. Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
  13. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
  14. D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
  15. Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
  16. Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
  17. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MikroRNA KantifikasyonuDamlac k Olu umuTers TranskripsiyonSerum rnekleriFloresan Hidroliz ProblarMutlak Kantifikasyon

İlgili makaleler