Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Mitophagy seçici autophagy makine kullanarak hasarlı ya da gereksiz mitokondri kaldırılması işlemidir. Yakın bağları arızalı mitophagy ve nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve metabolik hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıkları arasında bulunmuştur. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu mitophagy normal hücresel süreçler, başkalaşım ve gelişimi gibi ilgilenmektedir göstermiştir. Ancak, kesin rolü ve moleküler mekanizmaları mitophagy altında yatan daha fazla çalışma gerektirir. Bu nedenle, bu değişiklikler mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlam ve uygun bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Burada, mitophagy etkinlik mitokondri hedefli floresan protein Keima (mt-Keima) kullanarak akış sitometresi ile kantitatif değerlendirilmesi için detaylı bir protokol açıklayın. Bu akış sitometresi tahlil daha hızlı ve hassas Yöntemler konvansiyonel mikroskopi veya immunoblotting göre daha mitophagy etkinliğini çözümleyebilirsiniz. Bu iletişim kuralı çeşitli hücre tiplerinin mitophagy etkinliğini çözümlemeye uygulanabilir.
Giriş
Mitokondri hücre çoğalması ve Fizyoloji için gerekli olan organelleri vardır. Mitokondri ATP tedarik Oksidatif fosforilasyon üzerinden % 80'den fazla oluşturmaktan sorumlu vardır ve onlar da biyosentezi ve metabolizma1,2için çeşitli metabolik ara ürün sağlamak. Enerji arzı ve metabolizma rolleri yanı sıra, mitokondri reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi, hücre ölümü ve intrasellüler Ca2 + dynamics3 düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok diğer önemli süreçlerinde, merkezi rol oynarlar . Mitokondriyal işlevde değişiklik kanser, diyabet ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. nesil HeLa hücreleri mito-Keima (mt-Keima) ifade
-
Mt-Keima lentivirus hazırlanması
- 2 mL % 0.001 poli-L-lizin/fosfat-tamponlu tuz (PBS) ekleyerek bir 100-mm Kültür yemek kat ve oda sıcaklığında 5 min için stand sağlar.
- Bir vakum için bağlı bir cam pipet kullanarak poli-L-lizin çözümü kaldırmak ve 2 mL 1 x PBS ekleyerek kültür bulaşık yıka.
- Plaka 1.5 x 106 HEK293T hücreleri kaplamalı kültür üzerine 10 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ile yemek ve CO2 doku kültürü kuluçka 37 ° C'de hücreler kültür için bir günü.
- Mt-Keima lentiviral plazmid....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
CCCP kaynaklı mitophagy HeLa-Parkin hücrelerdeki Akış Sitometresi Analizi örneği Şekil 4' te gösterilmiştir. Yukarıda açıklanan Akış Sitometresi Analizi yöntemi kullanılarak, biz "yüksek" gate mitophagic hücrelerde dramatik bir artış algılayabilir. "Yüksek" gate hücrelerinin yüzde 10 kat daha fazla tedavi edilmemiş kontrol hücreleri (Şekil 4A) ile karşılaştırıldığında yükseltilmiştir. Mitophagy aktivite bu artış tamamen bafilomyc.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, mt-Keima ifade hücreleri hücresel mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi kullanmanın hızlı ve hassas yöntemi mevcut. Mitophagy yüksek düzeyde geçiren hücreleri sergi PE-CF594 artan bir oranını (561 nm) / BV605 (405 nm) uyarma. Böylece, mitophagy etkinlik 561/405 oranı yüksek sergilenmesi hücre yüzdesi olarak ifade edilebilir. PE-CF594 bir nokta arsa üzerinde "yüksek" kapısı bölgesinde hücre yüzdesi hesaplanan (561 nm) BV605 karşı (405 nm), ve CCCP ile tedavi mitophagy HeLa-Parkin hücrelerinde artış in.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser (J. U. için) Ulusal Araştırma Vakfı Kore'den (2016R1D1A1B03931949), bir hibe ve Kore (NMG) hibe (için J.Y Kore government(MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, No. 2016R1A5A2007009) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir .)
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| REAKTİFLER< / güçlü > | |||
| poli-L-lizin | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penisilin / streptomisin | kuyu geni | LS202-02 | |
| PBS | Hiplon | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Termos bilimsel | R0531 | |
| 0.45 & mu; m şırınga filtresi | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polibren | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg / ml |
| puromisin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg / ml & nbsp; |
| Karbonil siyanür m-klorofenil hidrazin (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| tripsin-EDTA | kuyu geni | LS015-01 | |
| EKİPMANLAR< / güçlü > | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
Kaynaklar
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
