Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

Kantitatif PCR (qPCR) sık sık tek nükleotid türevleri (SNVs) de dahil olmak üzere insan genetik varyasyon ve DNA kopyalama numara varyasyonları (CNVs) ölçmek için kullanılır. QPCR, bir polimeraz tepki geleneksel son nokta PCR olduğu gibi aynı şekilde her tüpün içinde gerçekleştirilir ve bir güçlendirme sinyali tüp sizden her termal döngüsü sonra kazanılır. Buna karşılık, dPCR, son nokta dPCR bu raporda anlam PCR karışımı birçok mikroskobik chambers, bölümleri olarak adlandırdığı yüklendiği, DNA şablonları olduğu mevcut veya sınırlayıcı bir seyreltme ve her bölüm içeren PCR karışımı olarak değerlendirilir mi yok negatif veya pozitif tam PCR sonra. Negatif bölümlerinde DNA şablon yok olduğunu tahmin etmek kolay olmakla birlikte, DNA şablonları kaç kopya olumlu bölümlerinde bulunan belli değil. Bu nedenle, DNA şablon olumlu bölümleri sayısı negatif bölümleri¹count kullanarak Poisson dağılımı dayalı tahmin edilmektedir. dPCR daha pahalıdır ve bir daha küçük dinamik alan qPCR için karşılaştırıldığında, ancak bu yöntem mutlak bir miktar sağlar ve daha yüksek hassasiyet ve daha hassas²sunar.

DPCR ana uygulamaların yeni nesil sıralama (NGS) tarafından tanımlanan türevleri doğrulama olduğunu. Özellikle nadir türevleri durumunda anlamı düşük varyant kesirler, doğrulama NGS³' te ortaya çıkabilecek sıralama hataları nedeniyle önemlidir. Süre Sanger sıralama ve qPCR SNVs ve CNVs doğrulama için yararlı araçlar, onların duyarlılığı düşük dPCR için karşılaştırılır. Bu nedenle, dPCR nadir türevleri ile ilgili genetik çalışmalar için talep teknolojisidir. Son zamanlarda, nadir türevleri ilaç direnci gibi kanser özellikleri ile ilgili sıvı biyopsi tarafından tespiti moleküler tanı ve tedavisi⁴bir konu olmuştur. DPCR teknoloji sıvı biyopsi çalışmaları için uygun görünür ve önemli klinik uygulamaları yakın gelecekte, her ne kadar geliştirmeleri dinamik alanı ile ilgili ve maliyet yine uygulanması gerekir olması beklenir.

Piyasada bulunan dPCR teknoloji kabaca damlacık ve çip tabanlı platformlar sınıflandırılabilir; fark DNA şablonları bölümlenmiş^5,6,7böyledir işte. Tüp içinde çip biçimiyle dPCR içinde PCR karışımı bir yonga üzerinde bölümlere kılcal eylem tarafından dağıtılır. Fişleri hangi birçok laboratuar personel zaten aşina olacak, sekiz-tüp şeritler içinde yerleşiktir ve böylece, sekiz örnekleri bir saat⁸' de tedavi edilebilir. Okuma adımda bu çip ve değil her bölümünün resmin tamamını algılayarak 96 örnekleri tedavisi için 1 < h alır. DPCR tüp içinde çip biçimi ile diğer dPCR sistemleri ile karşılaştırıldığında yüksek üretilen iş olduğundan, kullanılabilirlik ve verimlilik kullanıcıları için önemli avantajlar vardır.

Bu raporda, bir hastada sporadik ailesel adenomatous poliposis ile APC gen somatik mozaizm temsilcisi bir olgu olarak kullanılır ve dPCR ve NGS sonuçları karşılaştırılır. Bu raporu temel amacı açıkça dPCR ile tüp içinde çip biçimini kullanarak bir tek nükleotid değişken ölçmek etmektir. Bu rapor araştırmacılar kendi çalışmaları için dPCR platform onaylanmasında baktılar için yararlı olduğunu umuyoruz.

Çalışma tasarım Hamamatsu Üniversitesi Tıp Fakültesi (G-260-4) kurumsal inceleme kurulları tarafından kabul edildi. Yazılı aydınlatılmış onam, hasta ve ailesi elde edildi.

1. kalite kontrol genomik DNA'ın

Not: Genomik DNA (gDNA) köklü silis-zar bazlı DNA arıtma yöntemini kullanarak periferik kandan ayıklandı. Öncesinde, yordamlar, bir spektrofotometre kullanarak gDNA konsantrasyonu tespit edildi.

1. GDNA örneği 10-100 ng/µL bir konsantrasyon'hazırlayın.
2. 10 µL DNA örnek arabelleği bir 8-boru striptiz kulübüne ekleyin.
3. DNA merdiven veya gDNA 1 µL tüpler için ekleyin. Girdap karışımı 1dk Mikroplaka eki kullanarak için.
4. Tüp, jel aygıt ve pipet ipuçları içine belgili tanımlık Elektroforez enstrüman (Malzemeler tablo) ve Başlat Çalıştır "Başlat" düğmesine basarak yük.
   Not: Elektroforez sistemi otomatik olarak bir tıkırtı üstünde başlamak düğme ile faaliyet gösterecek.
5. DNA örneği arabellekte bulunan alt işaret electropherograms üzerinde doğru olarak atanır onaylayın. Yanlış atanırsa, el ile 'Electroherogram modu' yazılım işaretleyicisinde atayın.
   Not: DNA bütünlük numarası (DIN) otomatik olarak hesaplanır. DIN değer DNA bütünlük gelir. Yüksek ve düşük DIN değerleri sırasıyla gDNA, son derece sağlam ve güçlü bozulmuş gösterir.
6. Bölge modu'gDNA (> 200 bp) boyutu bölge otomatik olarak gDNA (> 200 bp) konsantrasyonu hesaplamak için yazılımı türü belirtin.

2. astar ve sonda tasarım

1. Aşağıdaki koşullar altında herhangi bir açık erişim aracını kullanarak erime sıcaklık (T_m) değerlerini hesaplamak: 10-25 üsleri, 50 mM Na⁺/K⁺, 0.80 mM dNTPs ve 3 mM Mg^{2 +} (Malzemeler tablo). T_m değeri yaklaşık 60 ° C ve 100 – 300 bp, amplicon uzunluğu ile hedef gen içeren genomik bölge yükseltmek için ileriye ve geriye doğru astar tasarım.
   Not: Oligonucleotides konsantrasyon için Tablo 1 ' e bakın.
2. Kilitli nükleik asit (LNA) probları için başvuru ve değişken gen tasarım aşağıdaki koşullara dayalı: (i) 1-6 eskimiş mevcut her sonda; (ii) bir floresan boya ve bir içki 5' mevcut- ve 3'-terminuses her inceleyebilirsek, sırasıyla; (III) > 10 ° C uyumlu ve uyumsuz probları T_m değerleri arasında fark vardır; (iv) T_m uyumlu ve uyumsuz probları değerleri daha yüksek ve astar, onlardan daha düşük sırasıyla [Örneğin, ileri astar: 60.8 ° C, ters astar: 59.8 ° C, başvuru alleli sonda (eşleşen/eşleşmeyen): 62.6/45.3 ° C, varyant alleli sonda (eşleşen/eşleşmeyen): 61.7/50.5 ° C]. T_m değerleri de adım 2.1 için kullanılan açık erişim aracı kullanılarak hesaplanır.
3. Tasarlanmış astar ve sondalar veritabanlarından [Örneğin, tek nükleotit polimorfizmi veritabanı (dbSNP)] belirlenen > %0,1 frekans ile Tek nükleotid polimorfizmleri kapsayacak değil emin olun.

3. dijital PCR

1. Astarlar, sondalar ve Tablo 1 ' de TE arabellek ile açıklanan konsantrasyonlarda gDNA hisse senedi çözümleri hazırlamak ve stok onları -20-4 ° C.
2. Son bir konsantrasyon için 15 µL toplam hacmi içinde oda sıcaklığında reaktifleri Tablo 1'de açıklandığı gibi karıştırın.
   1. 3 µL distile su gDNA yerine bir no-şablonu denetimi (NTC) ekleyin.
   2. 3.5 x nüsha pipetting hata için hesap PCR karışımı miktarı hazırlayın.
3. Yukarı ve aşağı karıştırmak için PCR karışımı pipette.
4. 8-boru şeridi'nde inşa fiş üzerine yükleme platformu ayarlayabilirsiniz ve onları üzerinde otomatik yükleyici. Çip ve yükleme platformu arasında bir kişi olduğundan emin olun.
5. Bir yükleme kaydırıcı platformda uygun ve kaydırıcıyı Kapalı yükleyici tıpa ile tutun.
6. Kaydırıcıyı (Şekil 1A) ucuna yakın platformda PCR karışımı 15 µL pipet.
7. Yükleyici yükleyici (yaklaşık 1 dakika) düğmesini tıklatarak çalıştırın.
   Not: PCR karışımı küçük bir miktar platformda devam ederse bu bir sorun değil. Sırayla yükleyiciyi yeniden çalıştırın mümkündür.
8. Chip-içinde-a-PCR karışımı mühürleme artırıcı yan yuvası ile dolu tüp ayarlayın. Slayt kapak ve üst kapak kenarı değil ara belgili tanımlık küçük parça (Şekil 1B) itin.
9. Mühürleme artırıcı (yaklaşık 2 dk) çalıştırın. Tamamlanmamış bir sızdırmazlık çapraz bulaşma (rakamlar 1 c ve 1 D) olumlu sinyallerin nedeniyle sıvı birikintisi hala görünür durumdaysa sırayla 1 dk. için mühürleme artırıcı yeniden çalıştırın.
10. Sızdırmazlık sıvısı, tüpler için yağ bazlı bir reaktif 230 µL ekleyin.
    Not: Fişleri Şimdi sıvı dalmış.
11. Tüpler içinde termal cycler ayarlayın. Termal cycler (yaklaşık 2 h için) Tablo 2 ' de açıklandığı gibi çalıştırın. Pozitif bölümleri (Şekil 1E) dengesiz dağılımı ise sıcaklık veya PCR süresi ayarlamak.
    Not: Bu rampa oranı yaklaşık 1 olarak ayarlamak için tavsiye edilir ° C/s.
12. Tüpler temel gürültüyü azaltmak için termal cycler içinde en az 15 dakika bırakın.
    Not: Tüpler gecede de bırakılabilir. Floresan sinyallerini bile ertesi gün tespit edildi.
13. Tüpler algılama jig ayarla ve 6 mL distile su jig dökün. Hava kabarcıkları içindeki ve dışındaki tüpler görünür durumdaysa, onları (rakamlar 1F ve 1 G) temizleyin.
14. Jig dedektörü yükleyemez ve çalıştıramaz o ile a tıkırtı belgili tanımlık bilgisayar yazılımı üstünde belgili tanımlık "koşmak" düğme Fluorescene, deney ve örnek/NTC sekmeleri (Tablo reçetesi) seçimden sonra.
    Not: Varsayılan yoğunluğu ile sekiz örnekleri çift renk tespiti yaklaşık 4-5 dakika sürer.
15. Pozisyon arsa, çubuk grafik ve 2D dağılım çizim onaylayın.
    Not: IIf negatif bölümleri floresan yoğunluğu yüksek, 30-70 aralığında düşüyor yoğunluğu Yazılım Ayarları düğmesinin tıklatılması ile ayarlayın.
16. Varyant alleli kesir (VAF) aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar:
    
    Burada, Cv ve Cr sırasıyla varyant ve referans gen kopya numaraları vardır.
    Not: Poisson istatistik dayalı yazılım programında otomatik olarak hesaplanır.

4. PCR ürünü topluluğu

1. Sızdırmazlık sıvısı tüpünden kaldırın.
2. 100 µL TE tampon tüp ekleyin. 30 s ve kısaca santrifüj tüpü için şiddetle girdap.
3. TE çözüm için başka bir tüp aktarmak ve 3 M sodyum asetat 30 µL ve etanol 200 µL ekleyin.
4. -20 ° C'de çözüm gecede serin.
5. Belgili tanımlık eriyik için 16.000 x g de 30 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
6. 300 µL % 80 etanol tüp ve girdap ekleyin.
7. Çözüm için 16.000 x g de 15 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Çökelti 5 min için kurumasını sağlar.
8. 1 – 5 µL TE arabelleği çökelti air-drying sonra geçiyoruz.
9. Gerekirse, adım 1 referansla Elektroforez enstrüman kullanarak ürün boyutunu değerlendirmek. 1 µL çözüm için yüksek hassasiyet (Tablo reçetesi) jel cihaza yükleyin.

Biz yukarıda açıklanan yordamlara göre belirleme yapılacağı sporadik ailesel adenomatous poliposis olan bir hastada APC gen somatik mozaizm gözden. Bir önceki çalışma, APC c.834 + 2T > C mutasyon bulundu hasta ama değil velileri Sanger kullanarak, sıralama ve NGS9. Astar ve sondalar temsilcisi sonuçlarında kullanılan tasarımların Tablo 3' te gösterilmektedir. Genomik DNA proband, veliler ve altı sağlıklı bağış kandan ayıklandı. -E doğru 6,7-7,9 (Şekil 2 ve Tablo 4) arasında değişiyordu dokuz gDNA örnekleri DIN değerleri. FAM ve HEX floresan boyalar sırasıyla C ve T gen için kullanılmıştır. Pozisyon araziler yeşil ve sarı lekeler FAM-pozitif ve HEX-pozitif bölümleri, sırasıyla temsil eder (Şekil 3A). Mavi lekeler FAM ve HEX için negatif bölümleri temsil eder. Siyah arka plan burada reaksiyon karışımı değil eklendi bölümleri için karşılık gelir. C ve T allelleri birçok olumlu bölümleri proband, C alleli kaç olumlu bölümlerini proband'ın babası veya NTC tespit edildi ve T ikinci, pozitif bölümlerinde alleli algılandı değil sırada algılandı. C ve T alelleri arasında sinyal ayrılık iki boyutlu (2B) scatterplot açıktı ve HEX ve FAM en olumlu sinyaller birbirlerine hariç (Şekil 3B) idi. NGS (% 12,7) kullanarak kararlı benzer olduğu % 13.2, proband, VAF yapıldı (Tablo 4). Proband'ın anne ve sağlıklı bağış VAFs < %0,1 idi. APC c.834 + 2T için algılama sınırı > C mutasyon %0,3 Toplam gDNA1010 – 11 ng ile tekrarlanan ölçüler için 3 x standart sapmayı kullanarak tahmini.

APC c.834 + 2T için dPCR tahlil amplicon boyutunda > C 123 olmak tahmin bp. DPCR ürün tek bir bant güçlendirilmiş doğrulamak için dPCR ürün bölümü küçük parça--dan toplanmıştır. Elektroforez kullanarak, tek bir bant açıkça tespit edildi ve ürün boyutu tahmin (Şekil 4) ile tutarlı.

Resim 1 : Tüp içinde çip biçimiyle dPCR tahlil için dikkat edilmesi gereken noktaları. (A) Bu panel 8-boru şeridi'nde otomatik yükleyici kurmak nasıl gösterir. (B) Bu panel kırık cips gösterir. (C) Bu panel nasıl çip hemen sonra (ı) ve (ii) mühürleme yüzeyler gösterir. (III) sıvı su birikintisi eksik bir sızdırmazlık söz konusu olduğunda görünür. (D) Bu panel çapraz bulaşma durumunda pozisyon Arsa gösterir. (E) Bu panel pozisyon Arsa durumunda düzensiz bir dağılım gösterir. (F) Bu panel gösterir nasıl kabarcıklar suya batırma tüp yüzeyinde hava. (G) Bu panel tüp içinde hava kabarcıkları gösterir. Tüm şekil boyunca siyah ve beyaz ok uçları kırık yonga parçaları belirtmek ve hava kabarcıkları, anılan sıraya göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Kan gDNA temsilcisi electropherograms. Kan gDNA Electropherograms 6,7 ve 7,9 DIN değerleri ile üst ve alt paneli, sırasıyla gösterilir. Yıldız işareti daha düşük bir işaretleyici gösterir. DIN: DNA bütünlük numarası. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : DPCR ile tüp içinde çip biçimini kullanarak APC somatik mozaizm temsilcisi sonuçlarını. (A) pozisyon çizer ve (B) scatterplots no-şablonu denetim (NTC), proband ve babası burada gösterilir. Başvuru ve değişken gen için sırasıyla HEX ve FAM karşılık gelir. Dikey ve yatay çizgiler sırasıyla HEX ve FAM yoğunluklarını, eşikleri belirtin. Bu rakam Kahyo ve ark. değiştirildi 10. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Koleksiyon bölümü çip urun dPCR. Toplanan ve konsantre dPCR ürünleri Elektroforez için tabi tutuldu. Öngörülen hedef boyutu 123 oldu bp. Bu rakam Kahyo ve ark. değiştirildi 10. NTC: Hayır-şablonu denetim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: dPCR tahlil için kullanılan reaktifler. 1 Beklenen hassas ve duyarlı bağlı olarak.

Tablo 2: Termal cycler koşulları.

Tablo 3: astar ve sondalar tasarımına. 1 Altı çizili ve bracketed LNA ve hedeflenen varyant, sırasıyla harflerdir. 2 Adım 2 protokol göre hesaplanır.

Tablo 4: dPCR sonuçlarını tahlil için APC somatik mozaizm. 1 NTC: Hayır-şablonu kontrolü; Bağışçı: sağlıklı donör. 2 DIN: DNA bütünlük numarası. 3 Iwaizumi vd. 9, hum genom Var. 2 15057 (2015). 4 Deneyler onaylatılacak ve bağımsız olarak tekrar tekrar 3 x çalıştırılan; verileri ortalama değeri ifade edilir; MSB: göreli standart sapma; N/A: geçerli değil. Tablo Kahyo ve ark. değiştirildi 10.

Yazarlar ifşa gerek yok.