Yöntem makalesi

Nörojenez P19 embriyonal karsinom hücrelerini kullanarak

DOI:

10.3791/58225

⸱

27 Nisan 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Embryology, Institute of Genetics and Animal Breeding, Polish Academy of Sciences, 2Department of Regenerative Medicine, Maria Skłodowska-Curie Institute - Oncology Center, 3Department of Genomics and Biodiversities, Institute of Genetics and Animal Breeding, Polish Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P19 fare embriyonik karsinom hücre hattı (P19 hücre hattı) yaygın olarak büyük basitleştirme ile nörojenez moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılan in vivo analizi ile karşılaştırıldığında. Burada, P19 hücre hattında retinoik asit kaynaklı nörogenezi için bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir fare embriyo türevi teratokarsinoma türetilen P19 hücre hattı üç mikrop katmanları ayırt etme yeteneğine sahiptir. Retinoik asit (RA) varlığında, süspansiyon kültürlü P19 hücre hattı nöronlara ayırt etmek için indüklenir. Bu fenomen bir nörojenez modeli olarak yaygın olarak incelenmiştir. Bu nedenle, P19 hücre hattı neurogenesis ile ilişkili moleküler ve hücresel çalışmalar için çok yararlıdır. Ancak literatürde açıklanan P19 hücre hattının nöronal farklılaşması için protokoller çok karmaşıktır. Bu çalışmada geliştirilen Yöntem basittir ve nörogelişimsel anomalilerde ve nörodejeneratif hastalıklarda moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına bir rol oynayacak.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonal gelişim sırasında, tek bir hücre tabakası üç ayrı germ katmanına dönüştürülür1,2,3. İn vivo oluşan olayların araştırma olanaklarını artırmak için, üç boyutlu toplamları (embriyonik organları) nesil uygun bir model olarak geliştirilmiştir. Bu şekilde oluşan hücresel agregalar, embriyo4,5' in gelişimini yansıtan hücre farklılaşmasına neden olan çeşitli koşullara maruz kalabilirler. P19 murine embriyonik karsinom hücre hattı (P19 hücre hattı) yaygın olarak kullanılan bir hücresel model olarak nörojenez çalışmaları için vitro6,7,8. P19 hücre hattı, tipik pluripotent kök hücre özelliklerini sergiler ve hücre toplama sırasında retinoik asit (RA) varlığında nöronların içine yapışabilir koşullar altında nörit gelişiminin ardından ayırt edebilirsiniz. Dahası, farklılaşılmış P19 hücre hattı da dimetil sülfoxid (DMSO)9,10,11,12etkisi altında kas ve kardiyomiyosit benzeri hücreler şekillendirme yeteneğine sahiptir.

Birçok yöntem13,14,15,16 nöronal farklılaşma için bildirilmiştir, ancak metodoloji bazen karmaşık ve sadece açıklamaları okuyarak kavramak kolay değil. Örneğin, protokoller bazen buzağı serum (CS) ve fetal sığır serumu (FBS)13karışımı Ile tamamlayıcı Dulbecco modifiye kartal Orta (dmem) orta bir kombinasyonu gerektirir. Dahası, nöronal gelişim için kullanılan medya genellikle nörobasal ve B27 takviyeleri oluşur13,14,15,16. Bu nedenle, mevcut yöntemler onların hazırlanması karmaşıklık içerir ve burada amacımız protokolleri basitleştirmek için. Bu çalışmada, biz FBS ile DMEM P19 hücre hattı (DMEM + 10% FBS) yanı sıra nöronal gelişim için (DMEM + 5% FBS + RA) korumak için kullanılabilir olduğunu göstermiştir. P19 hücre hattını kullanarak nörogenezi için bu Basitleştirilmiş Yöntem bize nöronların nasıl geliştirildiğini moleküler mekanizması çalışma sağlar. Dahası, Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar üzerinde araştırma da P19 hücre hattı kullanılarak gerçekleştirilir17,18, ve biz bu çalışmada geliştirilen Yöntem aydınlatılmasına bir rol oynayacaktır inanıyoruz nörogelişimsel anomalilerde ve nörodejeneratif hastalıklarda moleküler mekanizmalar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. kültür Bakımı

  1. Kültür P19 hücre hattı bakım ortamı (Dulbecco modifiye kartal orta ile 4.500 mg/L glikoz ile tamamlayıcı 10% FBS, 100 birimler/mL penisilin ve 100 birimleri/mL streptomisin). 37 °C ve% 5 CO2' de Inküye.

2. alt-kültür hücreleri

  1. Hücreler yaklaşık% 80 konfluence ulaştığında, harcanan ortamı hücre kültürü flsorından çıkarın (yüzey alanı 25 cm2).
  2. Hücreleri 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile kalsiyum ve magnezyum içermeyen yıkayın.
  3. Ekle 1 mL 0,25% tripsin-EDTA (Etilen asit) hücre monolayer üzerine.
  4. 2-3 dakika boyunca CO2 inkükobu (37 °c ve% 5 Co2) ile Flask koyun.
  5. Hücre ekini Flask yüzeyine değerlendirin. Tüm hücrelerin ayrılmış ve ortamda yüzen emin olun.
  6. Trypsin enzimatik etkinliğini durdurmak için 9 mL bakım orta ekleyin.
  7. Bakım ortamında hücreleri yeniden resuspend.
  8. Hücreleri 15 mL 'Lik bir tüpe aktarın ve 200 x g ve oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 5 dakika santrifüj yapın.
  9. Süpernatant atın ve 15 ml tüp içine taze bakım orta 10 ml ekleyin.
  10. Hücre sayacını, üreticinin talimatlarına göre bir hücre sayacı kullanarak belirlemek için hücrenin süspansiyonunu kullanın.
  11. Tohum hücreleri 2 x 104 hücreler/cm2 yeni bir 25 cm2 Flask.
  12. Bakım orta 10 mL 'ye kadar ekleyin.
  13. 2-3 gün boyunca CO2 kuluçvator (37 °c ve 5% Co2) hücreleriyle Flask koyun.

3. tripsin sindirim

  1. Hücre şişinden aspirate bakım orta. Hücreleri bir kez 2 mL kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın.
  2. 1 mL 0,25% tripsin-EDTA ekleyin.
  3. 2-3 dk için 37 °C ' de CO2 inkükodiye hücrelerle Flask koyun.
  4. Hücrelerden on kez pipetleme yaparak hücreleri ayırmak için 1 mL pipet kullanın.
  5. Növite tripsin 9 mL farklılaşma orta ekleyerek (Dulbecco modifiye kartal orta ile 4500 mg/L glikoz ile tamamlayıcı 5% FBS, 100 birimleri/mL penisilin ve 100 birimleri/mL streptomisin) hücrelere RA olmadan.
  6. Hücreleri 15 mL 'Lik bir tüpe aktarın ve 200 x g ve RT 'de 5 dakika santrifüj yapın.
  7. Süpernatant atın ve retinoik asit (ra) olmadan farklılaşma orta 1 ml ekleyin. Hücre Pellet yeniden resuspend.
  8. Hücre sayısını, üreticinin talimatlarına göre bir hücre sayacı kullanarak belirlemek için hücrenin süspansiyonunu kullanın.

4. toplama üretimi

  1. 5 μL RA (99,8% etanol içinde çözünmüş 1 mM stok,-20 °C ' de saklanır), 10 mL Diferannizasyon ortamına ekleyin ve iyi karıştırın (son konsantrasyon 0,5 μM RA).
    Not: RA hafif duyarlıdır. Düşük konsantrasyon EtOH hücre farklılaşma etkilemez19,20,21.
  2. 100 mm 'lik tedavi edilmemiş kültür çanak (süspansiyon kültürüne adanmış) için 10 mL diferansiyel Orta (RA ile) ekleyin.
  3. 100 mm çanak (çanak yüzey alanı 56,5 cm2) 1 x 106 hücreleri tohum.
  4. 37 °C ve 5% CO2 için 2 gün boyunca küvatörün içine hücreleri ile Flask koyun oluşumunu tanıtmak için.
  5. 2 gün sonra, farklılaşma ortamını değiş tokuş yapın. 10 mL pipet kullanarak ve RT 'de 15 mL tüpüne transfer edilen, orta içeren agrega, aspirate.
  6. 1,5 dk 'da RT 'de yerçekimi tarafından yerleşmek için toplamları izin verin.
  7. Süpernatant atın.
  8. 10 mL serolojik pipet kullanarak 0,5 μM RA ile taze 10 mL Diferif orta ekleyin.
    Dikkat: Hücre toplamalarını yukarı ve aşağı pipet etmeyin.
  9. Yeni 100 mm tedavi edilmemiş kültür çanak (süspansiyon kültürü adanmış) içine toplamları tohum.
  10. Plakayı 2 gün boyunca kuluçte (37 °C ve% 5 CO2) olarak yerleştirin.

5. toplamları dissociation

  1. 10 mL pipet kullanarak hücre toplamalarını aspirate.
  2. 15 mL tüp için toplamları aktarın. Hücre toplamları 1,5 dk için yerçekimi ile yerleşmek için izin verin.
  3. Süpernatant çıkarın.
  4. Tek başına DMEM ile toplamaları yıkayın (serum ve antibiyotik içermeyen).
  5. Hücre toplamları RT 1,5 dk için yerçekimi sedimentasyon tarafından yerleşmek için izin verin.
  6. Süpernatant aspirate ve 2 ml Trypsin-EDTA (% 0,25) ekleyin.
  7. Hücre toplamalarını bir su banyosuna (37 °C) 10 dakika boyunca yerleştirin. bir el ile dokunarak her 2 dakikada bir hafifçe toplar.
  8. 4 mL bakım ortamı ekleyerek tripsinleştirme sürecini durdurun.
  9. 1 mL pipet kullanarak 20 kez yukarı ve aşağı pipet toplar.
  10. 200 x g ve RT 'de 5 dak için santrifüj hücreler.
  11. Süpernatant çıkarın ve 5 ml bakım Orta hücre Pelet pelletini.
  12. Bir hücre sayacı ile hücre numarasını belirleyin.

6. kaplama hücreleri

  1. 6-kuyu plaka bakım orta iyi başına 3 mL ekleyin.
  2. Tohum hücreleri 6-iyi kültür plaka 0,5 bir yoğunlukta x 106/well.
  3. % 5 CO2 konsantrasyonu Ile 37 °c ' de inkübe.
  4. 6 iyi kültür plakasında kapak camında hücreleri tohum ve anti-MAP2 antikor (% 20 konfluence) ile immünostatuvar gerçekleştirin. RNA izole etmek ve MAP2, Neun, Oct4, Nanogve GAPDH (% 20 Confluence) için RT-PCR gerçekleştirmek için 6-well plaka kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P19 hücre hattında nörojenez indüksiyon için protokol Basitleştirilmiş şeması Şekil 1' de sunulmaktadır. P19 hücre satırının karakterini ayırt edilemez bir durumda ve nörogenezi sırasında tanımlamak için, RT-PCR (Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) yöntemi kullanılmıştır. Farklılaşılmış P19 hücre hattı, organik Kyon/karnitin transporter4 (Oct4) ve Nanog Homeobox (Nanog) gibi pluripotency genlerini ifade etmiştir. RA 'nın varlığı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, P19 hücre hattını kullanarak nörojenez için basit bir protokol açıklanmaktadır. Bu konuda birçok rapor yayınlanmasına rağmen, P19 hücre hattını kullanarak nörojenez indüksiyon için ayrıntılı bir metodoloji belirsiz kalır. Dahası, biz tüm deney için 10% FBS ile basit bir yüksek glikoz (4.500 mg/L) DMEM orta kullanılmıştır. Bu bize Kullanıcı dostu bir şekilde nörojenik deney yapmak ve gelecek için bu yöntemin kullanımını genişletmek için izin verdi.

Bu protokoldeki en kritik noktalar, RA...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma mali Ulusal Bilim Merkezi, Polonya tarafından destekleniyordu (Grant No. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) ve KNOW (lider Ulusal Araştırma Merkezi) bilimsel konsorsiyum "sağlıklı hayvan-güvenli gıda", bilim ve yüksek Eğitim Bakanlığı kararı No. 05-1/KNOW2/2015

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6x DNA Yükleme BoyasıEURxE0260-01
AgarozSigma- AldrichA9539
cDNA sentez kitiEURxE0801-02
DAPI (4 & prime ;, 6-Diamidin -2 & prime ; -fenilindol dihidroklorür)Sigma- Aldrich10236276001Çalışma konsantrasyonu: 1 & mu;
LonzaBE12-604QDMEM yüksek glikoz (4.5 g/L)
%99,8ChempurCHEM*613964202
Fetal Sığır Serumu (FBS)EURxE5050-03
MAP2 antikoruThermo Fisher ScientificPA517646Seyreltme 1:100
PCR reaksiyon kitiEURxE0411-03
Penisilin / Streptomisin 10K / 10KLonzaDE17-602E
Fosfat Tamponlu Salin (PBS), Ca < sup> 2 + < / sup>, Mg < sup> 2 + < / sup >LonzaBE17- 517Q
Retinoik asitSigma- AldrichR2625-50MGve nbsp; % 99.8 etanol içinde çözülür; -20 & derece mağaza; C 6 aya kadar
İkincil Antikor (Alexa Fluor 488)Thermo Fisher ScientificA11034Seyreltme 1:500
Yağsız sütSigma- Aldrich1153630500
TBE TamponThermo Fisher ScientificB52
Triton-X 100Sigma- AldrichT8787-100ML
Tripsin% 0.25 - HBSS'de EDTA, olmadan  Ca2+, Mg2+, Fenol Kırmızısıile bioseraLM-T1720/500
Hücre Kültürü Plastikleri
Profilab515.01
10 mL Serolojik PipetlerProfilab515.10
Süspansiyon kültürü için özel 100 mm çanakCorningC351029
15 mL santrifüj tüpleriSigma- AldrichCLS430791-500EA
5 mL Serolojik PipetlerProfilab515.05
6 oyuklu plakaCorningCLS3516
Hücre kültürü şişeleri, yüzey alanı 25 cm2Sigma- AldrichCLS430639-200EA
L-glutamin Etanol ile g/mL 1 mL Serolojik Pipetler

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488(2011).
  2. Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
  3. Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 233-262 (2004).
  4. Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).
  5. ten Berge, D., et al. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
  6. Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway. Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).
  7. Lin, Y. T., et al. YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway. Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).
  8. Neo, W. H., et al. MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression. Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).
  9. Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
  10. McBurney, M. W., Rogers, B. J. Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).
  11. Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).
  12. Jasmin,, Spray, D. C., Campos de Carvalho, A. C., Mendez-Otero, R. Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells. Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).
  13. Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity. Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).
  14. Babuska, V., et al. Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation. Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).
  15. Monzo, H. J., et al. A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).
  16. Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity. BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42(2017).
  17. Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells. Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).
  18. Tsukane, M., Yamauchi, T. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).
  19. Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation. Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).
  20. Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
  21. Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).
  22. Hamada-Kanazawa, M., et al. Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid. FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).
  23. Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons. Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051(2013).
  24. Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters. Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).
  25. MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).
  26. Hong, S., et al. Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).
  27. Wenzel, M., et al. Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells. FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).
  28. Harada, Y., et al. Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).
  29. Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum. Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).
  30. Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line. Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

P19 H cre HattN ronal DiferansiyasyonRetinoik Asit UygulamasH cre AgregasyonuTripsin Sindirimimm nboyamaTers Transkripsiyon PCRMAP2 EkspresyonuNeuN EkspresyonuPluripotentlik Genleri

İlgili makaleler