Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı

8.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58359

⸱

25 Ekim 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics Department, Bar-Ilan University

Bu makalede

Özet

HMCA tabanlı görüntüleme plaka işgali tahlil performans için sunulmaktadır. Bu plaka üç boyutlu (3D) tümör pulcuklarının oluşumu ve hücre dışı matriks (ECM) içine kanser hücre işgalinin ölçüm kolaylaştırır. İstila tahlil miktar yarı otomatik analizi ile elde edilir.

Özet

Kanser metastaz kanser ölümcül % 90'ı neden olduğu bilinmektedir. Metastaz tümör hücreleri penetrasyon/işgali ile komşu dokusuna başlatır çok aşamalı bir süreçtir. Böylece, istila istila işlem araştırma ve geliştirme Anti-metastatik ilaçların son derece önemli hale metastaz içinde önemli bir adımdır. Bu talebi adrese, solid tümör mimarisini taklit 3D vitro modellerinin geliştirilmesi için bir ihtiyaç olduğunu ve onların microenvironment vivo içinde devlet bir yandan ama aynı zamanda en yakın için tekrarlanabilir, sağlam ve uygun yüksek verim ve yüksek içerik ölçümleri. Şu anda, çoğu işgal deneyleri yeterli olan sofistike mikrosıvısal teknolojileri yalın araştırma için ancak yüksek hacimli uyuşturucu tarama için. Her iyi izole bireysel pulcuklarının ile plaka tabanlı cihazlar kullanarak diğer deneyleri malzeme tüketen ve koşul başına düşük örnek boyutu var. Geçerli protokol amacı işgal kapasitesi tümör pulcuklarının büyük nüfus analizi için basit ve tekrarlanabilir biomimetic 3D hücre tabanlı sistem sağlamaktır. HMCA görüntüleme plaka tümör işgali ve Anti-metastatik ilaç keşfi araştırma için temel işgali tahlil için 3B modeli geliştirdik. Bu cihaz ise sürekli olarak ve aynı anda gözlemlemek ve orta için tek öğe çözünürlükte pulcuklarının ölçme ECM bileşenleri tarafından çevrili sayısız Tekdüzen pulcuklarının iyi (koşul başına yüksek örnek boyutu) başına üretimi sağlar üretilen iş Anti-metastatik uyuşturucu testi ile taranması. Bu platform burada tek hücre ve toplu istilası örnekli için HeLa ve MCF7 pulcuklarının üretim tarafından sunulan. HeLa pulcuklarının çevreleyen kollajen invaziv kapasitesini ECM bileşen hyaluronik asit (HA) etkisini karşılaştırın. Son olarak, biz Fisetin (Invasion inhibitörü) HeLa pulcuklarının ve nitrik oksit (NO) (Invasion harekete geçirmek) MCF7 pulcuklarının için tanıtın. Sonuçlar çok parametreli muayene kolaylaştırır yarı otomatik, basit ve hızlı analiz sağlayan kurum içi yazılım tarafından incelenir.

Giriş

Kanser ölüm esas olarak uzak konumlara metastatik hücreleri yayılması atfedilir. Kanser tedavisinde birçok çabaları hedefleme veya metastatik kolonileri oluşumu ve sistemik metastatik hastalık1ilerlemesini engelleyen odaklanmak. Kanser hücre göç tümör metastazı işleminde önemli bir adımı, böylece, kanseri istila cascade araştırma çok önemli ve bir Anti-metastatik tedavi bulmak için ön koşul.

Metastatik hastalık çalışmak için araçlar olarak hayvan modelleri kullanımını çok pahalı ve değil her zaman temsilcisi insanlarda tümör olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, hücre dışı microenvironment topoloji, mekanik ve kompozisyon güçlü kanser hücre davranış2etkiler. Vivo modelleri doğal olarak ayırmak ve kanser işgali ve metastaz için katkıda bulunmak gibi belirli parametreleri denetlemek için yetenek eksikliği olduğu kontrol edilebilir biomimetic vitro modelleri için bir ihtiyaç.

Uzak organlara metastaz için kanser hücrelerinin tedavi için hedeflenen göçmen ve invaziv fenotipik özellikleri sergilemek gerekir. Çoğu vitro kanser modelleri solid tümör3gerçek özelliklerini taklit değil, ancak, fizyolojik ilgili fenotipleri tespit etmek çok zor çünkü. Buna ek olarak, içinde tümör, var fenotipik heterojenite dikte tümör geçiş tek öğe çözünürlükte metastaz başlatılıyor hücre hedefleyerek terapiler, örneğin, fenotip yönetmen bulmak için analiz etmek için ihtiyaç Türdeş olmayan tümörler4içinde nüfus.

Hücre hareketliliği ve toplu geçiş çalışma öncelikle monolayer kültürler homojen düzlemsel yüzeylerde epitel hücrelerinin yürütülmektedir. Bu klasik hücresel modellere kanser hücre geçiş için tek tek hücrelere membranlar ve ECM bileşenleri5işgal nüfus analizi temel alır ancak tür sistemlerde, tek tek hücreler arasındaki içsel farklılıklar olamaz okudu. İskele üzerinden veya iskele-Alerjik mikro-yapıların olarak kabul edilir olarak üstün bir tümör çalışmaya anlamına gelir getirici 3D pulcuklarının işgali6,7,8büyüme ve kanser hücre. Ancak, 3D sistemleri en yüksek işlem hacmi biçimlerine uygun değildir ve izole bireysel pulcuklarının her Mikro-Evet9' da üretilen bu yana arası küresel etkileşim genellikle elde edilemez. Son çalışmalar kanser geçiş içeren mikrosıvısal aygıtları3,10,11,12dayalı, ancak, bunlar araçlar üretmek zordur ve cant mikrosıvısal sofistike (HTS) Anti-invaziv ilaçların eleme yüksek üretilen iş için kullanılabilir.

Tümör hücreleri ECM bariyer üstesinden bir rol oynamaktadır ve komşu doku istila gösterdiği13,14her farklı görüntüleme, morfolojik olmuştur iki ana fenotipleri, kolektif ve bireysel hücre göç, Özellikleri, biyokimya, moleküler ve genetik mekanizmaları. Buna ek olarak, geçirme tümör hücreleri, fibroblast benzeri ve protozlar, iki türde her fenotip gözlenir. Her ikisi de beri işgal fenotipleri ve geçiş modları, özellikle morfolojik özelliklerine göre tanımlanır, cep için bir ihtiyaç bu etkinleştir görüntüleme tabanlı algılama modelleri ve tümör işgali ve geçirdiğiniz her türlü incelenmesi hücreleri.

Geçerli yöntem genel amacı işgal kapasitesi tümör pulcuklarının büyük nüfus analizi için bir basit ve tekrarlanabilir biomimetic 3D vitro hücre tabanlı sistem sağlamaktır. Burada, HMCA tabanlı 6-iyi görüntü plaka tümör işgali ve Anti-metastatik terapi araştırma için tanıtmak. Teknolojisi, tek tip 3D tümör pulcuklarının (450 başına iyi) hidrojel mikro-Odalar (MC) yapısında çok sayıda oluşumunu sağlar. Çeşitli ECM bileşenleri hücreleri istila çevresini içine etkinleştirmek için küresel dizisine eklenir. İstila işlemi sürekli olarak kısa ve uzun vadeli gözlem aynı bireysel pulcuklarının/istila hücre tarafından izlenir ve morfolojik karakterizasyonu, floresan boyama ve herhangi bir noktada belirli pulcuklarının alınmasını kolaylaştırır. Bu yana çok sayıda pulcuklarının alanını ve orta paylaşır, bireysel pulcuklarının ve bir başka etkileri arasında çözünen molekülleri ile etkileşimi mümkündür. Yarı otomatik görüntü analizi daha hızlı ve daha verimli koleksiyonu büyük miktarda veri sağlayan kurum içi MATLAB kod kullanarak gerçekleştirilir. Platform orta üretilen iş tarama anti-Invasion ilaçların izin zaman verimli bir şekilde çok sayıda pulcuklarının/istila hücrelerinin doğru eş zamanlı ölçüm kolaylaştırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. HMCA plaka kabartma

Not: Ayrıntılı olarak bizim önceki makaleler15,16tasarım ve imalat polydimethylsiloxane (PDMS) damga ve bu protokol için kullanılan HMCA görüntüleme plaka için tam işlemi açıklanmıştır. PDMS damga (negatif şekli) iyi (Şekil 1A) başına yaklaşık 450 MCs oluşur (pozitif şekli) HMCA kabartma için kullanılır. Şekil 1Badımında gösterildiği gibi her birinin MCs kare şeklinde kesilmiş bir ters piramit şeklinde vardır (Yükseklik: 190 µm, küçük temel alan: 90 µm x 90 µm ve geniş taban alanı: 370 µm x 370 µm). HMCA plaka hazırlık ve 3D tümör pulcuklarının kültür ve bundan sonra istila tahlil için kullanılır. Alternatif olarak, ticari bir damga HMCA üretimi için kullanılabilir.

  1. % 6 düşük erime özel (LMA) çözeltisi hazırlamak. LMA toz ve steril fosfat tamponlu tuz (PBS) (PBS 10 mL başına LMA 0.6 g) ile bir manyetik karıştırıcı bir cam şişe içine yerleştirin. Şişeyi bir Isıtma tabağa yerleştirin ve çözüm ile 80 ° C Isıtma için Tekdüzen bir çözüm elde kadar bir kaç saat süre karıştırın. Çözüm 70 ° C kadar kullanmak tutun.
  2. 70 ° c fırında PDMS damga ön ısı. Kadar kullanmak sıcak tut. Alternatif olarak, ticari bir damga kullanın ve izlemek belgili tanımlık öğretim.
  3. 75 ° C'ye önceden ısıtılmış kuru banyo ticari 6-şey cam-alt tabak yerleştirin Plaka tamamen sıcak kadar birkaç dakika bekleyin.
  4. Bir damla (400 µL) önceden ısıtılmış LMA cam alt plaka wells her biri üzerine dökün. Yavaşça önceden ısıtılmış PDMS damga üzerinde özel açılan yer. (RT) Oda sıcaklığında 5-10 dk önceden uyuyor ve ön soğutma için kuluçkaya. Tam özel jelleşme ulaşmak 20 dk için 4 ° C'de kuluçkaya. Sonra yavaşça MCS'ye desenli özel jel bırakarak PDMS akasındaki.
    Not: Bu adım tüm wells aynı anda yapılır.
  5. Ultraviyole (UV) lamba ile donatılmış sistemi kür bir ışık kabartma tabak yerleştirin ve 3 dakikadır kuluçkaya.
    Not: Şimdi HMCA sterilize UV plakadır.
  6. Makro-wells onlar nemli, tutulur sonra plaka kapak, parafilm ile sarın ve 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak emin için steril PBS ile doldurun.
  7. Önce kullanma, PBS kalanlar HMCA plaka boş. Biyolojik mahallede yerleştirin.

2. yük hücreleri ve küresel oluşumu

  1. Hücreleri aşağıdaki gibi toplamak: tüm Orta 10 cm kültür plaka hücre monolayer kaldırmak için iki kez 10 mL serum kalanlar imha etme, 5 mL (37 ° C için önceden ısındı) tripsin de eklemek ve kuluçka 37 ° C'de 3 min için kuluçkaya PBS ile yıkayın Sonra yavaşça monolayer dekolmanı sağlamak, homojen hücre süspansiyon elde kadar tam orta (37 ° C için önceden ısındı) ve pipet yukarı ve aşağı 10 mL eklemek için plaka sallamak. Santrifüj kapasitesi ve hücre süspansiyon 15 mL taze orta ile yıkayın, sonra taze tam orta uygun konsantrasyonlarda askıya alma.
  2. Yavaşça hücre süspansiyon yük (50 µL, 150 – 360 x 103 hücre/mL orta, ~ 16-40 hücreleri MC) HMCA üstüne ve hücreleri yerçekimi tarafından 15dk için yerleşmek için izin verir.
  3. Yavaşça halka ve hidrojel dizi dışında makro-şey plastik alt kenarında 6 – 8 aliquots 500 µL taze Orta (Toplam 3-4 mL) ekleyin.
  4. 72 h için HeLa hücreleri ve MCF7 hücreleri pulcuklarının oluşumu için oksijen bir atmosferde 37 ° C ve % 5 CO2, 48 h için kuluçkaya.

3. canlılığı algılama Propidium boyama iyodür (PI) tarafından

  1. PI stok çözeltisi hazırlamak (PBS 1 mL başına PI sayısının 500 µg). 4 ° C'de yaklaşık 6 ay için devam et. Taze 1:2,000 (0,25 µg/mL), seyreltme stokunun tam orta fenol red, olmadan 12 ml 6 µL eklenmesiyle 6-şey HMCA plaka (iyi başına 2 mL) için hazır olun.
  2. 48-72 h pulcuklarının, HMCA plakalı kuluçka biyolojik hood için transfer. Tüm Orta hidrojel dizi yanında makro-şey plastik alt kenarına ipucu son eğilim tarafından HMCA kaldırmak için dizi tank bırakarak orta ile dolu.
  3. Yavaşça PI seyreltme 2 mL adım 3.1 her şey için makro-şey plastik alt kenarında ipucu son eğilim tarafından ekleyin. HMCA plaka 1 h 37 ° C ve % 5 CO2,'de oksijen bir atmosfer için kuluçkaya. Adım 7 ile devam edin.
    Not: Diğer boyalar burada de, örneğin, Höchst çekirdeği boyama için kullanılabilir tetramethylrhodamine metil ester (TMRM) boyama, floresein diacetate (FDA) canlı hücreleri algılama, Annexin V apoptosis için mitokondrial membran potansiyeli için algılama ve diğerleri.

4. kollajen karışım hazırlama

  1. Steril Çift Kişilik distile su (DDW) basınçlı kap ve 100 mL 1 M NaOH çözeltisi filtre sterilize stokunun tarafından hazırlayın. RT ve kollajen karışım hazırlama-20 ° C'de dondurulmuş kadar kullanmak için kullanılan ipuçları malzemeleri korumak.
  2. 10-20 dk kullanmadan, yer de dahil olmak üzere tüm alanı: steril DDW, 1 M NaOH steril çözüm, steril 10 x PBS, tip ı buz tamamen soğutmalı kadar kova içine kollajen sıçan kuyruk (3-ay 4 ° C'de depolanan) ve steril bir tüp. Buz kovası biyolojik kapağın içine yerleştirin.
  3. 3 mg/mL, son bir konsantrasyon, kollajen karışımı 1.800 µL 6-şey HMCA işgali tahlil plaka (iyi başına 300 µL) aşağıdaki gibi hazırlamak. Alanı soğutmalı tüp içine aşağıdaki sırayla ekleyin: DDW, 1 M NaOH 24.8 µL ve 10 x PBS 180 µL 515 µL. Girdap ve yer tarafından iyi karışımı buz içine geri. Son olarak, 1080 µL kollajen girdap tekrar karışıma ekleyin ve buz geri koy.

5. HA ve kollajen karışım hazırlama

  1. HA 10 mg 2 ml steril DDW geçiyoruz. Toz tamamen eriyene kadar RT karisimin yavaşça birkaç dakika ve girdap için kuluçkaya. 4 ° c hisse senedi çözüm için iki yıla kadar saklayın.
  2. Şu kullanmadan önce biyolojik başlık içinde buz kovası HA hisse senedi çözüm yerleştirin.
  3. 3 mg/mL adım 4'te açıklandığı gibi kolajen karışımı hazırlayın. 36 µg (7,2 µL) HA kollajen karışımı, 20 µg/mL nihai bir konsantrasyon için kullanıma hazır 1.800 μL içine ekleyin. O zaman, tekrar kısaca girdap ve buz içine geri koy.

6. ECM karışımı ek

  1. 48-72 h pulcuklarının, HMCA plakalı kuluçka biyolojik kapağın içine aktarmak ve buz üzerinde yerleştirin. Plaka soğutmalı kadar 10 dakikadır kuluçkaya. % 1'lik bir çözüm ön ısı LMA 37 ° c su banyosu içinde.
  2. HMCA, çevresinde tüm Orta hidrojel dizi yanında makro-şey plastik alt kenarına ipucu son eğilim tarafından kaldırın. Sonra çok dikkatli, tüm Orta dizi tankından iyi bir ipucu/jel uç, nazikçe ve yavaşça dışarı tüm Orta emme dizi kenar uç uç yaslanmış tarafından yükleme ile kaldırın.
    Not: tüm ortamından hidrojel dizi çevresinde kaldırdıktan sonra dizi tank hala orta ile doludur. Bu orta çok yavaşça hidrojel MC imha ve çıkık pulcuklarının önlemek için kaldırılması gerekir.
  3. Kollajen karışımı veya HA ve kollajen karışımı (ECM karışımı) 150 µL önceden dondurulmuş ince ucu ile alıp dizi kenar için belgili tanımlık uç ekleyerek dizi tank içine ekleyin. Yayın karışımı yavaş yavaş küresel çıkığı kaçının. Toplam 300 µL iyi ücret için 150 µL, başka bir aliquot ile bu adımı yineleyin. Bütün wells doldurulur kadar her şey için aynı yordamı izleyin. Sonra da kuluçka ECM tam jelleşme için 1 h için plaka yerleştirin.
  4. ECM tam jelleşme elde sonra önceden ısıtılmış %1 400 µL pipet LMA ECM jel üstüne. Kapak kapağı ile plaka, plaka RT, 5-7 dakika ve sonra özel jelleşme için 4 ° C'de 2 min için kuluçkaya. Son olarak, yavaşça 2 mL tam orta makro-şey plastik alt kenarında ipucu son eğilim tarafından ekleyin.
    Not: Özel katman HMCA kollajen-jel matris dekolmanı engel olur.

7. Invasion tahlil toplama ve Analizi

  1. Mikroskop sahne 37 ° C, %5 CO2 ve oksijen atmosferi için önceden ayarlanmış bir kuluçka ile donatılmış yük bir motorlu HMCA tabağa ters.
  2. Pozisyonlar her resim alma için tüm dizi alanı kapsayacak şekilde iyi ve 10 X veya 4 X hedefleri kullanıp önceden belirler (Bu adım burada kullanılan görüntü alma yazılımı için gereklidir, Ayrıntılar için aşağıdaki Malzemeler tablo bakınız). Alternatif olarak, seçerek tüm gerekli alanı otomatik olarak taranmasını kolaylaştırmak için herhangi bir görüntü alma yazılımı kullanın "Dikiş" seçeneği.
  3. Parlak alan (BF) görüntüleri her 2-4 h 24-72 saat toplam süre için hücreleri işgali çevreleyen ECM küresel vücut izleyebilmek için elde etmek.
  4. Floresan görüntüler PI algılama için adanmış bir floresan küp (uyarma filtre 530-550 nm, Dikroik ayna 565 nm uzun pas ve emisyon Filtre 600 – 660 nm) kullanarak elde.
  5. Görüntü alma yazılımı hızlandırılmış BF/floresan görüntüleri dışa aktarmak ve onları etiketli görüntü dosyası biçimi (TIFF) "Veritabanı" sekmesini araç ve sonra "Bu dosyaların kaydını tut dışa aktar" düğmesini kullanarak özel bir klasöre kaydedin.
    Not: Hangi işgal analiz daha hızlı ve kolay yürütülebilir bir tasarlanmış grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içerir MATLAB yazılım özel kurum içi analiz kodda geliştirdik. Bu analiz kodu pulcuklarının ve işgal alanı ayrılmasını yarı otomatik olarak morfolojik işleçleriyle erozyon ve genişleme takip Sobel filtre kullanılarak gerçekleştirilir. Sonra otomatik bölümleme alanların daha iyi doğruluk için gerektiğinde el ile düzeltmeler yapılmıştır. Segment oluşturma tamamlandıktan sonra parametreleri kümesini otomatik olarak yazılım tarafından hesaplanan ve daha fazla işleme için bir excel dosyası ihraç. Parametre listesi vardır: temel küresel kesit alanı zaman = 0, küresel vücuda bağlı hücre işgal alanı = ana işgal alanı, alan ana işgal alanında, ayrılmış hücre hücre sayısı ayrılmış ana işgal alanında, ortalama mesafe yaratıklardan kütlenin temel küresel merkezi çevresi için ana işgal alanı ve ayrı hücreleri ve toplu işgali mesafe parametre = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) dışarı-in Küresel center of kütle X ve Y koordinatları, daha önce (X1, Y1) ve sonra (X2, Y2) toplu işgal işlem). Alternatif olarak, görüntü analizi diğer özel yazılım ile yapılabilir.
  6. GUI açın ve "yük BF" düğmeye bas. Görüntü açıldıktan sonra segmentasyon parametrelerini ayarlamak (en küçük boyut: > 1 ve RADIUS kapatın: > 1) kesin bir bölümleme küresel ve onun işgal alanı elde etmek için sonra "Faiz (ROI) bölümleme bölge" düğmesine çalıştırılmak üzere basın ve Her küresel bir kenarlık görünür. Otomatik ayrılmasını doğru değilse, "Sil" veya "Ekle" düğmesine basın ve istenen düzeltmeleri el ile yapın. Sonraki görüntüler için aynı adımları yineleyin.
  7. Pulcuklarının numaralandırmak için "İzleme" düğmesine basın ve yazılım her küresel her zaman atlamalı görüntüleri için aynı numarası atar. Ardından, tüm parametreleri içeren bir elektronik tablo oluşturur "Ölçü" butonuna basın. Bu elektronik tablo sonuçlarında işleme daha fazla kullanılmasını ve excel yazılımı istatistik için bir excel dosyası olarak kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Plaka Imaging benzersiz HMCA 3D tümör pulcuklarının işgali tahlil için kullanılır. Küresel oluşumu ile başlayan ve işgal işlem ve ek manipülasyonlar, ile biten tüm tahlil aynı tabak içinde gerçekleştirilir. Küresel oluşumu için HeLa hücreleri dizi Havzası yüklenir ve yerçekimi tarafından hidrojel MCs yerleşmek. Sigara-yapışık/düşük ek özelliklere sahip, MCs hidrojel hücre-hücre etkileşim ve 3D tümör pulcuklarının oluşumunu kolaylaştırır. Şekil 2A 150 x 10

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu iyi belgelenmiş canlı organizmalar, onların karmaşık 3D Çokhücreli Organizasyon tarafından karakterize oldukça çok önemli fonksiyonları daha iyi taklit hücresel modelleri kullanmaya gerek vurgulayan kültürlü sık kullanılan 2D monolayer hücrelerden farklıdır ve uyuşturucu için canlı organizmanın süreçleri eleme. Son zamanlarda, çok hücreli pulcuklarının, organotypic kültürlerin, organoids ve organları-on-a-chip tanıtılan8 kullanılmak üzere standart ilaç keşfi olmuştur. Ancak, 3D çok hücreli mode...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bu eser Moshe Şimon ve Judith Weisbrodt miras tarafından desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
14 mm mikro kuyu # 1.5 kapak camı ile 6 Mikro kuyulu Cam Alt PlakalarCellvisP06-14-1.5-NHMCA kabartma için kullanılan ticari cam alt plakalar
UltraPure Düşük Erime Noktalı AgarozInvitrogen16520100% 6'lık bir agaroz çözeltisi 80 ° C'ye kadar ısıtılır; C kullanmadan önce,% 1'lik bir agaroz çözeltisi 37 ° C'ye ısıtılır; C
Tripsin EDTA çözeltisi BBiyolojik Endüstriler03-052-1A37 °C'ye Isıtıldı; C kullanmadan önce
DMEM ortamı, yüksek glikozBiyolojik Endüstriler01-055-1A37 °C'ye Isıtılmış; Kullanmadan önce C
Özel Yenidoğan Buzağı Serumu (NBCS)Biyolojik Endüstriler04-122-1AIsı ile Etkisiz
DPBS (10x), kalsiyum yok, magnezyum yokBiyolojik Endüstriler02-023-5AKullanmadan önce buz üzerinde tutulur
NaOH, susuzSigma-AldrichS5881-500G1 M NaOH çözeltisi
Cultrex Tip I kollajen, 5 mg / mLTrevigen3440-100-01Kullanmadan önce buz üzerinde tutulur
Hyaluronik asit sodyum tuzuSigma-AldrichH5542-10MGKullanmadan önce buz üzerinde tutulur
FisetinSigma-AldrichF505-100MGKültür ortamına eklenir, invazyon inhibitörü
DETA/NOEnzo Yaşam Bilimlerialx-430-014-m005Kültür ortamına eklenir, nitrik oksit donörü
PISigma-AldrichP4170Yıkamaya gerek kalmadan çok düşük konsantrasyonda kullanılan
Dymax 5000-EC UV projektör ışık kalkanlı komple sistem & Dymax 400 Watt EC güç kaynağıDymax CorporationPN 39823ile HMCA plaka sterilizasyonu için kullanılır
OlympusOtomatik görüntü alımı için kullanılır
Mikroskop için kuluçka makinesiYaşam Görüntüleme HizmetleriGörüntü elde etme ile hızlandırılmış deneyler için gerekli, önceden 37 &°'ye ayarlanmış; C, %5 CO2 ve nemlendirilmiş bir atmosferin korunması
Mikron altı motorlu sahne tipi SCAN-IMMarzhauser Wetzlar GmbHOtomatik görüntü alımı için görüntü alma alanlarını önceden belirlemek için kullanılır
14 bit, ORCA II C4742-98 soğutmalı kameraHamamatsu FotonikSon derece hassas, görüntüleme için kullanılır
PI tespiti için floresan filtre küpüChroma Technology CorporationFiltre küpü özellikleri: uyarma filtresi 530-550 nm, dikroik ayna 565 nm uzun geçiş ve emisyon filtresi 600-660 nm
Olympus Cell^P işletim yazılımı, motorlu sahne, kamera ve görüntü elde etmeyi kontrol etmek için kullanılanOlympus
Matlab R2014B analiz yazılımıMathworksGörüntü analizi için şirket içi grafik kullanıcı arayüzü geliştirmek için kullanılır
Excel yazılımıMicrosoftVeri yönetimi, hesaplama, çizim oluşturma ve istatistik için kullanılır
Sıçan kuyruğundan hazırlanması için kullanılır UV Ters IX81 mikroskobu Mikroskop Yazılımı

Kaynaklar

  1. Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
  2. Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
  3. Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
  4. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33(2016).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
  7. Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
  8. Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293(2017).
  9. Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811(2013).
  10. Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784(2017).
  11. Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544(2016).
  12. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
  13. Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
  14. Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005(2017).
  15. Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
  16. Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
  17. Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063(2016).
  18. Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114(2012).
  19. Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007(2012).
  20. Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
  21. Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001(2017).
  22. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686(2015).
  23. Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29(2018).
  24. Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
  25. Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502(2014).
  26. Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
  27. Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
  28. Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
  29. Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
  30. Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
  33. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  34. Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
  36. Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
  37. Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tümör Sferoid OluşumuHücre Dışı Matriks AnaliziHiyalüronik Asit EtkisiFisetin UygulamasıNitrik Oksit AktivasyonuZaman Atlamalı GörüntülemeTek Element Çözünürlüğü
Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.