Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş

13.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58490

⸱

21 Kasım 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, biz bir roman ve lenfositlerin izolasyonu için etkili iletişim kuralı Peyer's yamalar (PPs), daha sonra in vivo ve in vitro fonksiyonel deneyleri için hem de akış sitometrik çalışmalar foliküler t kullanılabilir sunmak yardımcı ve germinal Merkez B hücreleri.

Özet

Bağırsak mukoza bağışıklık hücreleri bağışıklık toleransı aynı anda patojenlere karşı bağışıklık savunma veriyor ise teşvik benzersiz bir immünolojik varlık oluşturmaktadır. De Peyer's yamalar (PPs) önemli bir rol mukozal bağışıklık ağ çeşitli efektör T ve B hücre alt kümeleri barındırarak sahip kuruldu. Bu efektör hücreleri, foliküler T helper (TFH) ve germinal Merkez (GC) B hücreleri belirli bir kısmını humoral bağışıklık Yönetmelikte professionalized. Bu nedenle, farklılaşma programı ve fonksiyonel özellikleri açısından bu hücre alt kümeleri-PPs içinde karakterizasyonu mukozal bağışıklık hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu amaçla, PPs lenfosit izolasyon kolayca uygulanabilir, verimli ve tekrarlanabilir bir yöntemin araştırmacılar için değerli olacaktır. Bu çalışmada, lenfositler yüksek hücre verim ile fare PPs dan izole etmek için etkili bir yöntem oluşturmak amaçlanmıştır. Bizim yaklaşım o ilk doku doku ajitasyon ve sindirim reaktifler kullanımı gibi işleme ortaya hem de hücre boyama koşulları ve antikor paneller yelpazesi, kalite ve kimlik izole lenfositler ve üzerinde büyük etkisi var deneysel sonuçlar.

Burada, verimli bir şekilde tekrarlanabilir akış sitometresi tabanlı değerlendirilmesi T ve B hücre alt kümeleri öncelikle TFH ve GC B hücre alt kümeleri üzerinde odaklanarak izin PPs lenfosit nüfus yalıtmak araştırmacılar sağlayan bir protokol açıklayın.

Giriş

Sonunda tüm gastrointestinal sistem başından itibaren daha fazla organ insan ve fare1bağışıklık hücreleri içeren geniş bir lenfoid ağ ile katlı olduğunu. Peyer's yamalar (PPs) teşkil bu hücresel bağışıklık organizasyon, sözde gut ilişkili lenfoid doku (GALT)2,3bağırsak dalı önemli bir bileşeni. PPs, diyet malzemelerden türetilmiş antijenleri milyonlarca binlerce içinde komensal microbiota ve patojenler sürekli örnek ve ne zaman gerekli uygun bağışıklık yanıtı onlara doğru takılı böylece bakımı bağırsak bağışıklık vardır homeostazı. Bu anlamda, PPs "ince bağırsak bademcikler" adlandırılabilir. PPs oluşan büyük alt bölmeler: subepithelial kubbe (SED), büyük B hücreli folikül bölgeleri; üstteki folikül ilişkili epitel (FAE) ve interfollicular bölgesi (IFR) nerede bulunduğu4T hücreleri vardır. İşbirliği için PPs sağlar farklı efektör hücre alt kümeleri benzersiz bu compartmentalization böylece, immunocompetence gut confers.

PPs afferent Lenfleribile eksikliği ve bu nedenle, PPs için ince bağırsak nakli antijenleri lenfoid diğer organları aksine lenf damarları aracılığıyla yürütülmektedir değil. Bunun yerine, FAE, sözde M hücreleri, bulunan özel epitel hücreler luminal antijenleri transfer PPs5içine sorumludur. Daha sonra taşınan antijenleri dendritik hücreler (DC) tarafından toplanır ve fagositler FAE6,7altında subepithelial kubbe (SED) bölgesinde yer alır. Bu antijen sıralama işlemi DCs PP tarafından edinilmiş bağışıklık yanıtı8 ve IgA salgılayan hücreler9sonraki nesil başlatmak çok önemlidir.

Komensal flora ve diyet malzeme ağır antijenik yükü nedeniyle, PPs ana bilgisayar endogenously efektör T ve B hücre alt kümeleri TFH ve IgA+ GC B hücreleri10gibi büyük zenginliği içinde PPs bir sitenin aktif bağışıklık temsil ettiğini düşündüren aktive Yanıt11. Algılama % 20-25'e kadar toplam CD4 TFH hücrelerde+ T hücre bölmesi ve yukarı GC B hücreleri içindeki toplam B hücreleri % 10-15 unimmunized genç C57BL/6 fareler12toplanan PPs mümkündür. Aksine diğer T yardımcı hücresi türleri (i.e., Th1, Th2, Th17 hücreleri), TFH hücreleri B hücre köklerinin öncelikle TFH hücre posta CXCL13 degrade13boyunca teşvik CXCR5 ifade sayesinde içine benzersiz tropism gösterir. PPs B hücre folikül bölgelerinde, IgA sınıf anahtar rekombinasyon ve içinden14yüksek afinite IgA üreten hücreleri ayırt aktif B hücrelere somatik Hipermutasyon TFH hücreleri neden. Daha sonra bu antikor salgılayan plazma hücreleri lamina propria (LP) göç ve gut10bağışıklık homeostazı düzenler.

TFH ve GC B hücre popülasyonlarının PPs içinde malzemelerin kimlik ve humoral bağışıklık yanıtı zaman alıcı bağışıklama modelleri gerek kalmadan kararlı durum koşullarda dinamikleri araştırmak araştırmacılar etkinleştirmek geleneksel olarak kullanılan TFH-GC B hücre çalışmaları15,da16,17,18. PPs hücrelerde TFH çözümlemeleri diğer hücre alt kümeleri olarak kadar basit değil. Teknik sorunlar ideal doku hazırlık koşulları, yüzey antikor-marker kombinasyonu, tanımlama yanı sıra uygun pozitif ve negatif denetimleri seçme içerir. TFH ve PP araştırma alanları deneysel prosedürler açısından büyük değişkenlik gösterir ve uzak veriyor çeşitli nedenlerden dolayı standart iletişim kuralları kurmak için bir fikir birliği vardır. İlk olarak, PPs içindeki her hücre alt doku hazırlık koşulları daha da bir hücre alt özgü şekilde değişiklik yapılmasını gerektiren differentially etkilenecek eğilimindedir. İkinci olarak, detayları hücre hazırlık üzerinden üçüncü PPS, karşılaştırmalı çalışmalar iletişim kuralı-based araştırma ideal doku hazırlama teknikleri ve deneysel koşullar sayısı hakkında bildirilen yöntemler arasında önemli bir tutarsızlık var s ve TFH için araştırma oldukça sınırlı kalıyor.

PP hücre hazırlık19,için20,21,22 önerdi mevcut iletişim kuralı-based çalışmalar TFH - ya da GC B hücre yönelik değildi. Ayrıca, PPs19,20 collagenase tabanlı sindirim gibi için önerilen bazı doku hazırlık koşullar TFH tespiti sonucu akış sitometresi tarafından olumsuz yönde etkileyecek bulunmuştur18. Bu temelde, TFH ve GC B hücre dinamiği içinde PPs çalışma için kullanılan bir en iyi duruma getirilmiş, standart ve tekrarlanabilir protokol bu konu üzerinde çalışan araştırmacılar için değerli olacağını gerekçeli. Bu ihtiyacı bize yalıtım ve ince hücresel kurtarma, canlılık ve verimlilik akış sitometrik karakterizasyonu birkaç T ve B için en iyi şekilde PP lenfositler karakterizasyonu için geliştirilmiş ve güncel bir protokol oluşturmak için bir ivme verdi hücre alt kümeleri. Biz de önceki Protokoller'de, böylece, önerilen birkaç zahmetli hazırlık adımları dışlamak için gerekli işlemler ve doku ve hücre hazırlık PPs dan için zamanı azaltmak amaçlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm çalışmalar ve deneyler bu protokol için açıklanan kurallarına göre kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi altında yapılmıştır.

1. deneysel Set-up ve fare grupları tasarlama

  1. (İsteğe bağlı) Deneysel fareler gut microbiota deneysel fareler arasında yatay iletimini kolaylaştırmak ve PP lenfositler içinde non-spesifik değişkenliği azaltmak için ortak ev. Ayrıca, littermate denetimleri aynı cinsiyet farklılıklarına en aza indirmek için kullanın.

2. cerrahi eksizyon ve doku hazırlık adımları:

  1. Cerrahi kaldırma ince bağırsak (sı)
    1. CO2 boğulma veya kurumsal hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış eşdeğer herhangi bir yöntemi kullanarak fare ötenazi.
    2. Fare cerrahi eksizyon için özel bir alan aktarın. Arka yerleştirin ve karın % 70 etanol ile sterilize. Laparatomi karın deri ve periton apış arasından orta hat için böylece peritoneal kavite açılış göğüs kafesi boyunca keserek gerçekleştirin.
      Not: ilk kesi periton boşluğuna delici ve bağırsak doku zarar önlemek için cilt nispeten küçük bir alan üzerinde gerçekleştirin. Eksizyon istenen anatomik sınır kadar devam edin.
    3. İnce bağırsak distal parçasını oluşturan terminal ileum tespiti için ideal bir dönüm noktası caecum tanımlayın.
      Not: Caecum genellikle fare karın sol alt tarafında yer alır.
    4. İleocaecal kavşak kesin olarak belirlemek ve bu düzeyde bir kesim olarak distal ince bağırsak caecum ayırmak mümkün olduğunca olun. Kırılgan PPs kolayca dokunmatik daraltmak için sonraki adımlar barsak duvarında aşırı fiziksel temastan kaçının.
    5. Yavaşça tüm ince bağırsak kadar pilor sfinkter makas kullanarak bıçaklanmasından keserek çıkarın. Mide ve duodenum arasında kavşak tanımlamak ve duodenum bağırsağın karın boşluğu üzerinden müfreze tamamlamak için yol açacak bu düzeyde makasla kesme.
      Not: (i) hyperextension bubağırsak duvarının yırtılması neden önlemek. (II) LP lenfosit yalıtım PP lenfositler ek olarak isterseniz, mezenterik yağlı tümüyle kaldırılmasını gereklidir. Ancak, sadece PP yalıtımı için mezenterik yağlı kalan bazı faydaları daha fazla yalıtım adımları uyguladığınızda sağlayabilir; Bu nedenle, korunmalıdır.
    6. Müstakil küçük bağırsak soğuk RPMI + % 10 fetal Sığır serum (FBS) ile dolu bir 6-şey tabak yerleştirin ve hafifçe dokular tüm bağırsak kesimleri soğuk ortamda batık kadar el ile tahrik. Sonraki adımları boyunca buzda doku korumak.
    7. Fare küçük bağırsak için istediğiniz sayıyı dissekan sonra PP eksizyon için toplanan küçük bağırsak devam edin.
  2. Cerrahi eksizyon PPs ve tek hücre süspansiyon hazırlanması:
    1. Yavaşça forseps kullanarak mezenterik yağlı sürükleyici bir kağıt havlu üzerinde ince bağırsak aktarmak ve mezenterik yüzü kağıt havlu bakacak şekilde yerleştirin. Bütün bağırsak segment soğuk RPMI + % 10 ile nemlendirin FBS doku dehidratasyon ve yapışkanlık önlemek için.
      Not: yağ dokusu kesimleri sı mezenterik sitede yukarı dönük olacak şekilde Anti-mezenterik site tutmak kağıt havlu için sopa olacak çünkü mezenterik yağlı kalan bu aşamada yardımcı olabilir.
    2. "Karnabahar benzeri" şekil barsak duvarında Anti-mezenterik tarafındaki beyaz çok loblu toplamları olarak görünür PPs tanımlayın.
      Not: tüm PPs eksize kadar luminal içerik dışarı Flushing tavsiye edilmez. Luminal içeriğini boşaltma PPs çöküşü neden olabilir ve renk karşıtlığını PPs ve PPs görsel tanımlaması için çok yararlıdır barsak duvarında arasındaki engeller.
    3. PPs Anti-mezenterik tarafında belirledikten sonra cerrahi kıvrık uçlu makas PPs üzerinde yerleştirin (eğri yüzleşmek) PP onun distal ve proksimal sınırdan yasaklama.
      İsteğe bağlı: PP bir parmak ucu kullanarak makas bıçakları doğru yavaşça itin. Bu manevra s doku çevreleyen daha iyi dışlama için yol açacaktır. PPs yavaşça, çevreleyen bağırsak dokusu hariç tüketim.
      Not: (i) bu adımı LP ve bağırsak epiteli, Ayrıca T hücrelerinde zengin gibi bağırsak bölmeleri komşu gelen hücre kirlenme en aza indirirken maksimal PP hücre verim elde etmek çok önemlidir. (II C57BL/6 fare eksize bir SI), 5-10 PPs (ortalama boyutu, çok loblu) toplanabilir. Daha da küçük PPs (değil çok loblu), toplama ilâ amaçlayan tarafından 12-13 PPs fare (C57BL/6) başına bu iletişim kuralını kullanan mümkün.
    4. 12-iyi doku kültürü plaka eksize PPs aktarmak dolu buz gibi RPMI + %10 FBS ve bakımı üzerinde buz forseps veya eğri cerrahi makas kullanarak.
      Not: (i) hemen sonra eksizyon, PPs, mukus ve bağırsak içeriği s yüzeyi doku yavaşça bir kağıt havlu üzerinde sürtünme tarafından temizlenebilir. Bu adımı PP lenfositler canlılığı geliştirmemize yardımcı olacaktır. (II) bir tabağa PPs aktarma yerine, ayrılmış tüpler aktarılması da toplam örnek sayısı bağlı olarak kabul edilebilir.
    5. İsteğe bağlı: PP eksizyon ve iyi plaka içine sonraki yerleştirme tamamlandığında, farklı deneysel/fare gruplardan toplanan PPs boyutunu ve sayısını PPs içeren doku kültürü plaka resmini alarak hepsinin belgesi var.
    6. 50 mL konik tüpler RPMI + %10 25 mL ile dolu bir dizi hazırlamak FBS (37 ° C'de önceden ısındı). Makas kullanarak, 1.000 µL bahşiş kenarına PPs 1 mL pipet ile aspirasyon sağlayacak mesafeden kesti. PPs 1 mL pipet ile Aspire edin ve hazırlanan 50 mL konik tüpler için 12-iyi doku kültürü plaka aktarabilirsiniz.
      Not: her fare örnek için yeni bir uç örnekler arasında çapraz bulaşma önlemek için kullanın.
    7. Kapağı güvenli ve tüpler bir orbital çalkalayıcı-37 ° C'de 10 dakika için 125-150 rpm sürekli ajitasyon ile dikey olarak yerleştirin. Bu arada, 50 mL tüpler yeni bir dizi hazırlamak ve bir 40 µm hücre süzgeç hangi aracılığıyla tek hücre süspansiyon hazırlanacak her tüpün üstünde yer.
      Not: (i ajitasyon adım-ecek çıkarmak kalan bağırsak içeriği, mukus ve hücre artıkları, hangi hücre canlılığı ve kurtarma PP lenfositlerin azaltmak değil kaldırıldı. (II) sindirim süreci dramatik CXCR5 ifade hücre yüzeyine gelen kaybolmasına neden çünkü sindirim enzimleri her türlü PP doku üzerinde uygulanmaz.
    8. Ajitasyon sonra PPs yeni hazırlanan konik 50 mL tüpler üstüne yerleştirilen 40 µm hücre süzgeç aktarın. 10 mL şırınga dalgıç yuvarlak yan kullanarak, yavaşça PPs tek hücre süspansiyon oluşturmak için hücre süzgeç aracılığıyla bozabilir. 15-20 mL soğuk RPMI + % 10 ile süzgeç durulama FBS.
      Not: filtre (i) uygulamadan önce PPs yatay olarak içeren tüpler sallamak. Bu kısa shake PPs transfer içine hücre süzgeçler kolaylaştıracaktır. (ii) lenfoid bağışıklık hücreleri yalıtım için 70 µm hücre süzgeç kullanarak (Örn., monositler, makrofajlar, DCs) önerilir.
    9. Tek hücre süspansiyonlar, 350-400 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
    10. Dikkatle süpernatant atın ve 10 x 106 hücre/mL bir konsantrasyon hücreleri resuspend. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
      Not: hücre sayımı (i) önce için her fare s grubu için toplam cep numarası yaklaşık olarak aşağıdaki formülü kullanarak tahmin edilebilir: "0.5-1 x 106 hücreler (PPs sayısı) x Toplam hücre sayısı =". Trypan hücre sayımı için mavi ile daha fazla dilutions gerekli olabilir. (II) elle sayım alternatif olarak otomatik hücre sayaçları kullanabilirsiniz.
    11. 2-2. 5 x 106 hücreler uygun toplu aktarım (Örn., 200 µL) bir 96-şey yuvarlak-alt plaka içine.
      Not: tek renkli ve negatif kontrol örnekleri için 0.5-1 x 106 hücreler yeterli olabilir.
    12. 350 x g 4 ° C'de 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Plaka fiske.
    13. Boyama arabelleği 200 µL hücrelerde yıkayın.

3. yüzey antikor boyama

  1. Canlılığı boyama:
    1. Son yıkama sonra PBS (1:1, 000) seyreltilmiş tamir edilebilir canlılığı boya 100 μL hücrelerde resuspend. Buz üzerinde veya karanlıkta 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
      Not: (i) hücre içi anahtar transkripsiyon tespiti için boyama Foxp3 gibi faktörler veya hücreleri fiksasyonu Bcl-6 gerektirir. Bu durumda, düzeltilebilir canlılık Boyayıcılar (Örn., 7-AAD, DAPI) kullanılamaz. (ii) düzeltilebilir canlılığı boya sulandırmak için protein içeren herhangi bir boyama arabelleği kullanmayın. Bu adımda kullanılan ortam protein ücretsiz olmalıdır. (iii) dışlama boyama canlılık kullanarak ölü hücreleri çok önemli çünkü ölü hücreleri Akış Sitometresi Analizi autofluorescence yayan ve nonspecifically, yüzey antikorlar bağlama false olarak yol açabilecek ciddi teknik sorunlar neden olabilir olumlu sonuçlar.
    2. Hücreleri iki kez tampon boyama ile yıkayın. 4 ° C'de 5 min için 350 x g, santrifüj Plaka fiske.
  2. FC blok ve yüzey - ı: katman
    1. Fc-blok çözüm anti-CD16/32 antikor (1: 200) arabellek boyama sulandrarak hazırlayın.
    2. Hazırlanan Fc-blok çözüm 20 μL hücrelerde resuspend. 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
    3. Çamaşır olmadan, yüzey antikor kokteyl 80 μL (bkz. Tablo 1 Özet antikor için) uygun dilutions hazır ekleyin. En az 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
    4. İki kez aşırı boyama arabelleği ekleyerek yıkayın. 4 ° C'de 5 min için 350 x g, santrifüj Plaka fiske.
  3. Yüzey - Katman II:
    1. Streptavidin boyama çözüm fluorochrome Birleşik Streptavidin boyama arabelleği sulandrarak hazırlayın.
    2. Son yıkama sonra çözüm boyama öncesi seyreltilmiş Streptavidin (1: 100) 100 μL hücrelerle resuspend. En az 15 dakika karanlıkta buz üzerinde kuluçkaya.
    3. İki kez tampon boyama ile yıkayın. 4° C'de 5 min için 350 x g, santrifüj Plaka fiske.
      İsteğe bağlı: hücre içi foliküler düzenleyici T hücre algılama için boyama, son yıkama sonra istenmiyorsa tampon ve akış sitometresi verileri elde etmek için transfer uygun tüpler içine boyama 200 μL hücrelerde resuspend. Örnekleri sabit değildir zaman, veri akış sitometresi tarafından edinimi içinde 3-4 h-doğru sonuçlar elde etmek için yapılmalıdır.

4. hücre fiksasyon

  1. Fiksasyon/permeabilization (düzeltme/Perm) çalışma çözüm Foxp3/transkripsiyon faktörü boyama arabellek kümesi'nden reaktifler kullanarak hazırlayın. Fiksasyon/permeabilization tek parça konsantre fiksasyon/permeabilization için istenen son hacim Dilüent üç bölümden karıştırın.
  2. Son yıkama sonra düzeltme/Perm çalışma çözüm 200 μL hücrelerde resuspend.
  3. Plaka buz üzerinde veya 20 dk için 4 ° C'de kuluçkaya. Bu adım için 20 dk fazla olamaz. Daha uzun kuluçka süresi ciddi hücre kurtarma düşürebilir.
  4. 4 ° C'de 5 min için 350 x g, santrifüj Plaka fiske. (İsteğe bağlı) Bu adımdan sonra birkaç gün içinde sığır serum albumin (BSA) içeren bir arabellek boyama 4 ° c sabit hücreleri depolanabilir veya sonraki hücre içi boyama veya akış sitometresi edinme kadar FBS.
  5. Permeabilization arabellek taze önceden arıtılmış deiyonize suyla seyreltik (x1) 200 μL hücrelerde resuspend.
  6. 350 x g (RT) Oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
  7. Bir kez permeabilization arabellek ve RT., 5 min için 350 x g, santrifüj 200 μL yıkayın

5. hücre içi boyama

  1. Fc-blok çözüm permeabilization arabellekte anti-CD16/32 antikor (1: 200) sulandrarak hazırlayın.
    Not: fiksasyon adımdan sonra hücreleri hücre içi boyama işleminin sonuna kadar permeabilization arabellekte sürdürülmelidir.
  2. Son yıkama sonra Fc-blok çözüm 20 μL hücrelerde resuspend. RT, 10-15 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya.
  3. Çamaşır olmadan, hücre içi antikor kokteyl (100 μL son hacim) permeabilization arabellekte önceden seyreltilmiş 80 μL ekleyin. 30 dk RT. az için kuluçkaya
  4. Perm arabellek ve santrifüj 100 μL RT., 5 min için 350 x g ekleyin
  5. Bir kez permeabilization arabellek 200 μL ile yıkayın, 350 x g RT., 5 min için de santrifüj kapasitesi
  6. Son yıkama sonra arabellek boyama 200 μL hücrelerde resuspend ve uygun tüpler (son hacmi 400 μL boyama arabelleği) içine hücreleri transfer ve veri akış sitometresi tarafından elde. 96-şey plaka lekeli örnekleri bir akış sitometresi ile plaka okuyucu seçeneği kullanılabiliyorsa, tüpler içine aktarmadan da çalıştırabilirsiniz. Bu adımı hücre kaybı hücre aktarımı sırasında en aza indirir.
  7. En az 5 x 105 toplam hücre TFH, TFR tekrarlanabilir analizini gerçekleştirmek için akış sitometresi üzerinde elde yanı sıra GC B hücreleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bir önceki iletişim kuralı20aksine, biz PPs SI eşit olarak dağıtılır değil ancak gösterildiği gibi SI distal ve proksimal sonuna doğru daha yoğun yerelleştirilmiş gözlemledim Şekil 1A. Akış sitometrik çözümleme göstermek doğru izlediyseniz, PP lenfosit Vaha'da ileri tarafı dağılım dağıtım splenocytes (Şekil 2AE ve 2D, H) ile benzer göster...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, akış sitometrik karakterizasyonu TFH ve GC B hücreleri için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklayın. Bizim Protokolü'nün en büyük avantajlarından biri herhangi bir sindirim süreci en çok 107 (ortalama 4 – 5 x 106 hücreler) Toplam PP hücre tek bir fare (C57BL/6 zorlanma) yalıtım sağlar olduğunu. Biz toplam hücre verim olumlu PPs numarası ile ilişkili ve deneysel planlama için yararlı olan aşağıdaki basit denklemi tahmin edilebilir gözlenen: "Toplam PP hücre sayısı başına fare...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Teşekkürler

Akış Sitometresi Analizi ile destek ve Laura Strauss ve Peter adaçayı yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
anti-fare CD4 antikorueBioscience, Biolegend*17-0041-81, 10054*Ayrıntılı bilgi için bakınız: Tablo 1
anti-fare CD19 antikorueBioscienceMA5-16536Ayrıntılı bilgi için bakınız: Tablo 1
anti-fare PD-1 antikorueBioscience61-9985-82Ayrıntılı bilgi için bakınız: Tablo 1
anti-fare ICOS antikorueBioscience12-9942-82Ayrıntılı bilgi için Tablo 1'e bakın
anti-fare GL7 antikoruBiolegend144610Ayrıntılı bilgi için Tablo 1'e bakın
anti-fare CXCR5 antikoruBiolegend*, BD Bioscience145512*, 551960Ayrıntılı bilgi için Tablo 1'e bakın
anti-fare BCL-6antikoru Biolegend358512Ayrıntılı bilgi için Tablo 1'e bakınız
anti-fare Foxp3 antikoreBioscience17-5773-82Ayrıntılı bilgi için Tablo 1'e bakınız
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259Ayrıntılı bilgi için Tablo 1'e bakınız
FixableViability DyeeBioscienceL34957Detaylı bilgi için Tablo 1'e bakınız
7AADBiolegend420404Detaylı bilgi için Tablo 1'e bakınız
FcBlock (CD16/32)BD Bioscience553141Ayrıntılı bilgi için Tablo 1'e bakınız
Kollajenaz IIWorthingtonLS004176
Kollajenaz IVWorthingtonLS004188
Foxp3/Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon SetieBioscience00-5523-00
6 kuyulu, 12 kuyulu ve 96 kuyulu plakalarFalcon/Corning353046,353043/3596
50 mL konik tüplerFalcon3520
40 & mikro; m hücreli süzgeçFalcon352340
10 mL şırınga-pistonExel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Orbital çalkalayıcıVWRModel 200
Kavisli uçlu makas
İnce Tırtıklı Forseps
Küçük kavisli makas
, , , , , , , , , :

Kaynaklar

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  3. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  4. Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
  5. Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
  6. Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
  7. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
  8. Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
  9. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
  10. Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
  11. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  12. Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
  13. Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
  14. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  15. Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
  16. Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
  17. Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
  18. Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
  19. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114(2016).
  20. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167(2013).
  21. Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282(2014).
  22. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225(2011).
  23. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  24. Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
  25. Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
  26. Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
  27. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
  28. Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
  29. Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
  30. Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
  31. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  32. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
  33. Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
  34. Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
  35. Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
  36. Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Akış SitometrisiTFH HücreleriGerminal Merkez B HücreleriHücre BoyamaAntikor PaneliDoku SindirimiHücre CanlılığıCXCR5 Ekspresyonu
Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.