Yöntem makalesi

Maya 4D mikroskopisi

DOI:

10.3791/58618

⸱

28 Nisan 2019

 , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, çok renkli 4d (zaman atlama 3D) Konfokal mikroskobu kullanarak mantar tomurcuklanan içinde floresan etiketli hücre içi bölmeler Analizi açıklanmaktadır. Görüntüleme parametreleri, fotodamat kısıtlarken yeterli sinyalleri yakalamak için seçilir. Özel ımagej eklentileri etiketlenmiş yapıların izlenmesini ve niceli olarak analiz edilmesini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, membran bölmeler nasıl şekillendirmek ve tomurcuklanan Maya canlı hücrelerde dönüşümü karakterize etmektir. Maya 'daki birçok hücre içi bölme dinamiktir ve özelliklerinin tam olarak anlaşılması zaman aşımı görüntüleme gerektirir. Çok renkli 4D konfoksel floresan mikroskopisi, 5-15 min. bir zaman ölçeğinde bir hücre içi bölme davranışını ve bileşimi izlemek için güçlü bir yöntemdir. bölme dinamiklerinin titiz analizi, binlerce optik Bölüm. Bu amaca ulaşmak için, fotobleaching ve fototoksisite çok düşük lazer gücüyle hızla tarama yaparak minimize edilir ve piksel boyutları ve Z-Step aralıkları, görüntüyü tam çözünürlükte örnekleme ile uyumlu olan en büyük değerlere ayarlanır. Ortaya çıkan 4D veri setleri gürültülü ancak deconvolution tarafından düzeltilebilir. Yüksek kaliteli verilerle bile, hücre içi yapıları genellikle çok sayıda, heterojen ve mobil olduğundan analiz aşaması zordur. Bu ihtiyacı karşılamak için, özel ımagej eklentileri bir bilgisayar ekranında dizi 4D veri yazılmıştır, ilgi yapıları belirlemek, bireysel yapıları izole etmek için verileri düzenlemek, floresan zaman kursları ölçmek, ve yansıtılan Z-yığınları film yapmak. 4D filmler özellikle olgunlaşma tarafından teslim geçici bölmeler kararlı bölmeleri ayırt etmek için yararlıdır. Bu tür filmler de bölme Fusion gibi olayları karakterize etmek ve belirli mutasyonlar veya diğer perturbations etkilerini test etmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endomembran sisteminin bölmeleri sürekli Flux ve tam karakterizasyonu canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada açıklanan 4D (zaman atlamalı 3D) konfetit mikroskopu kullanan bir protokoldür Mayalar tomurcuklanmış floresan etiketli bölmeleri görselleştirmek için. Yöntem Pichia pastoris ve Saccharomyces cerevisiae1,2,3' te salgı bölmeler dinamiklerini izlemek için geliştirilmiştir. Bu protokol, bireysel sarnılının optik olarak çözülebilir olduğu yığılmış olmayan bir Golgi olan S. cerevisiae 'ye odaklanır4. S. cerevisiae 'de olağandışı Golgi organizasyonu, bir Golgi sarnıçında başlangıçta ikamet eden erken Golgi proteinleriyle etiketleyerek 4d mikroskobu ile gösterimi etkinleştirmiş ve daha sonra Resident Late Golgi proteinlerini alırken bu proteinlerin kaybettiği3 ,5. Bu geçiş, geç Golgi proteini Sec7 monomerik kırmızı floresan protein ile etiketlenirken, erken Golgi protein Vrg4 GFP ile etiketlendiği bir gerginlik oluşturarak görselleştirilebilir. Bireysel sarnıt takip edildiğinde, olgunlaşma yeşil-kırmızı dönüşüm olarak görülür3. Bu tür analizler protein lokalizasyonu ve bölme kimliği hakkında değerli bilgiler verebilir. Örneğin, biraz uzaklık geliş ve kalkış süreleri ile iki protein bazen statik görüntülerde farklı bölmeleri etiketlemek için görünebilir, ancak 4d filmleri farklı zaman noktalarında aynı bölme etiket için görülebilir5/6 . Böylece, 4D mikroskopisi aksi belirgin olmazdı olayları ortaya çıkarır.

Maya bölmeler bilgilendirici 4D mikroskopisi uygun prosedürler ve ekipmanlar ile elde edilebilir2. Mümkün olduğunda, floresan protein etiketleme gen replasman tarafından gerçekleştirilir8 ekspresyonu eserler önlemek için. Hücre içi yapılar genellikle çok dinamik olduğundan, bir yapının zaman içinde güvenilir bir şekilde izlendiğinden emin olmak için 4D görüntüleme gereklidir. Burada açıklanan protokol, yüksek hassasiyet dedektörleri ile donatılmış bir lazer tarama Konfokal mikroskop kullanır. Bu cihaz ile, s. cerevisiae tüm hücre hacmi yaklaşık her 1-3 s, 2 s aralıklarla tipik olan konfokk mikroskopisi tarafından görüntülenmiş olabilir. Fluoropoerlerin ve fotofizik özelliklerinin etiketleme yoğunluklarına bağlı olarak 5-15 dakika kadar veri toplanabilir. Ana engel fotobleaching en aza indirmek için. Bu amaçla, lazer yoğunlukları mümkün olduğunca düşük tutulur, konfet tarama hızı maksimize edilir, ve optik parametreler aşırı ışık pozlama kaçınarak ilgili bilgileri yakalamak için Nyquist sınırına görüntü olarak yapılandırılır. Bu ayarların aynı zamanda fototoksisite hafifletmek için bekleniyor, genellikle canlı hücre görüntüleme sırasında gözardı edilen bir faktör9,10,11. Ortaya çıkan gürültülü veriler, floresan yoğunluklarını ölçmek için çamaşır suyu düzeltmesi ve deconvolution algoritmaları ile işlenir.

Yüksek kaliteli 4D filmler bile, Maya bölmeleri çok, heterojen ve mobil olma eğilimindedir çünkü analiz zordur. Konfokal mikroskopinin içsel sınırlamaları ve uzun süreli 4D görüntüleme için gerekli olmayan optimum ayarları nedeniyle, birbirlerine yakın olan floresan yapıları çözmek zordur. Bu sorun, etiketleme döneminin süresi için optik olarak çözülebilir kalır floresan yapıların az sayıda odaklanarak, bu yapıların etiketli tüm nüfusun temsilcisi olduğunu varsayımı ile kaçınılabilir Bölme. Güvenilir bir şekilde izlenebilir floresan bölmeleri, öngörülen Z yığınlarının filmleri görüntüleyerek ve her zaman noktası için optik bölümlerin bir bilgisayar ekranında dizilen bir dizi editörü oluşturarak tanımlanır. Bu analiz özel ımagej12 eklentileri kullanır ve bu da tek bir yapının izolasyonda izlenmesini sağlar.

Son Yöntemler kağıtları Maya floresan proteinleri kullanımı kapsanan13 yanı sıra teori ve Maya hücrelerinin 4d Konfokal görüntüleme uygulaması2. Bu protokol, 4D görüntüleme deneyinin temel pratik yönlerini üzerinde duruluyor. Daha önce açıklanan yordamların yanı sıra ımagej eklentisi kodunun ve belgelerinin güncelleştirilmiş sürümlerinin bazı geliştirmeleri içerir. Gösterilen örnek Golgi dinamiklerine odaklanır, ancak bu protokol diğer Maya bölmeleri görüntüleme için eşit derecede uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlık

  1. Floresan olmayan minimal NSD orta2olun. Riboflavin yokluğunda arka plan hücre içi yeşil floresans ve ilişkili fototoksisite azaltmak için bekleniyor.
  2. Bir gece ~ 23 °C ' de 5 mL NSD 'de Logaritmik faza, 50 mL 'Lik iyi havalandırmaya sahip bir şişlik ile mantar Gerinmesi büyütün. Yaklaşık 3-4 h önce analiz, taze NSD içinde Maya kültürü seyreltilebilir böylece son OD600 görüntüleme sırasında 0.5-0.8 olacaktır.
  3. Hazırlamak a 2 mg/mL çözüm concanavalin A (ConA). İstenirse, sıvı nitrojen ve mağaza-80 °c ' de bu çözümün plakaya dondurmak.
  4. , Imaging etkileyebilir partikül madde kaldırmak için bir mikrosantrifüjte tam hızda 5 dakika için ConA çözüm spin. Daha sonra temiz 35 mm coverglass alt mikroskopi çanak için süpernatant 250 μL ekleyin. 15 dakika sonra, 2 mL dH2O ve kuru let ile 2-3 kez yıkayın.
  5. ConA kaplı çanak için Maya kültürü 250 μL ekleyin, hücrelerin uymasına izin vermek için 10 dakika bekleyin ve 2 mL NSD ile 2-3 kez hafifçe yıkayın. Hücreleri 2 mL taze NSD ile koruyun.

2. görüntüleme

  1. Bir 63x veya 100x yağ daldırma lens kullanın. 1,40 sayısal diyafram (NA) yeterlidir, ancak daha yüksek bir NA lens de kullanılabilir.
  2. Kare boyutunu 256 x 128 (genişlik x yükseklik) olarak biçimlendirin. Daha büyük bir çerçeve boyutu gerekiyorsa, genișlik mikroskop rezonans tarayıcı ile donatılmış olduğu sürece genişliğin artırılması tarama hızını azaltmaz.
  3. Piksel boyutu ~ 80 nm yapmak için yakınlaştırma faktörü ayarlayın.
  4. Genellikle 8 kHz sırasına göre maksimum tarama hızını kullanın. Kullanılabilir olduğunda çift yönlü X taramasını açın ve denetim denemeleri iki yönde yapılan taramaların kayıt altında olduğunu onaylayabilir.
  5. Satır birikimini 4 veya 6 olarak ayarlayın. Ortalamasını yerine birikimi (toplama) kullandığınızdan emin olun.
  6. 1,2 havadar üniteler için iğne deliği ayarlayın. Ampirik olarak, görüntüleme canlı Maya hücreleri, bu ayar 1,0 standart seçim daha fazla fotonlar yakalar Airy ünite çözünürlük hiçbir değer kaybına neden iken.
  7. Her floresan kanalı için uyarma dalga boyu ayarlayın, yüksek hassasiyet dedektörü atayın, emisyon dalga boyu aralığını ayarlayın ve varsa foton sayım modunu açın. Dalga boyu seçimler fluorophores bağlı olacaktır. Örnek olarak, 485 nm 'de Gfp floresans heyecanlandırmak ve 495-550 nm toplamak ve 555 nm de mscarlet floresan heyecanlandırmak ve 562-625 nm toplamak.
  8. Her lazerin yoğunluğunu mümkün olduğunca düşük olarak ayarlayın. Bu ayar ampirik olarak belirlenmelidir. Uygun bir yoğunluk, 5 dakikalık bir filmin sonuna kadar% 50 ' den fazla olmayan floresan sinyal beyazlatma ile gürültülü ama yorumlanabilir görüntü dizisinin yakalanmasına neden olacaktır. Burada kullanılan konfokit mikroskop üzerinde (bkz. malzeme tablosu), bu yoğunluk% 5 sırasına göre bir lazer güç ayarına karşılık gelir.
  9. Çentik filtreleri veya coverslip yansıyan ışık yakalama önlemek için zaman gating kullanın. Zaman gating kullanılabilir ise, 0.6-10.0 NS için gating penceresini ayarlayın.
  10. Aydınlık alan görüntüleme açın ve veri toplama için düşük hassasiyet dedektörü kullanın. Artışı hücreleri açıkça görünür kılan bir düzeye ayarlayın. Ayırıcı parazit kontrastı (DıC) kullanmayın, çünkü prizma güvenilir floresan verilerinin yakalanmasına engel olur.
  11. Z-Step aralığını 0.25-0.35 μm olarak ayarlayın. Z-yığını başına 20-25 yaklaşık optik bölümler toplayarak Maya hücrelerinin tüm hacmi görüntü. "Aşağı" coverslip doğru hareket gibi görüntüleme yönlülük belirtin.
  12. Tipik bir film için, Z-yığınları arasındaki zaman aralığını 2 s 'ye ayarlayın ve film süresini 5 ila 10 dakika olarak ayarlayın. çalışma altındaki bölmeye bağlı olarak, nispeten hızlı dinamiklerin kısa filmleri yapmak için aralığı azaltmak veya daha uzun filmler yapmak için aralığı artırmak nispeten yavaş dinamikler.
  13. Filmi son kanalda aydınlık alan görüntülerle bir LIF dosyası olarak kaydedin. Bu aşamada daha yüksek bit derinliği gerekmez ve işlem ardışık düzeni 8 bitlik TIFF verilerini kabul edecek şekilde yapılandırılır.

3. deconvolution

  1. Klasik maksimum olasılık tahmini algoritmasını kullanarak deconvolution yazılımını başlatın ( malzeme tablosunabakın).
  2. 2,13 adımda oluşturulan veri kümesini açın. "Deconvolution Sihirbazı" nı seçin. "Parametre Sihirbazı" nda görüntülenen değerleri inceleyin. Görüntüleme parametreleri algılanmalı ve doğru şekilde görüntülenmelidir. "Kırılma indeksleri" altında, Maya sitoplazmasını yaklaşık olarak 1,40 için "gömme Med." değerini değiştirin. "Lamel magazini" altında "Başlat Düzenleyici" ve "tahmini pozisyon" ve "ok", lamel magazini konumunu ayarlamak için seçin. "Tüm doğrulanmış ayarla" ve "kabul et" i seçin.
  3. Her flüoresan kanal için "deconvolution Wizard" ile devam edin. Arka plan tahmini için mod olarak "El Ile" seçeneğini belirleyin. Genellikle 0,1 hakkında olan tahmini bir arka plan değerini belirlemek için ham veri floresans yoğunluğu profilini inceleyin.
  4. Deconvolution Kurulum menüsünde, 40 bir "maksimum yineleme" değerini girin ve çamaşır suyu düzeltmesi kapatın. Genellikle 5,0 hakkında bir tahmini SNR değeri girin. "Deconvolve" seçeneğine tıklayın.
  5. Gerekirse, orijinal veri dosyasına dönün, arka plan ve SNR değerlerini ayarlayın, ve deconvolution tekrarlayın, gürültü yeterince sönük yapılardan hakiki floresan ortadan kaldırılması olmadan kaldırılıncaya kadar.
  6. Aydınlık alan ve deconvolved floresan kanalları birleştirin. Imagej 'deki sonraki film düzenleme adımları için, kırmızı ilk olduğu gibi kanalları düzenleyin, yeşil (varsa) bir sonraki, mavi (varsa) sonraki, ve aydınlık alan son. Görüntü dizisini 8 bitlik TIFF dosyası olarak kaydedin.

4. Bleach düzeltme ve film üretimi

  1. Deconvolved görüntü dizisini ımagej 'ye içe aktarın ve Hyperstack 'e yığın > Görüntü > Hyperstacks 'ı seçerek bir hyperstack 'e dönüştürün. Açılır menüden "xyzct" seçeneğini seçin ve kanal sayısını, Z-yığını dilimleri ve zaman dilimlerini (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector) doldurun.
  2. Seçin görüntü > renk > kanalları Böl.
  3. Http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector adresinde bulunan ımagej eklentisini kullanarak fotobleaching için floresan kanallarını düzeltin. Bir kez bu eklenti indirilen ve yüklü, eklentileri > EMBLtools > Bleach düzeltme seçin. "Üstel Sığdır" ı seçin.
  4. Aydınlık alan ve çamaşır suyu düzeltilmiş floresan kanallarını bir hyperstack 'e birleştirmek için görüntü > renk > Kanalları Birleştir 'i seçin. Elde edilen hyperstack 'i 8 bitlik TIFF dosyası olarak kaydedin.
  5. Bu protokol ile sağlanan özel ımagej eklentileri yükleyin. Görüntü dizisini görüntülemek, düzenlemek ve ölçmek ve öngörülen Z yığınlarının son filmini oluşturmak için eşlik eden belgedeki yönergeleri izleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnek olarak burada verilen belgeler ve iki Maya Golgi sarnıkında olgunlaşma çift renkli 4D konfokk mikroskobu tarafından görselleştirilen olarak quantifies3. Bir Maya hücresi 10-15 Golgi sarnısı, her biri yaklaşık 2-4 dk bir zaman ders üzerinde olgunlaşır sırasını içerir. olgunlaşma, GFP ile erken Golgi Marker Vrg4 etiketleme ve kırmızı bir floresan ile geç Golgi Marker Sec7 etiketleme tarafından görselleştirilebilir mCherry veya mScarlet gibi protein. İlk olarak ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maya organelleri 4D Konfokal görüntüleme çoklu parametrelerin dikkatli ayarlama gerektirir. Büyük endişe fotobleaching ve fototoksisite. Tipik bir 4D film binlerce optik bölüm toplama içerir, böylece lazer aydınlatma mümkün olduğunca düşük tutulması gerekir. Tandem floresan protein etiketleri etiketli protein ifadesi artan olmadan sinyali artırmak için kullanılabilir16,17. Tarama hızını maksimize etmek, photodam sınırlamak için yardımcı olur ve aynı zamanda Z-yığ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NıH Grant R01 GM104010 tarafından desteklenmektedir. Vytas Bindokas ve Christine Labno, NıH destekli Kanser Merkezi Destek Grant P30 CA014599 tarafından desteklenen entegre mikroskobik çekirdek tesisi, floresans mikroskopisi ile yardım için teşekkürler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
35 mm cam alt tabaklar No. 1.5MatTekP35G-0.170-14-CGörüntüleme kapları
Concanavalin A tozuSigma-AldrichC2010
TroloxVektör LaboratuvarlarıCB-1000
Leica SP8 konfokal mikroskopLeica Microsystems
Leica Application Suite X Leica MicrosystemsMikroskop yazılımı
Huygens Essential yazılımı, sürüm 17.04Bilimsel Hacim GörüntülemeEvrişim Çözme yazılımı
ImageJNIHGörüntü işleme ve analiz yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
  2. Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
  3. Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
  4. Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
  5. Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
  6. Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
  7. Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232(2015).
  8. Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
  9. Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
  10. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
  11. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003(2017).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
  14. Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787(2017).
  15. Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).
  16. Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
  17. Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
  18. Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
  19. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
  20. Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
  21. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740(2015).
  22. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  23. Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

4D Konfokal MikroskopiMaya H cre G r nt lemeH cre i Kompartman DinamikleriGolgi Sisterna zlemeFloresan Zaman Serisi AnaliziImageJ Eklenti AnaliziDekonvol syon A artma D zeltmesiZ Y n Optik KesitlemeCanl H cre Maya K lt rFloresan Mark r Lokalizasyonu

İlgili makaleler