Burada, apoptotik meme kanseri hücreleri floresan aktif hücre sıralayarak yalıtmak ve daha fazla meme kanseri olmayan kök hücreleri meme kanser kök hücre gibi hücrelere geçişten sonra apoptosis ters akış sitometresi tarafından algılamak için bir iletişim kuralı mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama
Bu makalede
Özet
Özet
Temel mekanizmaları belirsiz kalırken Kanser nüks onkolog tarafından uzun eğitim gördü. Son zamanlarda, biz ve diğerleri apoptosis ters adında bir fenomen çeşitli hücre modelleri farklı uyaranlara altında artan tumorigenicity yol açar bulundu. Önceki çalışmalarda bu işlem tüp bebek ve içinde vivo izleme üzerinde duruldu; Ancak, yalıtım gerçekten ters hücre elde, hangi anlayışımız apoptosis ters sonuçları üzerinde sınırlar henüz. Burada, biz bir Caspase-3/7 yeşil algılama boya aktif caspases ile etiket hücrelere apoptotik indüksiyon sonra yararlanın. Hücre pozitif sinyaller ile daha da floresan aktif hücre (FACS) kurtarma için sıralama sıralanır. Confocal mikroskobu altında morfolojik muayene apoptotik durumu FACS önce onaylamak yardımcı olur. Tumorigenicity bir artış kez yükselmesi kanser kök hücre (CSC) yüzdesi olarak bağlanabilir-tarihlerde hücreleri. Ayrıca, meme kanseri heterojen göz önüne alındığında, bu CSC benzeri hücreler kaynağını tanımlayan kanser tedavisi için kritik olacaktır. Böylece, meme kanseri olmayan kök hücreleri apoptosis uyarının harekete geçirilmesine karşılık, caspase aktive hücreleri izole ve Apoptozis ters işlemi yapmadan önce hazırlayın. Akış Sitometresi Analizi meme CSC benzeri hücreleri meme CSC benzeri hücreleri apoptosis ters sırasında Meme kanseri olmayan kök hücrelerden aktarıldığı gösteren tersine çevrilmiş grubunda yeniden görünmesini ortaya koymaktadır. Özet olarak, bu iletişim kuralı tarafından akış sitometresi apoptotik meme kanseri hücrelerinin yalıtım ve CSC yüzde ters işlem hücrelerdeki değişiklikler tespiti içerir.
Giriş
Kanser ülkeler dünya çapında1ağır yükü neden ölüm önde gelen nedenidir olmuştur. Meme kanseri görülme sıklığı ve mortalite açısından hem de kanser1her türlü arasında kadın hastalarda sık ve yaygın yüksek. Kanser heterojenite nedeniyle ilaçlar genellikle kemoterapi kanser hücre ölüm2,3,4elde etmek için kullanılır. Ortak kemoterapötik ilaçlar kez DNA5,6hedef, ancak, hızla büyüyen hücreler9, protein sentezi7,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. meme kanseri hücreleri kök hazırlanması
- Kültür MCF-7 ve 10 mL % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) 100 mm çanak ile takıma fenol red ücretsiz Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta hücrelerde MDA-MB-231. Kültür T47D fenol red-Alerjik RPMI 1640 Orta 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş 10 ml % 10 ısı-FBS ve % 1 v/v penisilin-streptomisin (PS) 100 mm çanak inaktive olur. Bir % 5 CO2/95% hava hücre kültür kuluçka 37 ° C'de kültür hücreleri.
Not: Fenol kırmızısı floresans tabanlı algılama etkiler ama aynı zamanda onun östrojen benzeri efektler31nedeniyle meme kanser hücrelerini....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kanser hücrelerinin CD44 ilk sıralama meme CSC benzeri hücreleri kök olmayan meme geçiş incelemek için-/CD24+ meme kanseri hücrelerinin ihtiyaç. MCF-7 hücre satırı için hangi yaklaşık %0.15 hücreler özgün nüfus (Şekil 1), bu adımı CSC imleçli CSC zenginleştirme apoptosis tersine çevirme sırasında olasılığını dışlamak yardımcı oldu. Hiçbir hücre özgün nüfus CSC imleçli olsaydı, tam tersine, gibi T47D hücreleri (Şekil .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu iletişim kuralı meme kanseri olmayan kök hücreleri geçiş meme CSC benzeri hücrelere apoptosis ters bir sonucu olarak algılamak için doğrudan ve net bir şekilde açıklar. Tersine çevrilen bu hücreler CSC özelliklerinin onay immünyetmezligi fareler18,24,26 benn in vitro mammosphere oluşumu tahlil ve in vivo xenograft nakli kullanarak yardımcı ,27,.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser yenilikçi teknoloji Fonu yenilik teknoloji Komisyonu tarafından desteklenen: finansman desteği devlet anahtar laboratuvar, Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee-Seong Biyomedikal Araştırma Fonu ve Lee Hysan Vakfı. Y.X. CUHK üzerinden yüksek lisans öğrencilik tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MCF-7 | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) | HTB-133 | |
| Reaktif | |||
| 0.05% tripsin-EDTA | İnvitrojen | 25300054 | |
| % 0.25 tripsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V konjuge | Invitrogen | A35109 | |
| sığır serum albümini | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta 2H < alt > 2< / alt >O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent kaspaz-3/7 yeşil floresan boya | Invitrogen | C10423 | |
| dimetil sülfoksit | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc bloğu | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal sığır serumu | Invitrogen | 16000044 | ısıyla inaktive edilmiş |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamin | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoklonal antikorları | BD Biosciences | 555428 | PE Klon: ML5 < br / > Lot: 5049759< br / > RRID: |
| İnsan CD44'e karşı AB_395822 monoklonal antikorlar | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Klon: G44-26 < br / > Lot: 7230770 RRID: AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paklitaksel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Fare IgG2a, & İzotip Kontrolü | BD Biosciences | 554648 | Klon: G155-178 (RUO) RRID: AB_395491 |
| Penisilin-Streptomisin | İnvitrojen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Fare IgG2b, & İzotip Kontrolü | BD Biosciences | 558304 | Klon: 27-35 < br / > RRID: AB_647257 |
| fosfat tamponlu salin | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iyodür | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 orta | Invitrogen | 11835055 | fenol kırmızı içermeyen |
| sodyum azid | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporin | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Ekipman | |||
| 100 mm kültür kabı | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12 oyuklu doku kültürü plakaları | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Hücre Süzgeci 40 & mu; m naylon örgü | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite yazılım paketi v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 konfokal mikroskop | Olympus | IX81 | 60X objektif |
| FV10-ASW Viewer yazılımı Ver.4.2b | Olympus-yuvarlak | ||
| tabanlı polistiren 12 &zamanlar; 75 mm tüpler | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e ayırıcı | Bio-Rad | 1451006 |
Kaynaklar
- McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
- Slamon, D. J., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
