Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama

9.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58642

⸱

26 Ocak 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

Bu makalede

Özet

Burada, apoptotik meme kanseri hücreleri floresan aktif hücre sıralayarak yalıtmak ve daha fazla meme kanseri olmayan kök hücreleri meme kanser kök hücre gibi hücrelere geçişten sonra apoptosis ters akış sitometresi tarafından algılamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Temel mekanizmaları belirsiz kalırken Kanser nüks onkolog tarafından uzun eğitim gördü. Son zamanlarda, biz ve diğerleri apoptosis ters adında bir fenomen çeşitli hücre modelleri farklı uyaranlara altında artan tumorigenicity yol açar bulundu. Önceki çalışmalarda bu işlem tüp bebek ve içinde vivo izleme üzerinde duruldu; Ancak, yalıtım gerçekten ters hücre elde, hangi anlayışımız apoptosis ters sonuçları üzerinde sınırlar henüz. Burada, biz bir Caspase-3/7 yeşil algılama boya aktif caspases ile etiket hücrelere apoptotik indüksiyon sonra yararlanın. Hücre pozitif sinyaller ile daha da floresan aktif hücre (FACS) kurtarma için sıralama sıralanır. Confocal mikroskobu altında morfolojik muayene apoptotik durumu FACS önce onaylamak yardımcı olur. Tumorigenicity bir artış kez yükselmesi kanser kök hücre (CSC) yüzdesi olarak bağlanabilir-tarihlerde hücreleri. Ayrıca, meme kanseri heterojen göz önüne alındığında, bu CSC benzeri hücreler kaynağını tanımlayan kanser tedavisi için kritik olacaktır. Böylece, meme kanseri olmayan kök hücreleri apoptosis uyarının harekete geçirilmesine karşılık, caspase aktive hücreleri izole ve Apoptozis ters işlemi yapmadan önce hazırlayın. Akış Sitometresi Analizi meme CSC benzeri hücreleri meme CSC benzeri hücreleri apoptosis ters sırasında Meme kanseri olmayan kök hücrelerden aktarıldığı gösteren tersine çevrilmiş grubunda yeniden görünmesini ortaya koymaktadır. Özet olarak, bu iletişim kuralı tarafından akış sitometresi apoptotik meme kanseri hücrelerinin yalıtım ve CSC yüzde ters işlem hücrelerdeki değişiklikler tespiti içerir.

Giriş

Kanser ülkeler dünya çapında1ağır yükü neden ölüm önde gelen nedenidir olmuştur. Meme kanseri görülme sıklığı ve mortalite açısından hem de kanser1her türlü arasında kadın hastalarda sık ve yaygın yüksek. Kanser heterojenite nedeniyle ilaçlar genellikle kemoterapi kanser hücre ölüm2,3,4elde etmek için kullanılır. Ortak kemoterapötik ilaçlar kez DNA5,6hedef, ancak, hızla büyüyen hücreler9, protein sentezi7,8 ve/veya Mikrotubul dynamics sırasında en etkilenirler durgun kanser kök hücre (CSC) s gibi genellikle daha az etkilenen10hücrelerdir. CSCs vardır, bu nedenle, daha büyük olasılıkla daha sonra neden ilaç direnci ve Kanser nüks10,11tedavi sonrası hayatta kalmak. Bu nedenle, CSCs ortadan kaldırılması kanser tedavisi için önemli bir konu haline gelmiştir ve CSCs kökeni incelenmesi gereklidir.

Apoptozis ters olgusu üzerinde daha fazla çalışmalar son on yılda12,13,14,15,da16,17,18 gerçekleştirilmiş , 19. bu kavramı ortaya çıkması daha önce bu yaygın olarak hücreleri geri dönüşümsüz caspase harekete geçirmek sonra apoptosis geçirecek kabul edildi. Caspases karmaşık apoptotik oluşumu ve aşağı akım yüzeylerde20bölünme gibi apoptozis, başlatma ve yürütme aşamaları kilit rolü oynamak protein enzimler bir aileyiz. Cellat caspases caspase 3 veya caspase 7 gibi aktivasyonu "dönüş yok" apoptoz21olarak kabul edilmiştir. Ancak, araştırmacılar son zamanlarda apoptosis ters tüp bebek her ikisi de oluşur ve sırasında hangi hücrelerin içinde vivo, hatta caspase harekete geçirmek '12den sonra,13,14 apoptosis kurtarabilirsiniz gözlenen , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Ayrıca, agresif özellikler daha yüksek direnç özgün apoptotik uyarıcı ve daha yüksek invasiveness algılanır tersine çevrilmiş kanser gibi hücreleri15. Bu nedenle, CSC benzeri hücre yüzdesi daha yüksek sonunda daha malign özellikleri apoptosis ters18sonra katkıda tedavi edilmezse hücrelere kıyasla tersine çevrilmiş nüfus olurdu önerilmiş.

Daha önce birçok çabaları vitro ve daha da önemlisi, apoptozis ters içinde vivo izlemek için büyük ölçüde bu işlemi16,17,19evrenselliğini teyit yardımcı yapılmıştır. Ancak, ters hücre sonuçlarını sistemik bir çalışma nedeniyle gerçekten apoptosis ters uğramıştır hücre yalıtım yetersiz bulunmuyor. Saf apoptotik hücreler almak ve yeniden elde etmek onları için daha fazla çalışma için bir ihtiyaç vardır. Bu sayede apoptosis için "dönüş yok"21 marker olarak geleneksel olarak iyi kabul edilen işaretçiyi cellat caspase etkinleştirme kullanın ve floresan aktif hücre (caspase-aktive hücreleri lekeli ayırımcılık FACS) sıralama kullanmak caspase-3/7 yeşil algılama boya ile. Boya kovalent bir kısa amino asit dizisi, tanınan ve 3/7 active caspases tarafından i ciddi DEVD bağlanır. Bölünme sitozol nerede DNA'yı bağlar ve güçlü floresans yayar çekirdeği translocate boya yayın yardımcı olur. Bu yordamı kullanarak bir toplu hücre nüfus içinde bazı hücreler apoptosis geçirmiş değil önler.

CSCs veya tümör başlatılıyor hücreleri tek bir kullanarak birçok solid tümör tespit edilen veya bir arada çeşitli yüzey marker(s) ve bu hücreler çok az sayıda form tümörler immünyetmezligi fareler22,23için yeterli, 24,25,26,27. CD44 ve CD24 sık meme CSC çalışmalar ve CD44 kullanılmıştır+/CD24- hücreleri meme CSCs26,27,28,29 tanımlanan , 30. son zamanlarda, biz apoptosis ters ve CSCs önerilen ilişkisi onaylamak ve tersine çevrilmiş meme kanseri hücreleri artan tümör şekillendirme yeteneği tüp bebek ve ile vivo kazandı göstermek için deneyler bir dizi gerçekleştirdiyseniz bir CSC işaretleri18hücrelerle yükseltilmiş yüzdesi. Her ne kadar biz değil hariç olasılığını meme CSCs daha iyi hayatta kalmak ve böylece apoptosis ters sonra tekrar ne zaman biz olmayan kök kanser hücreleri ve konu izole olduğunu da önemlisi, zenginleştirilmiş onları apoptosis tersine çevrilmesine, CSC başlangıçta olmayan kök içinde ortaya çıkacak olmayan kanser hücre nüfus, düşündüren kök kanser hücreleri apoptosis ters sırasında CSCs yüzdesi artışa katkıda bulunabilir.

Bu makalede apoptosis ters sonra meme CSC benzeri hücreleri meme kanseri olmayan kök hücreleri geçiş göstermek ve bu geçiş akış sitometresi tarafından tespit etmek için amaçlamaktadır. Meme kanseri olmayan kök hücreleri başlangıçta CD44 izole ederek hazır mısın-/CD24+ meme kanseri hücreleri FACS tarafından. O zaman, apoptozis indüklenen ve morfolojik değişiklikler, mikroskop altında doğruladı. Daha sonra apoptotik hücreler olumlu etiketli-Caspase 3/7 yeşil algılama boya tarafından FACS tarafından izole ve daha da apoptotik indükleyicileri apoptosis ters için yokluğunda kültürlü. Tersine çevrilen hücreleri CSC işaretleri ile akış sitometrik çözümlemesi için kurtarma 7 gün sonra lekeli. CD44 hücrelerle+/CD24 yeniden tersine çevrilmiş nüfus- işaretçileri görünür düşündüren CSC benzeri hücreleri olmayan kök kanser hücrelerinin geçiş apoptosis ters sırasında oluştu.

Apoptozis ters birden fazla kanseri gözlenen yanı sıra normal primer hücre hücre hatları ile in vitro12,13farklı apoptotik uyaranların tedavi. Bu işlem aynı zamanda Drosophila içinde takip edilmiştir içinde vivo16,17,19model. Temel mekanizma ile ilgili fazla bilgi Kanser nüks farklı kanser hastalığı modelleri ve CSCs kökeni bu el yazması açıklandığı gibi tekniği kullanılarak elde edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. meme kanseri hücreleri kök hazırlanması

  1. Kültür MCF-7 ve 10 mL % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) 100 mm çanak ile takıma fenol red ücretsiz Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta hücrelerde MDA-MB-231. Kültür T47D fenol red-Alerjik RPMI 1640 Orta 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş 10 ml % 10 ısı-FBS ve % 1 v/v penisilin-streptomisin (PS) 100 mm çanak inaktive olur. Bir % 5 CO2/95% hava hücre kültür kuluçka 37 ° C'de kültür hücreleri.
    Not: Fenol kırmızısı floresans tabanlı algılama etkiler ama aynı zamanda onun östrojen benzeri efektler31nedeniyle meme kanser hücrelerinin büyümesini potansiyel bir etkisi vardır. Örneğin, fenol red progesteron reseptör ve büyüme MCF-7 hücreleri31teşvik. Bu da T47D hücreleri31büyümesini teşvik.
  2. Yıkama hücrelerle fosfat 2 mL serum fizyolojik (PBS) iki kez arabelleğe alınmış. MCF-7 ve MDA-MB-231 ve % 0.25 tripsin-EDTA T47D hücrelere 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA 2 mL ekleyin.
    Not: Uygunsuz bir konsantrasyon ifade deseninin CD44 ve CD2432gibi bazı hücre yüzey işaretlerinin etkileyebilir iken tripsin-EDTA konsantrasyonu hücreler farklı meme kanseri hücre tipleri arasında ayrılması için değişiklik.
  3. Bulaşıkları %5 CO2/95% hava bir atmosfer altında 37 ° C'de 5 min için kültür. Sık sık dekolmanı aşırı sindirim hücrelerden tripsin-EDTA tarafından önlemek için mikroskop altında hücre kontrol.
  4. Üzerinde % 90 hücreleri ayırdığınızda, yemek için tamamlanan RPMI orta 5 mL ekleyin ve birkaç kez hücre katmanı yüzey üzerinde pipette.
  5. Hücreleri bir 15 mL konik tüp ve santrifüj 300 x g ve 4 ° C 5 min için transfer.
    Not: Genellikle, confluency % 70 ulaştığında 6 x 10-6 hücreler bir 100 mm yemek elde edilebilir.
  6. Süpernatant atın ve granül 106 hücreler/100 μL FACS arabelleği (% 0.5 BSA ve % 0.1 Sodyum azid içeren PBS) adlı bir 1.5 mL microcentrifuge tüp resuspend.
  7. Hücreleri çeşitli tüpler içine bölün. MCF-7 hücreler için hücreleri 4 tüpler içine bölmek: iki izotip kontrol eder, CD24 tek adıma CD24 olumlu denetim ve bir çift boyama için boyama.
  8. T47D hücreler için hücreleri 3 tüpler içine bölmek: ikisi izotip kontrol eder ve bir çift boyama için.
  9. MDA-MB-231 hücreler için hücreleri 4 tüpler içine bölmek: iki izotip kontrol eder, CD44 tek adıma CD44 olumlu denetim ve bir çift boyama için boyama.
  10. Santrifüj tüpleri tekrar vasıl 300 x g ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle süpernatant atmak ve Fc blok 1:50 FACS arabelleği seyreltilmiş ekleyin.
  11. Santrifüjü 300 x g , karanlığın içinde 20 dk için buz üzerinde örnekleri kuluçkaya ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle süpernatant atın.
  12. İnsan CD44 karşı monoklonal antikor fluorochrome Birleşik ekleyin (PerCP-Cy5.5) ve CD24 (PE) (FACS arabellekte) 1:40 ve 1:10 dilutions çift içinde boyama grupları. CD44 olumlu denetim için eklemek (PerCP-Cy5.5) MDA-MB-231 için ve CD24 (PE) MCF-7 hücreleri aynı konsantrasyonu sırasıyla ekleyin.
    Not: CD44 ve C24 kombinasyonu meme CSC çalışma26,27,28,29,30' u sık kullanılan.
  13. İzotip kontrol grubu için PerCP-Cy5.5 fare Igg2b, κ 1:40 eklemek seyreltme izotip denetimin genişliği CD44 antikorlar ve PE fare Igg2a, κ 1:10 kadar seyreltme CD24 antikorlar, 106 hücreler/100 μL izotip kontrol olarak.
    Not: İzotip antikorları ilgi denetimlerinde negatif denetimleri33tavsiye edilir.
  14. (Kimden adım 1.12 ve 1.13) örnekleri için 30 dk santrifüj 300 x g de karanlıkta 4 ° C'de kuluçkaya ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle süpernatant atın.
  15. Pelet iki kez PBS ve santrifüj 300 x g ve 4 ° C 5 min için 500 μL ile yıkayın.
  16. Pelet PBS ve 40 µm naylon mesh filtreden 0.5 mL floresans aktif hücre sıralayıcıda çalıştırmadan önce resuspend.
  17. Perdeleme ve tazminat amaçlı MCF-7 hücre PE Birleşik anti-CD24 antikorlar ile leke ve PerCP-Cy5.5-Birleşik anti-CD44 antikor pozitif denetimleri hücrelerle MDA-MB-231 leke. İzotip denetimleriyle negatif kontrol eder (Şekil 1) lekeli hücreler kullanın.
  18. CD44 hücrelerle toplamak-/CD24+ işaretleri içeren koleksiyon Orta (% 20 ısı inaktive FBS ve % 2 v/v ile PS takıma fenol red-Alerjik RPMI 1640 orta) 1 mL yuvarlak alt polistiren 12 x 75 mm tüpler. 300 g ve RT x 5 min için tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    Not: Meme kanseri hücrelerinin CSC benzeri hücrelerde CD44 tanımlanan+/CD24- hücreleri26,27,28,29,30ve kanser hücrelerinin kök meme CD44 tanımlanan-/CD24+ hücreleri18 (Şekil 1).
  19. Sıralanmış meme olmayan kök kanser hücrelerinin % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 37 ° C'de daha fazla kültür için taze koleksiyonu Orta içeren kültür tabağına plaka.

2. apoptotik indüksiyon ve algılama

  1. 1 mM staurosporine12,34 DMSO hazırlayın. Tedavi MCF-7 grup için bir 15 mL konik tüp içinde son hacim (2,5 μm kalınlığında staurosporine) ilâ 10 mL yapmak MCF-7 hücre tamamlanan orta 1 mM staurosporine 25 μL ekler. Pipet içeriği eşit karıştırmak için.
  2. Kültür orta hücrelerden kaldırmak için bir kez PBS 2 mL hücrelerle yıkayın. Daha sonra 2,5 μm kalınlığında staurosporine ile orta 10 mL MCF-7 hücreleri hücre yoğunluğu % 70 confluency ulaştığında apoptosis ikna etmek 6 h için ekleyin.
  3. 1 mM paklitaksel35,36 DMSO hazırlayın. Tedavi T47D grubu için bir 15 mL konik tüp 10 mL (5 mikron paklitaksel) son hacmi telafi etmek için T47D hücrelerinin tamamlanan orta 1 mM paklitaksel 12.5 μL ekleyin. Pipet içeriği eşit karıştırmak için.
  4. Kültür orta hücrelerdeki kaldırmak ve PBS 2 mL hücrelerle bir kez yıkayın. Daha sonra 5 mikron paklitaksel ile orta 10 mL T47D hücreleri hücre yoğunluğu % 70 confluency ulaştığında apoptosis ikna etmek 10 h için ekleyin.
    Not: Yeni bir hücre satır ilk kez kullanıldığı her yerde indüksiyon zaman ve Apoptozis neden indükleyicileri konsantrasyonu optimize edilmelidir.
  5. Çözücü tedavi MCF-7 grubu için steril dimetil sülfoksit (DMSO) 25 μL 15 mL konik tüp içinde tamamlanan orta MCF-7 hücre 10 mL (yani, % 0.25 v/v DMSO) son bir hacim için telafi etmek için ekleyin. Pipet içeriği eşit karıştırmak için.
  6. Kültür orta çözücü tedavi MCF-7 hücrelerden kaldırmak için bir kez PBS 2 mL ile yıkayın. Daha sonra 6 h için % 0.25 v/v DMSO ile orta 10 mL çözelti denetimi olarak STS için ekleyin.
  7. Çözücü tedavi T47D grubu için bir 15 mL konik tüp 10 mL son hacim (yani, % 0.05 v/v DMSO) telafi etmek için T47D hücrelerinin tamamlanan orta steril DMSO 5 μL ekleyin. Pipet içeriği eşit karıştırmak için.
  8. Kültür orta çözücü tedavi T47D hücrelerden kaldırmak için bir kez PBS 2 mL ile yıkayın. Daha sonra 10 h için % 0.05 v/v DMSO ile orta 10 mL paklitaksel için solvent denetimi olarak ekleyin.
  9. Tedavi hücre morfolojik değişiklikleri gözlemledikten, bağışıklık hücreleri ile 50 için nM Mitotracker kırmızı CMXRos ve 250 ng/mL Höchst 33342 ve başka bir 20 min için bir atmosfer altında 37 ° C'de % 5 CO2/95% hava kuluçkaya. Tipik apoptotik hücre morfolojisi bir 60 x confocal lazer mikroskop (Şekil 2) tarama altında gözlemlemek.
    Not: Tipik apoptosis morfoloji içerir hücre büzülme, membran blebbing, mitokondri parçalanma ve nükleer yoğunlaşma ama sağlam hücre membran12,13,14,15 ile ,18,37.

3. yalıtım apoptotik hücreler ve Apoptozis ters yordamı

  1. Apoptotik uyarıcı ve solvent-tedavi edilen MCF-7 veya 3 mikron Caspase-3/7 yeşil algılama boya 106/mL içinde belgili tanımlık karanlık bir atmosfer altında 37 ° C'de 30 dk % 5 CO2/95% hava için hücre konsantrasyonu, hücrelerle T47D leke.
  2. 40 µm naylon mesh ile hücreleri sıralamak için sıralayıcıda çalıştırmadan önce filtre.
  3. Amacıyla geçişi için ilk büyük nüfus (R1) kapı ve enkaz nokta ileri dağılım ve yan dağılım (Şekil 3) ile grafik olarak çizme tarafından hariç.
  4. Tedavi edilmezse hücre negatif bölge (R2) kapı için bir negatif kontrol Caspase-3/7 yeşil algılama boya eklemeden kullanın (Şekil 3A).
  5. Staurosporine12,18,34 24 h ile tedavi ve boya ile olumlu bir denetim olarak lekeli hücreleri olumlu bölge (R3) kapı için kullanın (Şekil 3B).
  6. Pozitif hücrelerinin (R3) yuvarlak alt polistiren 12 x 75 mm tüpler koleksiyonu Orta (aynı koleksiyon orta adım 1,18) (Şekil 3C-3D) 1 mL içeren uyarıcı tedavi gruplarında toplamak. 300 g ve RT x 5 min için tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  7. Negatif hücreleri (R2) yuvarlak alt polistiren 12 × 75 mm tüpler ile 1 mL çözücü tedavi gruplarında koleksiyon orta adım 3.6 (rakamlar 3E-3F) olduğu gibi toplamak.
    Not: Hücreleri (örneğin 10.000 hücreleri) küçük bir bölümünü toplanan ve etkin caspases işaretçisi desen kontrol etmek sıralayıcıda yeniden çalıştırın. Caspase negatif bölgede sıralanmış çözücü tedavi hücrelerinin % 90 üzerinde gösterilir veya sıralanmış uyarıcı tedavi hücrelerinin % 90'ı caspase pozitif bölgede üzerinde gösterilir, bu kendine hakim hücre nispeten saf (rakamlar 3 C-3F) olduğu düşünülmektedir. Aksi takdirde, sıralama bölge ve/veya Sıralayıcı sıfırlamanız gerekir.
  8. Taze koleksiyonu Orta sıralanmış hücrelerde resuspend ve onları 12-iyi doku kültürü plakaları ve % 5 CO2/95% hava bir atmosfer altında 37 ° C'de kültür apoptosis ters için 7 gün için temel olarak belirler.

4. onay apoptozis hücre Caspase-harekete geçirmek

  1. Annexin-bağlama arabellek (pH 7,4) hazırlamak için Mix 10 mM HEPES, 140 mM NaCl ve 2.5 mM CaCl2 . Arabellek 4 ° C'de depolayın ve ışığa maruz için tampon kaçının.
  2. 100 µg/mL çalışan bir çözüm propidium iyodür (PI), annexin-bağlama arabellek 45 µL PI hisse senedi çözümde sulandrarak 5 µL 1 mg/ml tarafından hazırlayın. Çözüm 4 ° C'de depolayın ve çözüm ışığa maruz kaçının.
    Not: PI potansiyel bir alkil ve dikkatle ele alınmalıdır.
  3. Olduğu gibi adımlar 2,1-2.5 uyarıcı tedavi hücreleri hazırlayın.
  4. Uyarıcı tedavi MCF-7 veya T47D hücreleri Orta hücre katmanı üzerinden hücreleri ayırmak için 3-5 x pipetting tarafından toplamak. Hücreleri 15 mL konik tüp aktarın.
  5. 300 g ve RT x 5 dk. atma süpernatant, santrifüj kapasitesi.
  6. 106/mL 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde hücre konsantrasyonu, tamamlanan orta hücrelerle resuspend ve 3 mikron Caspase 3/7 yeşil algılama boya 37 ° C'de 30 dk için karanlıkta hücrelerle leke
  7. 5 dk. atmak için supernatants vasıl 300 x g ve RT santrifüj kapasitesi.
  8. Buz gibi PBS ve santrifüj 300 x g , 1 mL hücrelerle yıkayın ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle atın supernatants.
  9. Annexin-bağlama arabellek 100 μL annexin V eşlenik Ekle 5 μL ile hücrelerde resuspend ve 100 µg/ml 1 µL çalışma çözüm her 100 μL hücre süspansiyon için PI ve oda sıcaklığında 15 dk için hücreleri kuluçkaya.
    Not: Annexin V ve PI sık birlikte akış sitometresi38,39,40apoptotik hücrelerde etiketlemek için kullanılır.
  10. Annexin-bağlama arabellek, karışımı 400 µL yavaşça ekleyin. Buz üzerinde örnekleri üzerinde bir akış sitometresi çalıştırmadan önce tutmak.

5. meme CSC benzeri hücreleri tarafından akış sitometresi ölçümü

  1. Tersine çevrilen MCF-%7 0.05 tripsin-EDTA ile her iki uyarıcı veya çözücü tedavi grubu'hasat. T47D hücreleri uyarıcı veya çözücü tedavi her iki grupta veya % 0.25 tripsin-EDTA olduğu gibi adımları 1.2-1.5 ile hasat.
  2. İnsan CD44 karşı monoklonal antikor fluorochrome Birleşik hücrelerle leke (PerCP-Cy5.5) ve CD24 (PE) adım 1.12 olduğu gibi. Bu arada, adım 1,13 olduğu gibi izotip denetimleri hazırlamak.
  3. Hücreleri üzerinde bir akış sitometresi çalıştırın ve CD44 hücrelerle yüzdesi tespit+/CD24- işaretleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kanser hücrelerinin CD44 ilk sıralama meme CSC benzeri hücreleri kök olmayan meme geçiş incelemek için-/CD24+ meme kanseri hücrelerinin ihtiyaç. MCF-7 hücre satırı için hangi yaklaşık %0.15 hücreler özgün nüfus (Şekil 1), bu adımı CSC imleçli CSC zenginleştirme apoptosis tersine çevirme sırasında olasılığını dışlamak yardımcı oldu. Hiçbir hücre özgün nüfus CSC imleçli olsaydı, tam tersine, gibi T47D hücreleri (Şekil ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu iletişim kuralı meme kanseri olmayan kök hücreleri geçiş meme CSC benzeri hücrelere apoptosis ters bir sonucu olarak algılamak için doğrudan ve net bir şekilde açıklar. Tersine çevrilen bu hücreler CSC özelliklerinin onay immünyetmezligi fareler18,24,26 benn in vitro mammosphere oluşumu tahlil ve in vivo xenograft nakli kullanarak yardımcı ,27,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser yenilikçi teknoloji Fonu yenilik teknoloji Komisyonu tarafından desteklenen: finansman desteği devlet anahtar laboratuvar, Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee-Seong Biyomedikal Araştırma Fonu ve Lee Hysan Vakfı. Y.X. CUHK üzerinden yüksek lisans öğrencilik tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MCF-7Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)HTB-22
MDA-MB-231Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)HTB-26
T47DAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)HTB-133
Reaktif
0.05% tripsin-EDTAİnvitrojen25300054
% 0.25 tripsin-EDTAInvitrogen25200072
Alexa Fluor 680 annexin V konjugeInvitrogenA35109
sığır serum albüminiUSB9048-46-8
CaCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta 2H < alt > 2< / alt >OSigma-AldrichC-5080
CellEvent kaspaz-3/7 yeşil floresan boyaInvitrogenC10423
dimetil sülfoksitSigma-AldrichD2650
Fc bloğuMiltenyi Biotec130-059-901
fetal sığır serumuInvitrogen16000044ısıyla inaktive edilmiş
HEPESUSB16926
Hoechst 33342InvitrogenH3570
L-glutaminInvitrogen25030081
Mitotracker Red CMXRosInvitrogenM7512
monoklonal antikorlarıBD Biosciences555428PE Klon: ML5 < br / > Lot: 5049759< br / > RRID:
İnsan CD44'e karşı AB_395822 monoklonal antikorlarBD Biosciences560531PERCP-CY5.5 Klon: G44-26 < br / > Lot: 7230770
RRID: AB_1727485
NaClSigma-Aldrich31434
paklitakselSigma-AldrichT7402
PE Fare IgG2a, & İzotip KontrolüBD Biosciences554648Klon: G155-178 (RUO)
RRID: AB_395491
Penisilin-Streptomisinİnvitrojen15070-063
PerCP-Cy5.5 Fare IgG2b, & İzotip KontrolüBD Biosciences558304Klon: 27-35 < br / > RRID: AB_647257
fosfat tamponlu salinThermo Fisher Scientific21600010
propidium iyodürInvitrogenP1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 ortaInvitrogen11835055fenol kırmızı içermeyen
sodyum azidSigma-AldrichS2002
staurosporinSigma-AldrichS4400
Ekipman
100 mm kültür kabıGreiner Bio-One664160
12 oyuklu doku kültürü plakalarıThermo Fisher Scientific150628
Hücre Süzgeci 40 & mu; m naylon örgüBD Biosciences08-771-1
FACSuite yazılım paketi v1.0BD Biosciences651360
FACSVerseBD Biosciences651155
FluoView FV1000 konfokal mikroskopOlympusIX8160X objektif
FV10-ASW Viewer yazılımı Ver.4.2bOlympus-yuvarlak
tabanlı polistiren 12 &zamanlar; 75 mm tüplerBD Biosciences352003
S3e ayırıcıBio-Rad1451006
İnsan CD24'e karşı

Kaynaklar

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015(2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357(2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685(2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Meme Kanseri Kök HücreleriAkış SitometrisiFloresanla Aktive Edilmiş Hücre AyıklamaKonfokal MikroskopiKaspaz-3/7 TespitiCD44 CD24 MarkörleriKök Hücre Olmayan Kanser HücreleriTümörijenisite Analizi
Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.