Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

Özet

Burada, analiz ve görselleştirme yapısı ve bütün antikor kapsayacağını Anayasası için iletişim kuralları açıklar. Bu büyük yeni nesil sıralama kullanarak antikor RNA dizisi edinimi içerir.

Özet

Antijen tanıma antikorlar tarafından büyük uyum Edinsel bağışıklık sisteminin temelidir. Anlayışımızı geniş repertuar antikor üretimini Edinsel bağışıklık sistemleri tarafından temel moleküler mekanizmaları rağmen bu henüz tam antikor repertuar küresel bir bakışta gelmesi mümkün olmamıştır. Özellikle, B hücre kapsayacağını antikor klonlar astronomik onların sayısı nedeniyle bir kara kutu kabul edilmiştir. Ancak, yeni nesil sıralama teknolojileri B hücre repertuar bilgimizi artırmak devrimler etkinleştiriyorsanız. Bu raporda, görselleştirmek ve tüm bireysel fare ve insan antikoru kapsayacağını çözümlemek için basit ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bağışıklık organ, dinlerinden farelerde dalak ve periferik kan mononükleer hücrelerin insanlarda, toplam RNA transkripsiyonu ve 5'-yarış yöntemi kullanılarak güçlendirilmiş hazırlanmış, geriye doğru. Evrensel bir ileri astar ve antianlamlı astar antikor sınıfa özgü sürekli etki alanları için kullanarak, antikor mRNA'ların düzgün frekansları antikor nüfus yansıtan oranlarda güçlendirilmiş. Amplicons tarafından 10'dan fazla⁵ antikor dizileri immünolojik örnek başına verimli yeni nesil sıralama (NGS), sıralı. Antikor sıra analizleri V (D) J-gen-segment ek açıklama, kuşbakışı antikor repertuar ve bizim hesaplama yöntemleri de dahil olmak üzere iletişim kuralları açıklar.

Giriş

Antikor sistemi Edinsel bağışıklık sisteminin temelleri biridir. Patojenler geniş çeşitliliği, iyi Antijen tanıma özgüllük ve antijen spesifik B hücreleri klonal genişlemesi nedeniyle işgal karşı son derece güçlü. B hücreleri antikor üreten repertuar 10'dan fazla olduğu tahmin edilmektedir¹⁵ tek tek tek¹. Bu büyük çeşitlilik VDJ gen rekombinasyon immünglobulin genetik loci²yardımıyla oluşturulur. Tüm B hücre kapsayacağını ve yanıt antijen-aşılama için dinamik değişiklikleri açıklaması bu nedenle zorlu ama patojenler istila karşı antikor yanıt tam bir anlayış için gerekli.

Astronomik onların çeşitlilik nedeniyle, B hücre repertuarında bir kara kutu kabul edilmiştir; Ancak, NGS teknolojisi gelişine devrimler onların karmaşıklığı^3,4gelişmiş bir anlayış için sağlamıştır. Bütün antikor kapsayacağını başarıyla, öncelikle Zebra balığı⁵, sonra fare⁶ve insanlar^6,7analiz edilmiştir. NGS şimdi edinilmiş bağışıklık yanıtının çalışmada güçlü bir araç haline gelmiştir rağmen ortak ve antikor kapsayacağını bireysel hayvanlar arasında farklılıklar temel analizleri eksik vardır.

Farelerde, Igg1 ve IgG2c bireyler⁸arasında önemli ölçüde farklıdır, ancak IgM kapsayacağını bireyler arasında hemen hemen aynı olduğunu bildirildi. V-gen kullanım profili ek olarak gözlenen VDJ-saf periferik B hücreleri profilinde bireyler⁸arasında son derece benzer sıklığıdır. VDJ bölge amino asit dizisi analizi de-daha önce düşünce⁸' den çok daha sık farklı fareler aynı bileske dizileri oluşumunu gösterdi. Bu sonuçlar antikor repertuar oluşumu için mekanizmalar Stokastik yerine belirli^5,8,9olabilir gösterir. Farelerde antikor repertuar geliştirme sürecinin başarıyla NGS daha fazla ayrıntı¹⁰antikor bağışıklık sisteminde ortaya çıkarmak için NGS potansiyelini vurgulamak için kullanılarak da analiz.

Bu raporda, görselleştirmek ve bir antikor repertuar, genel bir düzeyde analiz etmek için basit ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri kurumsal esaslarına göre ve Ulusal Enstitüsü bulaşıcı hastalıklar hayvan bakımı ve kullanımı kurulu onayı ile yapıldı. PBMCs örnekleme temsilcisi sonucu bu raporda Etik Komitesi, Ulusal Enstitüsü, bulaşıcı hastalıklar, Tokyo, Japonya, onayı ile gerçekleştirilen ve aydınlatılmış onam yazılı olarak kullanılan sağlıklı yetişkin gönüllülerden elde edildi Her katılımcıdan bir Etik Komitesi tarafından onaylanan form kullanarak.

1. primer tasarım

1. CDNA immünglobulin yükseltmek için bir evrensel ileri astar tasarım mRNA olarak 5'-yarış^11,12 ve akıllı-PCR¹³ teknikleri kullanılan PCR astar, önyargı olmadan.
2. İmmünglobulin VH gene amplifikasyon için ters astar^8,14 olarak (şekil 1A) immünglobulin sınıf özel sıraları sabit bölgede tasarlayın.
   Not: Herhangi bir kütüphane molekülleri farklı örnek kaynaklardan etiketlemek için bu astar Multiplex etiketi dizileri eklenebilir. İç içe geçmiş PCR dizileri de, kullanılan seti¹⁵rehberine göre eklenebilir.

Evrensel ileri astar	5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
Fare immünoglobulinler (Ref.8) için ters astar
IgM_CH1:	5'-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 '
IgG1_CH1:	5'-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 '
IgG2c_CH1:	5'-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 '
IgG3_CH1:	5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3'
IgA_CH1:	5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3'
Igκ_CH1:	5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 '
Igλ_CH1:	5'-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 '
İnsan immünoglobulinler (Ref.14) için ters astar
IgM_CH1:	5'-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 '
IgG_CH1:	5'-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 '
IgD_CH1:	5'-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 '
IgA_CH1:	5'-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 '
IgE1_CH1:	5'-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 '
IgE2_CH1:	5'-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 '
Igκ_CH1:	5'-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 '
Igλ_CH1:	5'-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 '

Tablo 1: Astar dizileri PCR-immünglobulin amplifikasyon

2. nükleik asit izolasyon bağışıklık hücreleri ve doku

Not: aşağıda verilen fare dalak nükleik asitler ayıklamak için bir yöntemdir. Ancak, diğer bağışıklık doku ve lenf bezleri gibi insan hücreleri veya periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) (şekil 1B) için geçerlidir.

1. Teşrih doku, örneğin, bir 8 haftalık C57BL/6 fareden dalak ve dağınık hücreleri elde etmek için PBS arabelleğinin 2 mL ile paslanmaz çelik kafes (200-400 µm) geçer. Hücre süspansiyon 2.0 mL microcentrifuge tüp ve santrifüj 600 × g ve 4 ˚C 5 min için transfer. Süpernatant atmak.
2. ACK lysing arabelleği (150 mM NH₄Cl, 1 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA, pH 7.2) 800 µL için Pelet ekleyin ve buz kırmızı kan hücreleri doku koşullar için 2 dakika için üzerinde kuluçkaya.
3. PBS 3 2 mL ile doku hücreleri yıkama x 600 × g ve 4 ˚C 5 min için Santrifüjü ardından,.
4. Fenol/guanidin isothiocyanate reaktif 800 µL Pelet için eklemek girdap iyice ve 5 min için yaklaşık 25 ˚C, kuluçkaya.
5. Kloroform (200 µL) eklemek, el sallamak için 15 s ve yaklaşık 25 ˚C 2 min için kuluçkaya.
6. Santrifüjü 12.000 × g ve 25 ˚C 15 dakika tarafından fazlar ayrı ve üst sulu faz için taze bir tüp aktarın.
7. % 70 etanol, girdap kısaca bir birim eklemek ve silis spin sütun için geçerlidir.
8. RNA 30-100 µL su ile elute.
9. Bir yer (Tablo reçetesi) kullanarak ilk RNA konsantrasyon quantitate.
10. -80 ˚C, saflaştırılmış RNA saklayın.

3. cDNA sentezi ve PCR güçlendirme

Not: aşağıda açıklanan yöntem 5'-yarış^11,12 ve akıllı-PCR teknikleri¹³üzerinde temel alır. Ayrıntılar ve optimizasyon reaksiyon seti ¹⁵kılavuzunda açıklanmıştır. Başlangıç için fare immünglobulin 2.10. adımdaki örnek malzemelerdir. Başlangıç için insan immünoglobulin 2.3-2,10 adımlarda açıklandığı gibi tedavi örnek insan dokular, ex. PBMC, malzemelerdir.

1. 2 ilk iplikçikli cDNA 5'-yarış CD astar (oligo-dT-içeren) ve akıllı-PCR Oligonükleotid (Tablo reçetesi) üreticinin yönergeleri¹⁵göre kullanarak toplam RNA şablonunun 10 µg için sentez.
   1. Fare immünglobulin için yüksek sadakat DNA polimeraz evrensel ileri astar ve immünglobulin sınıfa özgü ters astar (Tablo 1) kullanarak ile cDNA PCR yükseltmek. Olarak termal bisiklet koşullarını ayarla: 94 ˚C 2 dk sonra 40 94 ˚C devredir 30 için s, 30 59 ˚C s ve 30 72 ˚C s, 5 min için 72 ˚C son uzantısı adımda izledi.
      Not: Saf, bağımlı Th1 ve Th2 bağımlı B hücreleri (şekil 3) bakmak için IgM, Igg1, IgG2c, Igk ve Igl immünglobulin sınıfları tipik deneyler yükseltmek.
   2. İnsan immünoglobulin için 1^st PCR evrensel ileri astar ve immünglobulin sınıfa özgü ters astar (Tablo 1) etiket sıralarıyla kullanarak gerçekleştirin. 2^nd tarafından PCR her örnek için dizin serilerini içeren dizin sırası primerler kullanılarak. Aşağıdaki PCR koşulları ve Taq polimeraz kullanma: 94 ˚C 2 dk, 21 döngüsü (1^st PCR) veya 32 döngüsü (2^nd PCR) 94 ˚C sırasında 30 s, 30 59 ˚C s, 30 72 ˚C s.
      Not: Tipik deneyler yükseltmek IgM, IgD, IgG (Igg1, Igg2, Igg3 ve Igg4), Iga (Iga1 ve Iga2), IgE, Igk ve Igl immünglobulin sınıflar tüm B hücre popülasyonlarının (şekil 4) bakmak için.
2. Bir özel jel PCR ürünlerde electrophorese ve 600-800 bp parçaları bir silika membran spin-sütun kullanarak arındırmak.
   1. 3.2.1 veya %3.2.2 2 özel jel üzerinde örnek electrophorese.
   2. UV-transilluminator DNA bands görselleştirmek ve 600-800 arasında geniş bant içeren jel-dilim tüketim bp.
   3. Membran bağlama çözüm 10 mg jel dilim başına 10 mL ekleyin. Mix ve jel dilim tamamen eriyene kadar 50-65 ° C kuluçkaya.
   4. Jel çözüm silis membran spin-sütun aktarın. Bir kez arabellek yıkama ile yıkama ve DNA nükleaz ücretsiz su (Malzemeler tablo) ile 50 mL elute.
3. NGS sıralama için eşit miktarda her immünglobulin sınıftan bir yer ve havuzu amplicons ile saf amplicons ölçmek.
   Not: Genellikle, her immünglobulin sınıf için 2-10 mg amplicon DNA'sı bulundu. Her örnek çözümü tutardaki yükselişi 50 mL solüsyon içeren 10-20 ng DNA/mL vermek aynı derecede DNA karıştırın.
4. Boyutu ve konsantrasyon kütüphanelerin bir mikro-kılcal tabanlı Elektroforez DNA boyutlandırma küçük parça (Malzemeler tablo) ile kullanarak belirler. -20 ° C'de kitaplık depolamak

4. NGS sıralama kütüphanelerin

1. Bir SampleSheet.cvs sıralama çalışma belirten örnek adı, dizin bilgilerini oluşturmak ve yalnızca .fastq dosyaları edinmek için talimat.
2. Reaktif kartuşu (Malzemeler tablo) ve kütüphaneler çözülme.
3. 0.2 N NaOH yapmak ve istenen molar konsantrasyonu elde etmek için kitaplıklarına oranında seyreltin.
4. Durulayın ve kuru akışı hücre. Seyreltilmiş ve denatüre Kütüphane çözüm 600 mL reaktif kartuşu kuyunun içine ekleyin.
5. Sıralama Çalıştır başlatın.

5. kalite kontrol NGS veri

1. "FASTX-Toolkit"¹⁶ile FASTQ veri kalite kontrolünü gerçekleştirin.
   Not: Kullanılan parametre ayarları temel bir örneği aşağıdaki gibidir:
   fastq_quality_trimmer - v -t 20 - l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
   fastq_quality_filter - v - s 20 - p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
   fastx_reverse_complement - v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
2. "Fasta nükleik asit (.fna)" için çıkış dosyalarının aşağıdaki komutu tarafından Biçimlendir:
   fastq_to_fasta - v - n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]

6. çıkarma ve immünglobulin dizileri .fna veri analizi

Not: Örnek programlar bir UNIX ortamında uygulamaya edildi. Lütfen performans işletim sistemi ve donanım ortamı bağlı olabilir çünkü bir örnek başvuran olarak kullanmak. Yazarlar için hata veya eksiklikler herhangi bir sorumluluk kabul etmiyoruz. Programlama dilleri, Perl¹⁷, R¹⁸ve gerekli modülleri atıf Web siteleri talimatlara göre yüklü olması gerekmektedir. IgBLAST programın uygun Web sitesi^19,20talimatlara göre yüklenmesi gerekir.

1. Kurum içi programlar repertuar analizleri için aşağıdaki örnekleri https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine download:
   03_PipeLine_Mouse.zip; Bir dizi örnek program fare antikor sıralarının analizleri için.
   05_PipeLine_Human.zip; Bir dizi örnek program insan antikoru sıralarının analizleri için.
2. Antikor okur sıra verilerde özü: imza dizileri her immünglobulin sabit bölgede (Tablo 2) arama bir Perl programı tarafından veri (.fna) her IG-sınıf immünglobulin (Ig) dizileri ayıklamak.
   1. Fare immünglobulin ağır zincir (IgH) genler için aşağıdaki komutu tarafından okuma çıkarımı:
      $ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)]
   2. Fare immünglobulin hafif zinciri için (IgL) genler tarafından aşağıdaki komutu okur çıkarımı:
      $ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)]
   3. İnsan immünoglobulin ağır zincir (IgH) gen için aşağıdaki komutu tarafından okuma çıkarımı:
      $ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)]
   4. İnsan immünoglobulin hafif zincir (IgL) gen için aşağıdaki komutu tarafından okuma çıkarımı:
      $ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)]
3. Ek açıklama eklemek ve V (D) J gen rekombinasyon verimliliğini kontrol edin:
   Not: tek başına IgBLAST¹⁹ V (D) J gen segmentlerinin sıradaki eklenti için aşağıda açıklanan yöntemi kullanır. V (D) J genler için veritabanı ve IgBLAST parametre ayarlarını açıklanan²⁰ayarlayın.
   1. Fare immünglobulin ağır zincir (IgH) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organizma fare - domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.Aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
   2. Fare immünglobulin hafif zincir (IgL) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organizma fare - domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.Aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
   3. İnsan immünoglobulin ağır zincir (IgH) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organizma insan - domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
   4. İnsan immünoglobulin hafif zincir (IgL) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organizma insan - domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/human_gl.Aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
4. Bir antikor repertuar genel özelliği görselleştirin.
   1. Fare IgH repertuarı aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin:
      $ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
      Not: Giriş dosyası filename.fna (sıralı veri), tercihen olduğunu 6.2.1 çıkış dosyasından. Bu dosyanın "dosya adı" adlı bir alt dizinde (klasör) yerleştirilmesi gerekir. Kabuk komut satırını 50, Para_4 için bir "dosya adı" atayın.
   2. İnsan IgH repertuarı aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin:
      $ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
      Not: Giriş dosyası filename.fna sıra, tercihen 6.2.3 çıktı dosyası veridir. Bu dosyanın yerleştirilmesi gerekir "dosya adı" alt dizininde (klasör) o adıdır. Kabuk komut satırını 46, Para_4 için bir "dosya adı" atayın.
   3. Fare IgL repertuar aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin:
      $ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
      Not: Bu boru hattı ile Igk ve Igl kullanılazlar işlenir. Giriş dosyası filename.fna (sıralı veri), tercihen olduğunu 6.2.2 çıkış dosyasından. Bu dosyanın "dosya adı" adlı alt dizinde (klasör) yerleştirilmesi gerekir. Kabuk komut satırını 53, Para_4 için bir "dosya adı" atayın. Çıkış dosya adının, "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" ile biten iki boyutlu bir çubuk grafik (şekil 3, IgL) koordinatlarını verir.
   4. İnsan IgL repertuar aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin:
      $ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
      Not: Bu boru hattı ile Igk ve Igl kullanılazlar işlenir. Giriş dosyası filename.fna sıra, tercihen 6.2.4 çıktı dosyası veridir. Bu dosyanın "dosya adı" adlı bir alt dizinde (klasör) yerleştirilmesi gerekir. Kabuk komut satırını 53, "dosya adı" Para_4 için atayın. "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" ile biten çıktı dosyası adı (şekil 4, IgL) iki boyutlu bir çubuk grafiği koordinatlarını verir.

Sonuçlar

Antikor kapsayacağını fare

Hücreleri veya doku dalak, kemik iliği, lenf nodu veya kan gibi bir fare antikor repertuar bir bütün olarak bir bakış elde edilebilir. Şekil 3 hafif zincir (IgL) kapsayacağını saf fare dalak üzerinden IgM, Igg1, IgG2c ve immünglobulin temsilcisi sonuçlarını gösterir. Okuma numaraları özetini Tablo 3' te gösterilmiştir. Örneğin, 166,175/475,144 okuma IgM özgü imza sırası (Tablo 2) yer alan ve 133,371/166,175 okuma VDJ üretken IgBLAST¹⁹tarafından ima edildi.

Şekil 3 VDJ düzenlenmesi 3D-VDJ-arsa, her topu büyüklüğünde okuma göreli sayısı temsil eden tarafından bir repertuar profili gösterir; başka bir deyişle, tüm B hücreleri antikor mRNA'ların sayısı. 110 IGHV, 12 IGHD ve 4 IGHJ, kromozom üzerinde onların sipariş yansıtacak şekilde uyumlu 3-b kafes oluşur. Buna ek olarak, belirsizce IgBLAST tarafından atanan genler ayrı ayrı cuboid 7,215 düğümlerin sebebiyet veren her IGHV, IGHD ve IGHJ satır için son olarak toplanmıştır.

Aynı zamanda, şekil 3 ' te VJ-düzenlenmesi profilinde IgL repertuar bir 2D-VJ-arsa gösterilen gösterilmiştir. Bu arsa üzerinde her çubuğunun uzunluğu okuma göreli sayısı temsil eder. X ekseni 101 IGLVκ ve 3 IGLVλ genler ve 4 IGLJκ ve 3 IGLJλ gen y ekseni temsil eder. Unannotated V - ile J-gen değil sınırda temsil edilir.

Tamamlayıcılık belirleyen bölge 3 (CDR3) antijen bağlayıcı özgüllük çoğunluğu ortaya çıkmasına, bu verimli okuma dizisi verilen IgBLAST çıkışlarını içinde. Dizileri istatistiksel analiz edilebilir CDR3, çoğaltır, biyolojik ya da teknik olarak dahil olmak üzere^8,10daha önce açıklanan.

İnsan antikoru kapsayacağını

Bir insan antikoru repertuar bir bütün olarak bir bakış çeşitli periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) de dahil olmak üzere dokularda veya patolojik dokuları analiz edilebilir. Şekil 4 temsilcisi IgM, sonuçlarını gösterir IgA (Iga1 ve Iga2), IgD, IgE ve IgL toplam, toplam IgG (Igg1, Igg2, Igg3 ve Igg4) kapsayacağını normal PBMCs üzerinden. Bir özetini okumak numaraları Tablo 3' te gösterilmiştir. Örneğin, 90,238/1,582,754 okuma IgM özgü imza sırası bulunan ve 67,896/90,238 okuma VDJ verimli olduğunu.

VDJ düzenlenmesi repertuar profil bir 3D-VDJ-her topu büyüklüğünde okuma göreli sayısı temsil eden arsa üzerinde gösterilir; başka bir deyişle, tüm PBMCs (şekil 4) üzerinden antikor mRNA'ların sayısı. 56 IGHV, 27 IGHD ve 6 IGHJ, kromozom üzerinde göründükleri sıraya uyumlu 3-b kafes oluşur. Buna ek olarak, belirsizce IgBLAST tarafından atanan genler ayrı ayrı 11,172 düğümlerin cuboid sebebiyet veren her IGHV, IGHD ve IGHJ satır için son olarak temsil edilir.

VJ-düzenlenmesi profilinde IgL repertuar bir 2D-VJ-her çubuğun uzunluğu okuma (şekil 4) göreli sayısı temsil eden komplo tasvir edilir. X ekseni 41 IGLVκ ve 32 IGLVλ genler ve 5 IGLJκ ve 5 IGLJλ gen y ekseni temsil eder. Un açıklamalı V - ile J-gen değil sınırda temsil edilir.

İnsan CDR3 sıraları IgBLAST içinde verilen veriyor ve^8,10daha önce açıklandığı gibi istatistiksel analiz edilebilir.

İmmünglobulin sınıfı	Anlamda	Antisens
Fare immünglobulin ağır zincir (C57BL/6)
IgM	AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC	GACATTTGGGAAGGACTGACT
Igg1	AAAACGACACCCCCATCTGTC	GACAGATGGGGGTGTCGTTTT
(Igg1 varyant)	AAAACAACACCCCCATCAGTC	GACTGATGGGGGTGTTGTTTT
IgG2c	AAAACAACAGCCCCATCGGTC	GACCGATGGGGCTGTTGTTTT
Igg3	GTGATCCCGTGATAATCGGCT	AGCCGATTATCACGGGATCAC
Iga	TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG	TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG
Fare immünglobulin hafif zincirleri (C57BL/6)
Igκ	CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC	GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG
Igλ1	TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG	CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA
Igλ2	TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG	CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA
Igλ3	TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG	CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA
Igλ4	TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG	CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA
İnsan immünoglobulin ağır zincir
IgM	GGGAGTGCATCCGCCCCAAC	GTTGGGGCGGATGCACTCCC
IgG	GCTTCCACCAAGGGCCCATC	GATGGGCCCTTGGTGGAAGC
Iga	GCATCCCCGACCAGCCCCAA	GACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgD	GCACCCACCAAGGCTCCGGA	TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC
IgE	GCCTCCACACAGAGCCCATC	GATGGGCTCTGTGTGGAGGC
İnsan immünoglobulin hafif zincirleri
Igκ	ACTGTGGCTGCACCATCTGC	GCAGATGGTGCAGCCACAGT
Igλ1, 2, 6	GTCACTCTGTTCCCGCCCTC	GAGGGCGGGAACAGAGTGAC
Igλ3, 7	GTCACTCTGTTCCCACCCTC	GAGGGTGGGAACAGAGTGAC

Tablo 2: Özet immünglobulin imza dizileri

Fare IgH	Toplam okuma	IgM	Igg1	IgG2c
Giriş	475,144
IGC içeren		166,175	229,671	36,628
VDJ verimli		133,371	196,583	31,446
Fare IgL	Toplam okuma	IgKappa	IgLambda
Giriş	527,668
IGC içeren		178,948	21,446
VJ verimli		160,924	16,988
İnsan IgH	Toplam okuma	IgM	IgG	Iga	IgD	IgE
Giriş	1,582,754
IGC içeren		90,238	5,298	94,061	75,549	2,932
VDJ verimli		67,896	2,775	78,203	56,495	3
İnsan IgL	Toplam okuma	IgKappa	IgLambda
Giriş	1,582,754
IGC içeren		120,316	64,148
VJ verimli		97,169	52,324

Tablo 3: Özet deneylerde okuma sayıların

Şekil 1: antikor kapsayacağını bireysel farelerde analiz etmek için sıralama stratejisinin şematik gösterim. (A) ters transkripsiyonu ve PCR-güçlendirilmiş evrensel ileri astar kullanarak bağışıklık hücreleri veya doku toplam RNA ve immünglobulin sınıfa özgü ters astar. Her immünglobulin sınıftan amplicons havuza alınmış ve yeni nesil sıralama için işlenir. (B) dalağı C57BL/6 fare üzerinden aşağıdaki gibi tedavi edildi gibi biyolojik çoğaltır: Toplam RNA'ların dalak örnekleri saflaştırılmış ve cDNAs 5'-evrensel astar ve antikor sınıfa özgü astar kullanarak yarış tarafından güçlendirilmiş. Onlar o zaman bireysel fareler için astar etiketleme ile yeni nesil sıralama için render. Şekil⁸ izinle adapte parçasıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: antikor kapsayacağını bireysel farelerde analiz etmek için veri işleme akış çizelgesinin şematik. Yeni nesil sıralama sonra elde edilen Amplicon okuma aşağıdaki gibi işlenen: (1) okuma dizileri antikor sınıfa özgü imza dizileri; varlığı için kontrol (2) dizileri için V, D, incelenmiş ve IMGT/HighV-macera ve/veya IgBLAST kullanarak J gen parçalarının; (3) üretken VDJ kavşak içeren dizileri toplanmıştır; ve (4) bu dizilere kullanılan genel repertuar özellikleri, CDR3, analiz için vb Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: küresel veri görselleştirme için fare antikor kapsayacağını. Her antikor sınıfın genel repertuar profilleri 3D-VDJ-arsa tarafından görüntülenmiştir. X ekseni 110 IGHV genlerin kromozom gibi sipariş temsil eder. Y ve z - ekseni 12 IGHD ve 4 IGHJ genler, sırasıyla temsil eder. Her düğümde küre hacmi okuma sayısı temsil eder. Kırmızı Küre: un açıklamalı V, D ile J gen. IgL dağıtımları bir 2D-VJ-her çubuğun uzunluğu okuma göreli sayısı temsil eden arsa üzerinde gösterilir okuyun. X ekseni 101 IGLVκ ve 3 x IGLVλ genler x ve y ekseni 4 x IGLJκ ve 3 x IGLJλ genler temsil eder. Un açıklamalı V ile J gen değil sınırda temsil edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: küresel veri görselleştirme için insan antikoru kapsayacağını. Her antikor sınıfın genel repertuar profilleri 3D-VDJ-arsa tarafından görüntülenmiştir. X ekseni 56 IGHV genlerin kromozom gibi sipariş temsil eder. Y ve z - ekseni 27 IGHD ve 6 IGHJ genler, sırasıyla temsil eder. Her düğümde küre hacmi okuma sayısı temsil eder. Kırmızı Küre: un açıklamalı V, D ile J gen. IgL okuma 2D-VJ-her çubuğun uzunluğu okuma göreli sayısı temsil eden arsa üzerinde serilir. X ekseni 41 IGLVκ ve 32 x IGLVλ genler x ve y ekseni 5 x IGLJκ ve 5 x IGLJλ genler temsil eder. Un açıklamalı V - ile J-gen değil sınırda temsil edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Burada açıklanan yöntemi NGS 5'-yarış yöntemi kullanılarak güçlendirilmiş antikor RNA için kullanır. Dejenere 5'-V_H gen astar yöntemler aksine mRNA her antikor sınıfın eşit olarak evrensel ileri primerler kullanılarak güçlendirilmiş. Buna ek olarak, repertuar belirli immünglobulin sınıfları profil oluşturma sabit bölge 1 (CH1) antikor gen antianlamlı astar belirli kullanımını etkinleştirir. Bu sınıfa özgü antikor yanıtı dissekan için hem de saf ve aşılı kapsayacağını^8,9karşılaştırmak için çok faydalıdır.

Yöntemin en olası bir hatadır güçlendirilmiş immünglobulin iletileri bir yetersizliği var. Bu iletişim kuralı tarafından büyük ölçüde elde edilen antikor repertuar derinliği 3.1 ve 3.2 adımlarda açıklanan PCR güçlendirme bağlıdır. Repertuar derinlik düzgün elde değil ettiyseniz, şablon cDNA ve astar adımda 3.2.1 veya 3.2.2 oranları değişen kesinlikle önerilir.

NGS tarafından üretilen antikor okuma yaklaşık % 20'si belirsiz dizileri²¹genellikle. Hatta ile kurulan "düzeltme yöntemleri", % 5-10 kalır belirsiz³. Biz, bu nedenle, sıra analiz ve ham okuma immünglobulin sürekli bölgelere (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, vb) karşılık gelen imza dizileri içeren filtre. Bu nedenle somatik hiper mutasyonlar analizi dikkatli muayene ihtiyacı var.

Bu yöntem sınırlamaları biri o immünglobulin ağır ve hafif zincir çifti anlaşılmaktadır değiştiremiyor. Bu nedenle bu yöntemle elde edilen repertuar görünüm bütünsel değil. Ancak, üst düzey ikili veri¹⁰tarafından istatistiksel tahmin etmek mümkündür. Ayrıca, bir roman yöntemi immünglobulin çiftleri oldu diziye son^3,4rapor.

Çıkış .fna veri immünglobulin serilerinde immünglobulin gen imza dizileri varlığı dayalı elde. V (D) J düzenlemeler verimliliğini ve segmentleri sonra açıklamalı V, D ve J gen değerlendirildi. Tamamlayıcılık belirleyen bölge 3 (CDR3) dizileri de açıklamalı. İmmünglobulin dizileri sistematik bu sınavlar .fna veri yararlı IMGT/HighV-QUEST server^22,23,24tarafından temin edilmiştir. Ancak, bir otomatik işleme boru hattı inşa büyük deneysel verileri çözümlemek için hak vardır. Her amaç için özelleştirilmiş boru hattı tek başına IgBLAST protokolü¹⁹kullanarak kurmak mümkündür. Bu yaklaşımın temel programlama okuma-yazma ihtiyacı ama immünglobulin sistem detaylı analizler için çok yararlıdır. Açıklanan boru hatları özelleştirilmiş Protokolü (Şekil 2) örnekleridir.

Antikor sayısını orantılı antikor RNA'ların antikor sisteminin antikor bileşenlerinin yansıtan örnek miktarı zaman Puan^5,8,25verilen okur. Burada açıklanan yöntemi bir kuş bakışı R programları^8,18,26kullanarak bir antikor repertuarı V (D) J Anayasanın verir.

IgM antikor kapsayacağını bireysel saf farelerin genel görünümünü son derece korunmuş VDJ profil ile karşılaştırıldığında bu Igg1 veya IgG2c⁸saptandı. Bu olgunlaşmamış Zebra balığı VDJ kombinasyonları çok basmakalıp⁹olduğunu bildirildi. Buna ek olarak, insan VDJ kombinasyonları son derece çarpık⁶olduğu bildirilmiştir. Naif B hücreleri son derece korunmuş deterministic VDJ-profilleri otomatik-antijenler vücutta sunulan ile muhtemelen de çarpık VDJ-düzenlemeler tarafından oluşturulan veya negatif seçim vardır. Örneğin, IGHV11-2 tercihen fetal IgM repertuar²⁷ ifade edilir ve bu ağırlığı IGHV11-2 autoreactivity senescent eritrositler²⁷karşı atfedilir. İlginçtir, IGHV11-2 de saf IgM⁸daha önce yayımlanmış bizim analiz en yaygın büyük repertuarında oldu.

Burada anlatılan yöntem ikisi bireysel organları anahtar antikor kapsayacağını^{8yanlışlıkla ihmal kaçınarak, üretilen antikor-repertuar uzay analiz ederek antijen-duyarlı antikor kapsayacağını deşifre için yararlıdır, 10}. Bu yöntem aynı zamanda kolaylaştırmak detaylı antikor ağ dinamizm incelenmesi hızlandırılmış yeni ortaya çıkan karşı koruyucu antikorlar keşfi sağlar patojenler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.2 mL Şerit Tüpler	Thermo Fisher Scientific	AB0452	120 şerit
100 bp DNA Merdiveni	TOYOBO	DNA-035	0.5 mL
2100 Biyoanalizör Sistemleri	Agilent Technologies	G2939BA /2100
Asetik Asit	Wako	017-00256	500 mL
Agaroz, NuSieve GTG	Lonza	50084
Amonyum Klorür	Wako	017-02995	500 g
Kloroform	Wako	038-02606	500 mL
Dulbecco'nun PBS'si (-)" Nissui"	NISSUI	08192
Etilendiamin-N, N, N ', N'-tetraasetik Asit Disodyum Tuzu Dihidrat (2NA)	Wako	345-01865	500 g
Falcon 40 & mikro; m Hücre Süzgeci	Falcon	352340	50/Kasa
ling kilit tüpü 1.7 mL BM	EKİPMANI	BM-15
ling kilit tüpü 2.0 mL	BM EKIPMANI	BM-20
MiSeq Reaktif Kiti v2	illumina	MS-102-2003	500 döngü
MiSeq Sistemi	illumina	SY-410-1003
NanoDrop 2000c Spektrofotometre	Thermo Fisher Scientific
Potasyum Hidrojen Karbonat	Wako	166-03275	500 g
PureLink RNA Mini Kit	yaşam teknolojileri	12183018A
Qubit 3.0 Florometre	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Qubit dsDNA HS Test Kiti	Thermo Fisher Scientific	Q32854	500 tahlil
AKILLI YARIŞ 5'/3' Takımı	Clontech
TaKaRa Ex Taq Sıcak Başlangıç Sürümü	Takara Biyo A.Ş. & nbsp;	RR006A
Trizma baz	Sigma	T6066	1 kg
TRIzol Reaktif	AmbionThermo Fisher Scientific	15596026	100 mL
Ultra Şeffaf qPCR Kapakları	Thermo Fisher Scientific	AB0866	120 şerit
UltraPure Etidyum Bromür	Thermo Fisher Scientific	15585011
Wizard SV Jel ve PCR Temizleme Sistemi	Promega	A9282