Yöntem makalesi

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

23.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58841

⸱

29 Ocak 2019

 ,  ,  , 
1Royal (Dick) School of Veterinary Studies and Roslin Institute, University of Edinburgh, 2MRC Centre for Reproductive Health, University of Edinburgh, 3Edinburgh Phenotypic Assay Centre, University of Edinburgh, 4Cancer Research UK Edinburgh Centre, MRC Institute of Genetics, Molecular Medicine, University of Edinburgh

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.

Özet

CD8 tümör-öldürme yeteneğini kullanılmasının muhtemelen+ T hücre tümörleri, onların verimli tümör infiltrasyonu ile birlikte başarılı immunotherapies temel unsur olduğunu. Çeşitli çalışmalarda tümör infiltre myeloid hücrelerin (örneğin, elde edilen miyeloid bastırıcı hücreleri (MDSCs) ve tümör ilişkili makrofajlar (TAMs)) CD8 sitotoksisite bastırmak belirttiler+ T hücreleri tümör microenvironment ve bu hedefleme Bu düzenleyici myeloid hücrelerin immunotherapies artırabilirsiniz. Burada, bir tüp bebek tahlil sistem bağışıklık baskılayıcı etkileri Monositik MDSCs ve TAMs CD8 tümör-öldürme yeteneğini değerlendirmek için mevcut+ T hücreleri. Bu amaçla, ilk saf kültürlü dalak CD8+ T hücreleri ile anti-CD3/CD28 aktive antikorlar bastırıcı hücreleri içinde ve hedef kanser hücrelerinin bir fluorogenic huzurunda pre-harekete geçirmek T hücrelerle birlikte kültürlü caspase-3 alt katman. Floresans kanser hücrelerinin içinde belgili tanımlık substrate üzerinden gerçek zamanlı floresans mikroskobu tarafından indüklenen T hücreli tümör hücre apoptosis bir göstergesi olarak algılandı. Bu tahlil başarıyla tümör hücre apoptosis CD8 tarafından artış algılayabilir+ T hücreleri ve onun bastırma TAMs veya MDSCs öncesi kültür tarafından. Bu işlev tahlil CD8 soruşturma için yararlıdır+ T hücre bastırma mekanizmaları düzenleyici myeloid hücrelerin ve yüksek işlem hacmi tarama yolu ile üstesinden gelmek için tanımlayıcı druggable hedefler.

Giriş

Bu bilinen bu CD8+ T hücreleri ne zaman onlar onların tam sitotoksisite sarfetmek tümör hücreleri ortadan kaldırabilirsiniz. T hücre reseptör (TCR), CD8 aktivasyonu sonra+ T hücreleri çoğalırlar ve sitotoksik efektör hücrelere ayırt etmek. Genişletilmiş ve aktif CD8+ T hücre sitotoksik tanecikler, perforin ve granzymes, hedef hücrelere aktarılır ve caspase-3 apoptosis1aracılı gibi çeşitli litik yollar başlatmak da dahil olmak üzere salgılar. CD8+ T hücreleri da teşvik tümör hücre apoptosis reseptörleri tümör nekrozis faktör-α (TNF-α), için gibi hedef hücrenin üzerinde reseptörleri aktive ederek ligand (FasL) veya apoptosis indükleyici ligand (iz) TNF ile ilgili ilk apoptosis sinyal. Ayrıca, aktif CD8+ T hücreleri salgılar interferon-γ (IFN-γ) tümör hücre çoğalması bastırmak ve tümör hücreleri CD8 için duyarlılığını artırmak+ T hücreleri ile up-regülasyon FasL reseptör1. Potansiyel CD8 için verilen+ T tümör öldürme yeteneği, onların sitotoksisite (örneğin, denetim noktası inhibitörleri, kanser aşısı ve T hücreleri ifade chimeric antijen reseptör (araba) evlat edinen transferi) artırmak için çeşitli stratejiler kurulan ve kanser2belirli türleri üzerinde gösterilen önemli terapötik etkileri. Ancak, kanıt biriken tümör infiltre bağışıklık hücreleri düzenleyici T hücreleri gibi miyeloid kaynaklı bastırıcı (MDSCs) hücreleri ve makrofajlar (TAMs) tümör ilişkili CD8 bastırmak öneriyor+ T hücre fonksiyonları ve etkinliğini sınırlamak in immunotherapies3,4,5. Böyle immunotherapies geliştirmek için nasıl bağışıklık baskılayıcı hücreleri sınırı CD8 anlaşılması önemlidir+ T hücre sitotoksisite. CD8 tanımlaması+ T hücre bastırma mekanizmaları yanı sıra, üstesinden gelmek için druggable hedefleri geliştirme ve tüp bebek deneyleri kullanımını gerektirir.

CD8 ölçme altın standart yöntem+ T hücre sitotoksisite olduğunu krom yayın tahlil hangi hedef radyoaktif sonda (51Cr), sürümünden bu hücreleri CD8 tarafından lysed+ T hücreleri, kararlı6' dır. Ancak, bu tahlil nispeten düşük duyarlılık, yüksek arka plan, erken apoptotik olaylar, tehlikeli atık sorunları ve otomatik sıvı işleme ve desteklemek için algılama ile sınırlı uyumluluk algılamak için yetersizlik de dahil olmak üzere çeşitli sakıncaları vardır daha yüksek üretilen iş uygulamaları. Başka bir ortak akış sitometrik analizleri apoptosis hedef tümör hücrelerinin V7bağlama annexin tarafından tespit yöntemidir. Bu tahlil propidium iyodür (PI) veya 7-aminoactinomycin D (7-AAD) ve ek olarak7 hedef hücrelerde apoptosis CD107a veya CD69 ifade tarafından belirtilen efektör Hücre aktivasyonu kullanarak hedef hücre ölümü gibi diğer parametreleri algılamak mümkündür . Ancak, bu tahlil bastırıcı hücreleri krom yayın tahlil için karşılaştırıldığında çok sayıda gerektirir. Ayrıca dekolmanı ve yükünün yapisan hedef hücre gerektirir ve bu sonuçları önyargı. Nitekim, krom yayın tahlil veya akış sitometrik tahlil genellikle T hücre fonksiyonları üzerinde baskılayıcı hücre etkileri araştırmak için kullanılmaz. Bunun yerine, T-hücre çoğalması T hücreleri önceden yüklenmiş seyreltme floresan boya (örneğin, CFSE), tarafından belirtilen ölçü sık CD8 inhibisyonu değerlendirmek için kullanılır+ T hücre işlevi bastırıcı hücreleri tarafından. Algılama kültürlü T hücrelerinden IFN γ üretimin T hücre harekete geçirmek8,9bastırıcı hücreleri etkilerini değerlendirmek için başka bir standart yöntemdir. Ancak, bu deneyleri sonuçları mutlaka CD8 yeteneği öldürme hedef hücre aralarındaki ilişkileri belirlemektir değil+ T hücreleri.

Burada CD8 sitotoksisite bastırıcı hücreleri, özellikle metastatik tümörler, makrofajlar etkilerini değerlendirmek için alternatif bir işlevsel tahlil mevcut+ T hücreleri. Bu yöntem CD8 sitotoksisite belirler+ T hücreleri ile ya da ezelî anti-CD3/CD28 aktive antikorlar, huzurunda bastırıcı hücreler tümör hücre apoptosis, tespit ederek önceden kültürlü, floresan bir fluorogenic caspase-3 belirttiği substrat6'yı kullanan hızlandırılmış mikroskobu (Şekil 1) otomatik. Bu iletişim kuralı diğer yöntemlerine göre birçok avantajı vardır; Bu az sayıda hücre gerektirir, yapisan tümör hücre ölümü tespiti ile yüksek hassasiyet sağlar, gerçek zamanlı efektör hedef etkileşim olabilir görüntü ve yüksek işlem hacmi tarama için mükellef.

Bu protokol için metastaz ilişkili makrofajlar (analar) ve onların yaratıcı Monositik-farelerde metastatik tümörler izole MDSCs (M-MDSCs) bastırıcı hücreler kullanılır. Metastatik meme kanseri fare modellerinde makrofajlar farklı nüfusu ile karakterize F4/80yüksekLy6G-CD11byüksekLy6Cdüşük metastatik tümörler içeren akciğer biriken. Bu makrofaj nüfusun seyrek olarak normal akciğer bulmuş ve böylece metastaz ilişkili makrofajlar (analar)10aramış. Bu fare modellerinde, başka myeloid hücre tanımlanan nüfus, F4/80yüksekLy6G-CD11byüksekLy6Cyüksek, ayrıca biriken ağırlıklı olarak artış nerede verir analar11' e metastatik akciğer. Onların özelliklerine göre M-MDSCs12CD11byüksekLy6Cyüksek MAM progenitör hücre temsil edebilir.

Protokol

Tüm yordamlar içeren fareler'e göre yapılmıştır izni üzerinden İngiltere'de Home Office (P526C60B3) lisanslı. Ticari reaktifler ve ekipman hakkında bilgi Malzemeleri tablolistelenir.

1. kendi çekirdek kırmızı floresan protein hızlı hedef hücrelerin hazırlanması

  1. Bir hedef fare kanser hücre kültürünü uygun bir kaynaktan elde edilir.
    Not: Bu protokol için E0771 fare meme tümör hücreleri (E0771-LG)13 son derece metastatik bir türevi kullanılır. Ebeveyn E0771 hücre C57BL/6 fareler14den kaynaklanır.
  2. Çözülme ve bir şişe E0771-LG hücreleri ile Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2hücre kültür kuluçka % 10 (v/v) fetal Sığır serum (FBS) dahil olmak üzere DMEM) korumak.
    Not: Bu hücreler Mikoplazma için negatif doğruladı. Bu amaçla, E0771 hücreleri (veya test edilecek hücreleri) 2-3 toplamak 500 μL kültür ortamının (yokluğunda antibiyotik ve antimycotics), yukarıda açıklandığı gibi gün kültür. 12,419 x g 60 orta santrifüj kapasitesi s hücre artıkları ortadan kaldırmak ve süpernatant yeni tüpler içine aktarmak için. Piyasada bulunan Mikoplazma test kiti kullanarak Mikoplazma kirlenme belirlemek ( Tablo malzemeleriçin başvurmak) ve/veya PCR15 üreticinin yönergeleri izleyin.
  3. 12-şey plaka ve bir kuluçka 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO%210 (v/v) FBS-DMEM hücrelerle gecede kültür kuyuya başına tohum 5 x 103 E0771-LG hücre.
    Not: hedef hücre proliferasyon hızı düşükse (nüfus) 36 h büyük saat iki katına, hücre sayısı 1 x 104' e artırılabilir.
  4. İle 1 mL % 10 (v/v) FBS-DMEM 10 μg/mL polybrene de dahil olmak üzere orta yerine ve lentiviral parçacıkların (1 x 106 TU/mL) 25 μL eklemek bir nükleer kodlama sınırlı kırmızı floresan protein (mKate2, Tablo malzemeleriçin başvurmak).
  5. Hücreler bir kuluçka 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO224 h için kültür.
  6. Orta yerine %10 (v/v) FBS-DMEM ve 24-48 h 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2bir kuluçka için hücreleri kültür.
  7. Orta yerine %10 (v/v) FBS-DMEM hücreleri kırmızı floresan protein hızlı ve % 80-90 birleşmesi onlar kadar hücreleri kültür başladığımızda 1 μg/mL puromisindir dahil olmak üzere.
    Not: Puromisindir konsantrasyon hedef hücre tipleri arasında farklı olacak ve un transfected hücreleri kullanarak optimize edilmelidir.
  8. Alt kültür hayatta kalmak için 1-3 pasajlar % 10 (v/v) FBS-DMEM 1 μg/mL puromisindir de dahil olmak üzere hücreleri ve hisse senetleri bir sıvı azot buharı faz depolama sistemi kadar kullanmak cryopreserve.

2. izolasyon farelerde tümör baskılayıcı hücre

Not: Bu protokol için bastırıcı hücreleri (Yani, analar ve M-MDSCs) E0771-LG hücreleri tarafından kurulan metastatik tümörler içeren akciğer etkilenmezsiniz. Doku ayrılma ve hücre sıralama için koşullar farklı doku hücrelerinden yalıtmak için optimize edilmelidir.

  1. 1 x 106 kanser hücreleri (E0771-LG) syngeneic (C57BL/6), kadın, 7-10 hafta eski fare kuyruğu damar içine enjekte.
  2. 14 gün sonra metastatik tümörler içeren akciğer yalıtmak ve tek hücreli süspansiyonlar perfused akciğer yukarıda açıklanan11olarak enzimatik sindirim yolu ile gelen hazır olun.
    Not: Bu protokol için dört fareler kanseri hücreleri enjekte edilir ve onların metastatik akciğer yeterli bastırıcı hücreleri elde etmek için bir araya getirilir.
  3. Tek hücre süspansiyonlar Anti-fare CD16/CD32 antikor buz üzerinde 30 dakika ile kuluçkaya ve floresan antikor CD45, F4/80, CD11b, Ly6C ve Ly6G ( Tablo malzemeleriçin başvurmak) ile başka bir 30 dk10,11 için leke , 13.
  4. 1 mL %2 (w/v) Sığır serum albumin (BSA) içeren PBS lekeli hücrelerle bir kez yıkama ve hücre Pelet %2 (w/v) BSA içeren PBS 500-1000 μL ile yeniden askıya alma.
  5. 3 mikron DAPI ekleyin ve M-MDSCs sıralama (DAPI-CD45+F4/80+Ly6G-CD11byüksekLy6Cyüksek) ve analar (DAPI-CD45+F4/80+Ly6G-CD11byüksek Ly6Cdüşük) kullanarak bir hücre sıralayıcısı (ek Şekil 1).
    Not: Analar (Ly6Cdüşük) ve M-MDSCs (Ly6Cyüksek) ayırt etmek için Ly6C düzeyi eşik buna ikamet alveoler makrofajlar (RMAC) dayanıyor. Sıralanmış hücreleri saflığı akış sitometresi ile daha--dan %90 beklenen bir saflığı ile ölçülür.
  6. DMEM (v/v) FBS, %1 (v/v) penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin, %1 (v/v) gerekli olmayan amino asit, 1 mM sodyum pyruvate, % 20 ve 50 nM 2-mercaptoethanol (zenginleştirilmiş-DMEM, E-DMEM olarak da adlandırılır) içeren 400 μL sıralı hücrelerle resuspend.
  7. Trypan mavi dışlama yöntemi16 kullanarak canlı hücreleri saymak ve 2 x 106 hücre/ml E-DMEM ile ayarlayın.
  8. Hücreler buz kadar kullanmak tutmak.

3. yalıtım CD8+ T hücreleri farelerin dalak

  1. Dalak syngeneic hedef kanser hücre satırı (Yani, bu iletişim kuralını C57BL/6 fareler) gibidir bir fareden yalıtın:
    1. Hayvan CO2 inhalasyon tarafından ötenazi.
    2. Hayvan üstünde a temiz diseksiyon tahta yerleştirin ve % 70 (v/v) etanol ile cildinizi silin.
    3. Dalak ortaya çıkarmak için makas kullanarak karın deriyi kesme
    4. Mide için aşağı bulunur, dalak, izole ve 5 mL buz gibi PBS de içeren bir tüpün içine yerleştirin.
  2. Steril 5 mL şırınga iç pistonu kullanarak, bir 50 mL tüp ayarla 100 mikron hücre süzgeç dalağı eziyet.
  3. Hücreleri PBS toplam 10 mL kullanarak filtreden geçmek.
  4. Hücre süspansiyon vasıl 337 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
  5. Hücre pelet 1 mL 2 mM EDTA ve %0,5 (w/v) BSA (tampon çalıştıran) içeren PBS resuspend ve 40 mikron hücre süzgeç aracılığıyla filtre.
  6. Canlı hücre saymak ve 1 x 108 hücre/çalışan tampon kullanarak mL için ayarlayın.
    Not: küçük bir saflık kontrolü için bir ön zenginleştirme örnek olarak hücreleri aliquot tutmak.
  7. CD8 için zenginleştirmek+ T hücreleri bir negatif seçim kiti ve manyetik sıralayıcısı kullanarak ( Malzemeler tabloiçin bakınız).
    1. 1 x 108 (1 mL) 5 mL polistren yuvarlak alt tüp splenocytes hücrelerinin aktarın.
    2. Biotinylated antikorların 50 μL ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    3. Birleşik streptavidin manyetik boncuklar 125 μL ekleyin ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    4. Arabellek çalışan 1.325 mL ekleyin ve karışımı yavaşça pipetting tarafından.
    5. Tüp mıknatıs yerleştirin ve 2.5 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    6. Mıknatıs kadar almak ve zenginleştirilmiş hücre süspansiyon yeni bir tüp içine dökün.
  8. E-DMEM 200 μL zenginleştirilmiş hücrelerle resuspend (i.e., DMEM %20 (v/v) FBS, içeren %1 (v/v) penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin, %1 (v/v) gerekli olmayan amino asit, 1 mM sodyum pyruvate ve 50 nM 2-mercaptoethanol).
  9. Canlı hücreleri saymak ve 2 x 106 hücre/ml E-DMEM ile ayarlayın. Hücreleri 37 ° C'de bir CO2 kuluçka makinesi kullanımda kadar devam.
    Not: küçük bir sonrası zenginleştirme örnek bir saflık onay için hücreleri aliquot tutmak.
  10. CD8 saflığı belirlemek+ T hücreleri akış sitometresi tarafından aşağıdaki gibi:
    1. 1 x 104 ön zenginleştirme (adım 3.6) hücrelerden veya sonrası zenginleştirme (adım 3,9) örnekleri almak ve her 100 μL çalışan tampon kullanarak için toplam ses düzeyini ayarlama.
    2. Tek hücre süspansiyonlar Anti-fare CD16/CD32 antikor buz üzerinde 30 dakika ile kuluçkaya ve floresan antikor CD45, CD3, CD4 ve CD8 ( Tablo malzemeleriçin başvurmak) ile başka bir 30 dk için leke.
    3. %2 (w/v) BSA içeren PBS 500 μL lekeli hücrelerle yıkama ve hücre Pelet %2 (w/v) BSA içeren PBS 500-1000 μL ile yeniden askıya alma.
  11. 3 mikron DAPI ekleyin ve CD3 yüzdesini belirlemek+CD4-CD8+ hücreleri toplam CD45+ hücre nüfus.

4. harekete geçirmek ve izole CD8 genişlemesi+ T hücreleri

  1. 50 μL başına aliquot 1 x 105 hücreleri CD8+ T U-alt 96-şey plaka kuyu hücrelere (3,9 adımda hazırlanan).
  2. 50 μL bastırıcı hücreleri (2,7 adımda hazırlanan) başına 1 x 105 hücre eklemek veya E-DMEM 50 μL kuyu içine.
  3. E-DMEM, 4 x 104 U/mL koloni uyarıcı faktör 1 (CSF-1), 240 U/mL interleukin-2 (IL-2), 8 μg/mL Anti-fare CD3ε antikor ve 16 μg/mL Anti-fare CD28 antikor oluşur harekete geçirmek orta hazırlayın.
    Not: CSF-1 T Hücre aktivasyonu için gerekli değildir ancak bu Protokolü (yani, analar ve M-MDSCs) bastırıcı hücrelerinin hayatta kalmak için gereklidir. Böylece, bu ortak kültür kültür koşullarında tutarlılığı korumak için hedef kanser hücreleri ile T hücrelerinin korunur. CSF-1 nano-molar konsantrasyonlarda tüm dokularda bulunur ve monosit/makrofaj canlılığı içinde vivo için gereklidir bu hücreler için fizyolojik bir içeriği olduğu bu.
  4. 50 μL harekete geçirmek Orta (adım 4.3) ekleyin ve 50 μL E-DMEM ile ya da ezelî reaktifler test edilecek.
  5. Kuluçka 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2 tabak yerleştirin ve hücreleri 4 gün boyunca kültür.

5. Kur hedefinin ortak kültür ile pre-harekete geçirmek CD8 hücreleri+ T hücreleri

  1. 1: 100 seyreltilmiş büyüme faktörü indirgenmiş çözünür membran Matrix (Tablo reçetesi) 30 μL düz dipli 96-şey plaka Mikroskopi için uygun kuyu içine ekleyin ve CO2 kuluçka için en az 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. Hedef hücreleri (kırmızı floresan protein sınırlı nükleer ifade Yani, E0771-LG) hazırlayın.
    1. Hedef hücrelerin % 0.05 tripsin/EDTA 1 dk. için oda sıcaklığında 1 mL ile kuluçkaya ve nazik pipetting tarafından hücreleri hasat.
    2. DMEM % 10 (v/v) FBS dahil olmak üzere 9 mL ekleyin ve 5 min için 337 x g de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
    3. E-DMEM 500 μL hücrelerle yeniden askıya alma ve canlı hücreleri saymak.
      Not: hedef hücre sayım önce hücreleri tek hücre süspansiyon üretmek için 40μm hücre süzgeç aracılığıyla filtre.
    4. E-DMEM ekleyerek 2 x 104 hücre/ml (= 1 x 103 hücre başına 50 μL) yoğunluk ayarlamak ve hücreler buz üzerinde tutmak.
  3. Efektör hücreleri hazırlayın (yani, pre-harekete geçirmek CD8+ T hücreleri).
    1. 96-şey plaka (adım 4.5) iyice pipetting ve transfer kayan CD8 tarafından bir kuyu hücrelerde+ T hücreleri yeni bir 1,5 mL tüp içine resuspend.
      Not: Analar ve M-MDSCs sıkıca kuyuya uygun ve pipetting tarafından müstakil değil.
    2. Kalan hücreleri toplamak için PBS 200 μL kuyunun içine ekleyin ve adım 5.3.1 tüp içine transfer.
    3. E-DMEM bir kez (santrifüj vasıl 337 x g) 1 mL hücrelerle 5 min için yıkama, Aspire edin ve süpernatant atmak) ve onları E-DMEM 100 μL ile resuspend.
    4. Canlı hücreleri (trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak) saymak, 1,6 x 105 hücre/mL (4 x 103 hücreleri/25 μL =) yoğunluk ayarlamak ve hücreler buz üzerinde tutmak.
  4. Her şey adım 5.1 plaka membran matris Aspire edin.
  5. 1 x 103 hücreleri/50 μL hedef hücre (adım 5.2.4'ten) her kuyunun içine ekleyin ve iyice karıştırın.
    Not: kenar efektleri orta, yalnızca iç 60 kuyu 96 buharlaşma nedeniyle de önlemek için plaka analiz için kullanılmalıdır.
  6. E-DMEM 4 x 103 U/mL IL-2 ve 10 mikron fluorogenic caspase-3 substrat ( Tablo malzemeleriçin başvurmak) de dahil olmak üzere 25 μL ekleyin.
  7. 4 x 103 hücreleri/25 μL CD8, eklemek+ T hücreleri (adım 5.3.4) içine uygun kuyu ve iyice karıştırın.
    Not: Çok fazla bir şey hücrelerinde varlığı analizi daha zor hale getirir. Bu modelde, bir 4:1 Efektör: hedef oranı (Toplam hücresini 5 x 10 numara3 hücreleri/de) en iyi, ama bir 8:1 oranı suboptimal oldu. Aşağıdaki dört denetimleri içeren wells veri analizi ile yardım gerekli: hedef hücreleri orta ve caspase-3 substrat, olmayan ortak kültür wells (1 x 103 hücreleri/de) için kullanılan yoğunluk efektör hücreleri (1 x 103 hücreleri / de) orta ve caspase-3 substrat olmadan.
  8. 200 μL PBS veya steril su buharlaşma orta deneysel kuyulardan azaltmak için tüm boş wells (özellikle wells plaka periferal) içine ekleyin.
  9. 37 ° C, % 95 nem ve % 5 CO2muhafaza hızlandırılmış floresan mikroskop içine plaka ayarlayın.
    Not: bir çapraz-tüm hücrelerin eşit dağıtmak için desen plaka sallamak ve daha sonra da kuluçka aktarmadan önce düz bir yüzeye 10-20 dakika oda sıcaklığında kalmasını plaka.

6. hücreleri görüntüleme

Not: Ayrıntılı görüntü alma ayarları ile belgili tanımlık mikroskop ve fluorophores kullanılan farklı olur; Aşağıdaki genel Alım parametreleri en iyi sonuçlar için istihdam edilmelidir.

  1. Bir uygun otofokus rutin mikroskop kullanarak, 96-şey plaka deneysel her iyi toplam yüzey alanı en az % 25 kapsayan görüntüleri elde etmek.
  2. Faz kontrast yanı sıra floresan kanal sınırlanmış nükleer kırmızı floresan için protein (mKate2) uygun görüntüleri elde etmek için mikroskop ayarla ve floresan kanal için yeşil fluorogenic uygun caspase-3 substrat (ile aktive uyarma, 488 nm) (Şekil 2).
  3. Esir alma imge faz kontrast ve 2 floresan kanal her 1-3 h en az 72 h için deneysel Wells.

7. görüntü analiz yazılımı kullanarak görüntü analizi

Not: Ayrıntılı görüntü analiz ayarları kullanılan yazılım ile değişir ( Tablo malzemeleriçin başvurmak); Aşağıdaki genel analiz işlemleri en iyi sonuçlar için istihdam edilmelidir.

  1. Spektral olup olmadığını belirlemek un karıştırma apoptotik hücre çekirdeği tarafından yayılan ve gerekirse, bir Çözümleme Protokolü; bunun için ayarla hedef hücre çekirdeği tarafından yayılan floresan sinyal ayırmak için gereklidir
    1. Görünümü bir denetim iyi tek hedef hücreleri (mkate2-etiketli) orta caspase-3 substrat yeşil flüoresan kanaldaki olmadan içeren.
    2. Yeşil floresan (çekirdeklerin yeşil görünür) kırmızı çekirdeği tarafından yayılan olup olmadığını gözlemlemek
    3. Yeşil floresans çekirdekleri içinde belirgin ise, düşsel bilgisayar yazılımı spektral unmixing denetiminde erişmek ve kırmızı yeşil sinyal kaybolana kadar yeşilden kaldırıldı yüzdesini artırmak (deneyim, genellikle 6-%7 parlak mKate2 için bu Floresan).
    4. Yeşil floresans herhangi bir çekirdek içinde belirgin değilse, hiçbir spektral unmixing gereklidir.
      Not: Bu spektral unmixing düzeltme test hedef hücre caspase-3 maddeyi içeren ortamda bir de kullanılarak da yapılabilir. Ancak, genellikle spontan apoptosis floresan yerine caspase-3 kanama ile aktivasyonu nedeniyle yeşil floresans yayan birkaç hedef hücre çekirdeği sonuçlanan hedef hücrelerdeki (az % 10), çok düşük bir düzeyde olduğunu. Yeşil floresans tüm çekirdeği belli olduğunda doğru floresans taşma payı ile bu koşullar altında belirgindir.
    5. Tek efektör hücreleri (etiketsiz çekirdekleri) de içeren bir denetim orta caspase-3 substrat kırmızı ve yeşil kanal olmadan ayrı ayrı görüntüleyin.
    6. Yeşil veya kırmızı floresans çekirdekleri tarafından yayılan olup olmadığını gözlemlemek. Ne kırmızı ne de yeşil floresans bireysel kanallarında belirgin ise hiçbir spektral unmixing gereklidir.
      Not: içinde bizim deneyim, fareyi CD8+ T hücreleri otomatik floresan ve böylece hiçbir spektral unmixing bu hücreler için gerekli değildir. Bu spektral unmixing düzeltme test bir kuyu caspase-3 maddeyi içeren orta efektör hücreleri kullanılarak da yapılabilir. Ancak, genellikle spontan apoptosis caspase-3 aktivasyonu nedeniyle yeşil floresans yayan efektör hücre çekirdeği sonuçlanan bir seviyede olduğunu. Yeşil floresans tüm çekirdeği belli olduğunda doğru floresans taşma payı ile bu koşullar altında belirgindir.
  2. Bir floresan arka plan çıkarma yöntemi (örneğin, zanaat), örnek için ilgili parametreleri ile floresan her iki kanal floresan nesneleri çözümlemek için kullanın.
    Not: yeşil kanalda kullandığımız zanaat (çekirdeklerin RADIUS 10.0 µm, yeşil floresans eşik = 0.7 yeşil kalibrasyon birimleri =). Kırmızı kanalda zanaat yapardık (çekirdeklerin RADIUS 10.0 µm, kırmızı floresans eşik = 0.5 kırmızı kalibrasyon birimleri =).
  3. Uygun parametreleri kenar bölmek için bireysel floresan çekirdeği gidermek için kullanın.
    Not: Yeşil veya kırmızı floresans kanalda keskin kenar kullanmıyordu.
  4. Hedef çekirdeklerin en küçük boyutunu belirlemek için yalnızca hedef hücreleri (ile caspase substrat) içeren kuyulardan kırmızı kanaldaki resimler kullanın.
    Not: Biz 80 µm2kullandık.
  5. Apoptotik efektör çekirdeği ortalama boyutunu belirlemek için yalnızca efektör hücreleri (ile caspase substrat) içeren kuyulardan yeşil kanaldaki resimler kullanın.
    Not: tek apoptotik efektör çekirdeği 40 – 80 µm2 bu deneylerde arasında değişiyordu.
  6. Floresan hedef hücre çekirdeği bir uygun en az boyutu kısıtlaması (örneğin, minimum alan, minimum çap) kullanarak saymak için bir çözümleme yordamı ayarla (Şekil 2, hedef algılama maskesi).
    Not: Biz en az çekirdek alanı (kırmızı floresans) kullanılan = 80 µm2.
  7. Kadar bir analizi prosedürü apoptotik efektör çekirdeği (Şekil 2, boyutu sınırlı apoptosis maskesi) ortalama boyutundan büyük olan apoptotik hücre çekirdeği sayısını saymak için ayarlayın.
    Not: 80 µm2 olarak ayarlanan boyut filtresi (Yani, sadece alanları yeşil floresans bu boyuttan daha büyük sayılır, böylece tek apoptotik efektör çekirdeği hariç). Bu parametreler kullanarak her ne kadar bazı toplamları apoptotik efektör hücrelerin sayılması apoptotik hedef hücre çekirdeği sayma içinde analiz doğruluğunu artırır.
  8. Nerede kırmızı floresan sinyal (Kimden adım 7,6) ve boyutu sınırlı yeşil flüoresan sinyal (Kimden adım 7,7) önemli ölçüde (Şekil 2, R Co localize kadar bir analizi prosedürü apoptotik hedef hücre çekirdeği sayarak saymak için ayarla /G örtüşme maskesi).
    Not: Uygun bir eş yerelleştirme hedef çekirdeklerin ortalama boyutunu % 100 % 30 aralığı. Örtüşme boyutu filtre 40 µm2' ye ayarlandı.
  9. Tüm zaman boyunca apoptotik hedef hücre çekirdeği sayısı yanı sıra hedef hücre çekirdeği Wells deneysel her koşul için sayısını belirler.

8. hesaplama kullanarak ve yazılım grafik veri analizi

  1. Adım 7,9 deneysel kuyuları için tüm zaman boyunca elde apoptotik hedef hücre çekirdeği sayısı grafiğini çizin. Deneysel her koşul için birden çok kuyu kullandıysanız, grafik olarak ± standart sapma anlamına sonuçları sunmak.
  2. Hedef hücre nüfusun apoptotik kısmı her şey, her zaman bir noktada hedef hücre sayısı tarafından her şey apoptotik hücre sayısı bölerek hesaplayın.
  3. 8.2. adımda elde edilen sonuçları grafik.
  4. Her Curve (AUC) eğri altındaki alan belirlemek. Her eğrinin için nüfusun en yüksek apoptotik kısmı da zirve gerçekleştiği zaman noktası yanı sıra istenirse belirlenebilir. Deneysel koşullar için belirlenen AUC uygun istatistiksel testler kullanarak önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek.
    Not: AUC sonuçları Welch düzeltme unpaired t-test uygulandı.

Sonuçlar

Bu yöntem hedef kanser hücrelerinin efektör CD8 ile+ T basit ortak kültür temel ile ya da ezelî anti-CD3/CD28 aktive antikorların varlığında bastırıcı hücreleri önceden kültürlü hücreleri. CD8 algıladığı+ T hücre kaynaklı kanser hücre apoptosis ortak kültür takip, böylece bastırıcı hücreleri CD8 sitotoksisite üzerine etkileri değerlendirilmesi etkinleştirme zamanla+ T hücreleri.

Genellikle, kendi çekirdek içinde yeşil floresans kanser hücrelerini artırmak bir nükleer hedefleme caspase biyoalgılayıcı aktivasyonu bu hücreleri CD8 ile temas ne zaman+ T bu hücreleri antikorları bastırıcı hücre (yokluğunda tarafından önceden etkinleştirilmiştir Şekil 3; Takıma giren film 1). Apoptozis başlatıldı sonra yeşil floresan caspase substrat üzerinden en az 15 h için algılanabilir. Bazı spontan apoptosis+ T, efektör CD8 hücreleri-da gözlenen zaman içinde bile bu hücreler yalıtım (Şekil 4; kültürlü Takıma giren film 2). Ancak, çekirdek boyutları CD8+ T bu kanser hücrelerinin daha küçük hücrelerdir ve böylece apoptotik 'effektör' hücre 'hedef' hücre sayar apoptotik bir boyutu sınırlama görüntü analiz yöntemi tarafından (Şekil 2 ve Şekil 4) dışlanabilir. Bazı hedef kanser hücrelerinin yeşil floresans bulunmayan küçük bir yuvarlak şekli göstermesine rağmen bu hücreler mitoz apoptosis (Tamamlayıcı film 3) yerine geçiyor ve böylece apoptotik 'hedef' hariç tutulur gibi bu analiz etkilemez hücre bir kırmızı/yeşil örtüşme maskesi (ek Şekil 2) sayar. Hedef kanser hücrelerinin spontan apoptosis zaman zaman bile tek kültür (Tamamlayıcı film 3) bulunur. Ancak, hedef kanser ortak kültürü ile pre-harekete geçirmek CD8 hücreleri+ T hücreleri artan tümör hücre apoptosis Monokültür (Şekil 4) kanser hücrelerinin içinde spontan apoptosis seviyelerinin üzerinde. Genel olarak, hedef kanser hücrelerinin en uygun bir oran efektör hücrelere kullanırken, apoptotik hedef kanser hücrelerinin sayısında bir tepe (Şekil 5A) görülebilir. Verileri hedef hücre nüfus (5B rakam) apoptotik kesir olarak ifade edilir zaman daha farklı bir tepedir. Bu deneyde hedef tümör hücrelerinin bazal apoptosis 24 h doruğa (apoptotik kesir ile 0,08 =), CD8 ama+ T hücre kaynaklı apoptosis 17 h maksimum seviyeye ulaştı (0.66 apoptotik kesir ile =).

Daha fazla bulduk CD8+ T hücreleri analar veya M-MDSCs ile önceden inkübe yapabilirdiniz iletişim hedef kanseri hücreleri ama bu kişinin kanser hücre apoptosis CD8 için karşılaştırıldığında, daha az örnekleri neden gibiydi+ T hücreleri pre-harekete geçirmek olmadan bastırıcı hücreleri (Şekil 3 ve Şekil 4; Takıma giren film 4 ve takıma giren film 5). Her ne kadar CD8+ T hücreleri ile myeloid hücrelerin bazen önceden inkübe indüklenen kanser hücre apoptosis, ayrıca bazı saat süresince apoptosis geçmesi üzerinde teşvik değil hedef kanser hücrelerinin çoğalması yapıldı. deney (Tamamlayıcı film 6). Bu bulgular ile tutarlı, apoptotik kanser hücrelerinin tepe kısmını kültürlü CD8 ile+ T hücreleri önceden myeloid hücrelerin ile inkübe (apoptotik kesir MAM-E MDSC-E ve 0,25 20 h 0,38 23 h =) önemli ölçüde kanser hücrelerinin daha düşük olduğunu kültürlü CD8 ile+ T hücreleri bastırıcı hücreleri (Şekil 6) ile önceden inkübe edildi değil.

CD8+ T hücre aktivasyonu ve kanser hücresi apoptoz diyagramı; kültür kurulumu ve görüntüleme sonuçları.
Şekil 1: deneysel işlemin gösterilen bir düzeni. Saf dalak CD8+ T hücreleri kültürlü anti-CD3/CD28 aktive antikorlar ile ya da ezelî metastaz ilişkili makrofajlar (analar) ile veya Monositik miyeloid-kaynaklı bastırıcı hücreleri (M-MDSCs). CD8 yüzen 4 gün sonra+ T hücreleri toplanan ve hedef kanser hücrelerinin fluorogenic caspase-3 substrat huzurunda ile birlikte kültürlü. Apoptotik kanser hücrelerinin gerçek zamanlı floresans mikroskobu altında tespit edilir. Gösterilen görüntüleri canlı bir hücrenin görüntüleme platformu kullanarak elde ( Tablo malzemeleriçin başvurmak). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Floresan mikroskopi diyagramı, kırmızı/yeşil kanallar, apoptoz tespit maskeleri, hücre canlılığı analizi.
Şekil 2: apoptotik hedef hücreleri apoptotik efektör hücreleri farklı tanımlaması. Üst satır: resim alma kırmızı kanal hedef algılama maskesi (pembe analiz maske) tarafından hedef hücre çekirdeği tanımlamasını sağlar. Orta sıra: yeşil kanalda alınan görüntüleri apoptotik efektör ve hedef hücreleri gösterir. BoyShiley kısıtlı apoptosis maskesi (deniz mavisi analiz maske; 80 µm2den büyük) tek apoptotik analizinden dışlanacak efektör hücreleri sağlar. Alt satırı: kompozit görüntü birleştirilmiş kırmızı ve yeşil kanal faz kontrast resim (sol) veya kırmızı/yeşil ile üst üste maskesi (sağda). Kırmızı floresans (sarı analiz maskesi) ile birlikte lokalize, boyutu sınırlı yeşil floresans tanımlaması apoptotik efektör hücresi (beyaz hariç tutarak hedef çekirdeklerin (sarı ok ucu) apoptotik daha doğru algılanmasını sağlar ok başları). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Zamanla hücre apoptozu; mikroskopi görüntüleri; efektör-hedef etkileşimi; apoptotik belirteçler; 12-30 saat.
Şekil 3: Etkileşim arasında CD8+ T hücreleri ve kanser hücreleri. Hücrelerinin efektör CD8 ile birlikte kültürlü hedef E0771-LG_NLR (T) temsilcisi hızlandırılmış film fotoğraf+ T hücreleri (E) 4:1 efektör/hedef oranında. MDSC-E ve MAM-E efektör hücreleri M-MDSCs ve analar ile sırasıyla önceden inkübe gösterir. Bileşik görüntüler (faz kontrast, kırmızı ve yeşil kanallarını görüntüler de dahil olmak üzere) gösterilir. Ok uçları farklı alan ve zaman puan ile aynı hücreleri takip ediyor. Sarı ok uçları: effectors ile ilişkilendirir ve apoptosis, beyaz ok uçları geçer bir hedef: associates ile effectors ancak apoptosis geçmesi değil bir hedef. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Efektör-hedef etkileşim deneyi; floresan mikroskobu; bileşik ve kırmızı kanal görünümleri; Hücre analizi.
Şekil 4: algılama apoptotik kanser hücrelerinin. 18 h hızlandırılmış film görüntüleme sonra çıkarılan temsilcisi alanları. Bileşik görüntüler (sol; faz kontrast, kırmızı ve yeşil kanalları) ve imge--dan kırmızı kanal (orta) veya (sağ) kırmızı/yeşil çakışma maskesi (sarı) gösterilir. Sağ sütunda sarı nokta apoptotik kanser hücreleri temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Apoptotik kanser hücre sayımı ve farklı E:T oranlarında zaman, deneysel grafik, istatistiksel analiz.
Şekil 5: CD8+ T hücre kaynaklı kanser hücre apoptosis. (A)sayısı apoptotik kanser hücrelerinin efektör ile C8 kültürlü+ T hücreleri hedef oranı (E:T) farklı efektör adlı. hedef hücre nüfusun (B) apoptotik kısmı. Veri vardır anlamına gelir ± SD ortalama alanı (AUC) eğri altındaki da görüntülenir. Unpaired t-test Welch düzeltme AUC analiz etmek için kullanıldı. * P < E:T için karşılaştırıldığında 0,0001 = 0:1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Kanser hücresi apoptoz tablosu; Farklı tedaviler için zaman içinde hücre ölümünü karşılaştıran deneysel grafik.
Şekil 6: Etkileri myeloid hücrelerin tümör infiltre sitotoksisite CD8+ T hücreleri. Apoptotik kanser hücre sayısı(a)(hedef: T) ile C8 kültürlü+ T hücreleri (Efektör: E) 4:1 E:T oranı. CD8+ T hücreleri önceden kültürlü yokluğu (siyah daire) veya Monositik miyeloid-kaynaklı bastırıcı hücrelerin varlığı (MDSC-E: mavi daire) ya da metastaz ilişkili makrofajlar (MAM-E: kırmızı daire). Veri anlamına gelir çoğu hedef hücre nüfusun ± SD (B) apoptotik kısmı. Veri vardır anlamına gelir ± SD AUC demek de gösterilir. Unpaired t-test Welch düzeltme AUC analiz etmek için kullanıldı. * P < 0,0001 karşılaştırıldığında T için yalnızca, #P < E + T. için karşılaştırıldığında 0,0001 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek resim 1. Metastatik akciğer hücrelerden bastırıcı yalıtmak için strateji geçişi. (A)temsilcisi nokta çizer Monositik miyeloid kaynaklı bastırıcı hücreleri (M-MDSCs) ve metastaz ilişkili makrofajlar (analar) izole etmek. Analar (Ly6Cdüşük) ve M-MDSCs (Ly6Cyüksek) ayırt etmek için Ly6C düzeyi eşik buna ikamet alveoler makrofajlar (RMAC) dayanıyor. Sıralanmış M-MDSCs (B) saflık (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Cyüksek) ve analar (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Cdüşük). Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 2. Mitotik hedef hücre temsilcisi görüntüler. Hedef E0771 LG_NLR hücre mono-kültür temsilcisi hızlandırılmış film fotoğraf. Top: bileşik görüntüler faz kontrast, kırmızı ve yeşil kanallarını görüntüler de dahil olmak üzere. Alt: bileşik görüntüler (kırmızı ve yeşil kanal) kırmızı/yeşil örtüşme maskesi. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek şekil 3. CD8 yayılması üzerine myeloid hücrelerin tümör infiltre etkileri+ T hücrelerinin. (A)temsilcisi histogramlar CD8 CFSE ile floresan etiketleme, seyreltme gösterilen+ T hücreleri. Saf dalak CD8+ T hücreleri Protokolü-3'te açıklandığı gibi izole ve CFSE 5 mikron 15dk için 37 ° C'de etiketlenir. Etiketli T hücreleri IL-2 huzurunda kültürlü ve Show anti-CD3/CD28 Protokolü 4'te açıklandığı gibi antikorlar ile ya da ezelî myeloid hücrelerin aktive edildi. 4 gün sonra T hücrelerinde yeşil floresans akış sitometresi tarafından algılandı. (B) bölümü Dizin CD8+ T hücre yukarıda açıklanan17olarak hesaplanır. Veri anlamına gelir ± SEM vardır * P < 0,01 karşılaştırıldığında denetlemek için #P < αCD3/CD28 için AB ile karşılaştırıldığında 0,05 bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Takıma giren film 1. Şekil 3 ve 4 film; E + T. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Takıma giren film 2. Şekil 3 ve 4 film; Efektör (E). Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Takıma giren film 3. Şekil 3 ve 4 film; Hedef (T). Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Takıma giren film 4. Şekil 3 ve 4 film; MDSC-E + T. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Takıma giren film 5. Şekil 3 ve 4 film; MAM-E + T. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Takıma giren film 6. Şekil 3 ve 4 film; MAM-E + T (yayılması). Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu yöntem iki ayrı ortak kültür merdivenlerinde dayanmaktadır:+ T potansiyel bastırıcı hücrelerle hücreleri CD8 ortak kültür ve 'ön şartına' CD8 ortak kültür+ T hücreleri hedef tümör hücreleri (Şekil 1). İlk ortak kültür adım CD8 için oldukça benzer+ T hücre proliferasyon deneyleri bastırıcı hücreleri CD8 üzerindeki etkisini belirlemek için yaygın olarak kullanılan+ T hücre işlevi. Ancak, T hücre çoğalması her zaman onların sitotoksisite ile ilişkili değil. Örneğin, M-MDSCs veya analar bu ortak kültür bulduk CD8 azaltılmış yayılması yerine artış+ T hücrelerin CD3/CD28 varlığında antikor (ek şekil 3), aktive bunlar önceden CD8 şartına ise+ T hücreleri gösterdi azaltılmış sitotoksisite karşı hedef kanser hücrelerinin (resim 4 resim 5, Şekil 6). Bu sonuçlar fonksiyonel etkinlik, hedef kanser hücre apoptosis, bu CD8 tarafından sunulan kanıtladığı değerlendirilmesi önemini vurgulamak+ T hücre sitotoksisite tahlil.

Bu tahlil, biz o CD8 belirledik+ T hücreleri maksimum apoptosis E0771-LG fare meme tümör hücrelerinin (Şekil 5) teşvik için yaklaşık 15 h ortak kültür gerektirir. Bu gecikme efektör hücreler hedefleri ve eşlik eden bağışıklık synapse oluşumu gibi apoptotik sinyaller caspase-3 (takıma giren film 1 aktivasyonu tarafından ölçülen hedefleri de ikna etmek için gereken süre ile ilk temas arasında gecikme nedeniyle olabilir ). Biz aynı zamanda tespit apoptotik tümör hücrelerinin sayısı 24 h, T hücreleri tarafından hedefleri ortadan kaldırılması ve/veya ölü hücrelerden floresan sinyal kaybı nedeni olabilir sonra bir plato ulaşmıştır. Bir uygun zaman noktası tayini farklı koşullar arasında uygun karşılaştırmalar için önemli olduğundan en yüksek apoptosis zaman tanımlamak için bu yeteneği bu testin bir büyük avantaj sağlıyor. Örneğin, sitotoksisite+ T kontrol CD8 arasındaki farkı bizim durumumuzda hücreleri ve MDSC/MAM-eğitimli CD8+ T hücreleri, 15-18 h 72 h (Şekil 5) göre daha büyük ve böylece bir son nokta deney 72 h kuluçka dönemi'ni kullanarak yanıltıcı sonuçlar.

Bu yöntem ayrıca CD8 sınırlı sitotoksisite altta yatan mekanizma içine ilgili daha ayrıntılı bilgi sağlayan gerçek zamanlı efektör hedef hücre etkileşimin görselleştirme sağlar+ T hücreleri önceden bastırıcı hücreleri ile inkübe. Örneğin, biz bu gözlenen CD8+ T hücre M-MDSCs veya analar ile önceden inkübe karşılaştı ve hedef tümör hücreleri ile etkileşim ama her zaman apoptosis (Tamamlayıcı film 4, takıma giren film 5, takıma giren film 6) teşvik değil. Her ne kadar biz bu olay ölçmek değil, mümkün ve ölçmek ve karşılaştığında ve korelasyon apoptosis indüksiyon ile etkileşim zamanında oranı karşılaştırmak ilginç olurdu. Bu yöntem az sayıda hücreleri (örneğin, 1 x 103 hedef) ve 4 x 103 şey başına efektör hücrelerin gerektirir başka bir büyük avantaj sağlıyor. Aslında, bu iletişim kuralı daha fazla 384-şey plaka biçimini istenirse küçültülmüş. Bu nedenle, bu tahlil vitro test değerli hücreleri kullanarak türetilmiş içinde vivo veya ex vivo örnekleri gibi burada hücre sayıları sınırlı yüksek aktarım tarama ve deneyleri için uygun olmasıdır.

Öte yandan, bir sınırlama geçerli testin ölü efektör hücrelerde bazı koşullar önemli sayıda varlığıdır. Apoptozis hedef kanser hücrelerinin efektör CD8 bundan ayırt etme doğruluğu artırmak için+ T hücreleri, hedef hücreleri etiketlenir çekirdekleri ve (yani efektör hücreleri hariç) boyutu kısıtlamasını bu veri analizi için uygulanan bir çekirdek tahlil (Şekil 2). Ancak, bazı durumlarda nerede sonuçları yıkmak sigara apoptotik hedef kanser hücreleri, bindirme toplamları (yeşil) apoptotik CD8+ T hücreleri vardır. Bu sınırlama tarafından yeterli sayıda efektör hücrelerin hazır olduğunu varsayarsak hedef tümör hücreleri ile birlikte kültür efektör hücreler öncesinde bir ölü hücre kaldırma sütun kullanımı hafifletilmiş. Daha karmaşık mikroskobu sistemleriyle de efektör CD8 etiketleme tarafından yanlış olumlu sinyal azaltmak mümkün olabilir+ T hücreleri hedef hücre çekirdeği ve fluorogenic caspase-3 maddeyi ayrı bir fluorophore ile.

Şimdiye kadar bu iletişim kuralını CD8 antijen spesifik olmayan aktivasyonu araştırmak için kullanılan+ T hücreleri. Her ne kadar MDSCs ve tümör microenvironment TAMs T hücre fonksiyonları antijen spesifik olmayan mekanizmalar yoluyla bastırmak, periferik lenfoid dokulara MDSCs T hücre antijen belirli şekilde18yanıt-e doğru bastırmak. + T hücreleri OT-1 den böyle hücre tiplerinin bağışıklık baskılayıcı işlevleri CD8 kullanarak bir tüp bebek yayılması tahlil araştırmak için transgenik fareler yaygın olarak kullanılan. Bu tahlil (ovalbumin (OVA) belirli T hücre reseptör ifade) OT-1 T hücreleri ile bastırıcı MDSCs OVA peptidler, huzurunda ilk kültür bizim sitotoksisite tahlil için geçerli olduğu ortak kültürlü (i.e., harekete geçirmek-in T hücreleri varlığı ya da yokluğu bastırıcılarının). Hedef kanser hücrelerinin antijen spesifik kanser hücresi öldürmek OT-1 T hücreleri tarafından teşvik edebilirsiniz OVA ifade etmek için işlemek için uygulanabilirdir. Bu nedenle, tahlil Ayrıca antijen spesifik T Hücre aktivasyonu MAM/MDSC-aracılı bastırılması incelenmesi sağlayacaktır. İnsan hücreleri, insan CD3 ve CD28 karşı harekete geçirmek antikor ticari mevcuttur ve insan TAMs klinik örneklerinden izole etmek için bir protokol kurulan19oldu araştırmak için tahlil uygulamak mümkündür.

Toplu olarak, bu tahlil oldukça çok yönlü ve sitotoksisite diğer bağışıklık hücre tiplerinin incelemek için kullanılabilir. Şu anda, bizim labs, antijen-bağımlı hücre sitotoksisite çeşitli koşullar altında incelemek için genişletilmekte ve aynı zamanda yüksek üretilen iş için geliştirilen eleme.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser hibe Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) ve MRC (Bay N022556 1 / / (JWP, TK), UK) tarafından desteklenmiştir. NOC ve DDS Ulusal fenotipik eleme merkezi Phenomics bulma girişimi ve kanser araştırma İngiltere'de (NOC) destek kabul

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 Tripsin EDTA (1X)Gibco25300-054
12 Kuyulu Hücre Kültürü PlakasıFreiner Bio-One665-180
1x PBSGibco14190-094
2-merkaptanetanolSigmaM6250-10ML
5mL Plystirene Yuvarlak Tabanlı BoruFALCON352054
96 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası (Yuvarlak Alt)Costar3799CD8 + T hücrelerinin sıralanmış miyeloid hücrelerle ko-kültürü
96 oyuklu plaka (Düz dipli)Nunc165305Sitotoksisite deneyi için hedef hücrelerle CD8 + T hücrelerinin ko-kültürü
AF647 anti-fare F4 / 80 AntikorBIO-RADMCA497A647Klon: CIA3-1, Lot #: 1707, 2 & mu; L / 1x10 ^ 6 hücre
AlexaFluor700 anti-fare CD8 AntikorBiolegend100730Klon: 53-6.7, Lot #: B205738, 0.5 & mu; L / 1x10 ^ 6 hücre
anti-fare CD28 AntikorBiolegend102111İzole CD8 + T hücrelerinin aktivasyonu, Klon: 37.51, Lot #: B256340
anti-fare CD3e Antikor Biolegend100314İzole CD8 + T hücrelerinin aktivasyonu, Klon: 145-2C11, Lot #: B233720
APC anti-fare CD3 AntikorBiolegend100236Klon: 17A2, Lot #: B198730, 0.5 & mu; L / 1x10 ^ 6 hücre
APC / Cy7 anti-fare Ly6C AntikorBiolegend128026Klon: HK1.4, Lot #: B248351, 1 & mu; L / 1x10 ^ 6 hücre
Sığır Serumu AlbminSigmaA1470-100G
Hücre Süzgeci (100 & mu; m Naylon)FALCON352360Dalağı parçalamak için
Hücre Süzgeci (40μ m Naylon)FALCON352340Akciğer sindirimini filtrelemek için
DAPIBiolegend422801
Dulbecco′ s Modifiye Eagle & Prime; s OrtaGibco41966-029
EasySep Fare CD8 + T Hücre İzolasyon KitiKök Hücre Teknolojileri19853
Fetal Sığır SerumuGibco10270-106
FITC anti-fare CD4 AntikorBiyoefsanesi100406Klon: GK1.5, Lot #: B179194, 0.5 & mu; L/1x10^6 hücre
Geltrex Kullanıma HazırGibcoA1596-01Sitotoksisite deneyi için 96 oyuklu plakaların kaplanması
IncuCyte NucLight Red Lentivirus ReaktifiEssen BioScience4476mKate2
IncuCyte ZOOMEssen BioScienceDedektörü (floresan mikroskobu)
IncuCyte ZOOM 2018AEssen BioScienceAnaliz yazılımı
L-Glutamin (100X)GibcoA2916801
Akciğer Ayrışma KitiMiltenyi130-095-927Tümör taşıyan akciğerden tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
MycoAlert Mycoplasma Tespit KitiLonzaLT07-318
Esansiyel olmayan amino asit (100X)Gibco11140-035
NucView488Biotium10403Florejenik kaspaz-3 substrat
PE anti-fare Ly6G Antikor Biyoefsane127607Klon: 1A8, Lot #: B258704, 0.5 & mu; L / 1x10 ^ 6 hücre
PE / Cy7 anti-fare CD11b AntikorBiyoefsane101216Klon: M1 / 70, Lot #: B249268, 0.5 & mu; L / 1x10 ^ 6 hücre
Kalem StrepGibco15140-122Penisilin Streptomisin hücrelerin birincil kültürü için
PerCP / Cy5.5 anti-fare CD45 AntikorBiyoefsanesi103132Klon: 30-F11, Lot #: B249564, 0.5 & mu; L / 1x10 ^ 6 hücre
Polibren (Heksadimetrin bromür)SigmaH9268
PuromycinGibcoA11138-03
RBC Lizis Tamponu (10X)Biolegend420301
Rekombinant murin IL-2Peprotech212-12İzole CD8 + T hücrelerinin aktivasyonu
Sodyum piruvat (100X)Gibco11360-070
TruStain fcX (anti-fare CD16/32) AntikorBiolegend101320
 : Nikon 10X objektif (çözünürlük 1.22 & mikro; m)
 : Yeşil kanal uyarımı: 440 - 480 nm
 : Yeşil kanal emisyonu: 504 - 544 nm
 : Kırmızı kanal uyarımı: 565-605 nm
 : Kırmızı kanal emisyonu: 625 - 705 nm

Kaynaklar

  1. Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).
  2. Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9. , 14(2018).
  3. Tanaka, A., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in cancer immunotherapy. Cell Research. 27, 109-118 (2017).
  4. Fleming, V., et al. Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression. Frontiers in Immunology. 9, 398(2018).
  5. Cassetta, L., Kitamura, T. Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy. Immunology. 155, 285-293 (2018).
  6. Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates. Methods. 31, 120-126 (2003).
  7. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).
  8. Azimi, M., et al. Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells. Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).
  9. Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions. Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).
  10. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4, e6562(2009).
  11. Kitamura, T., et al. Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer. Frontiers in Immunology. 8, 2004(2018).
  12. Bronte, V., et al. Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards. Nature Communications. 7, 12150(2016).
  13. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).
  14. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).
  15. Choppa, P. C., et al. Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome. Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , Appendix 3:Appendix 3B (2001).
  17. Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).
  18. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).
  19. Cassetta, L., et al. Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages. Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Miyeloid Kökenli Baskılayıcı HücrelerTümörle İlişkili MakrofajlarGerçek Zamanlı Floresan MikroskobuKaspaz-3 SubstratıT-Hücre AktivasyonuKo-Kültür Analiziİmmün Baskılama AnaliziYüksek Kapasiteli Tarama
Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.