Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

Max Z. Levine; Nicole E. Gregorio; Michael C. Jewett; Katharine R. Watts; Javin P. Oza

doi:10.3791/58882

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

37.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58882

⸱

25 Şubat 2019

Max Z. Levine^*¹^,² , Nicole E. Gregorio^*²^,³ , Michael C. Jewett⁴^,⁵^,⁶^,⁷ , Katharine R. Watts²^,³ , Javin P. Oza²^,³

¹Department of Biological Sciences, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, ²Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, ³Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, ⁴Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, ⁵Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, ⁶Center for Synthetic Biology, Northwestern University, ⁷Interdisciplinary Biological Sciences Program, Northwestern University

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Özet

Son 50 yılda, boş hücre Protein sentezi (CFPS) tüp bebek hücrelerde transkripsiyon ve çevirim kapasitesi koşum için güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Hücre canlılığı korumanıza gerek obviating tarafından ve hücresel bariyer ortadan kaldırarak CFPS hızlı prototipleme için geleneksel olarak zorlu proteinlerin biomanufacturing ortaya çıkan uygulamalarda yanı sıra uygulamaları temel olmuştur metabolik Mühendisliği ve fonksiyonel genomik. Bir E. coliuygulamak için bizim yöntemleri-tabanlı CFPS platformu bırakmak bu uygulamaların birçoğu erişmek yeni kullanıcı. Burada, özü zenginleştirilmiş medya, şaşkın şişeler ve akort sonication tabanlı hücre lizis tekrarlanabilir yöntemi kullanılarak hazırlamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Uygun reaktif stokları önceden hazırlanmış göz önüne alındığında bu özü sonra protein ifade 900 µg/mL veya daha fazla süper klasör yeşil flüoresan protein (sfGFP) veri analizi, deneysel kurulum sadece 5 h üretebilen için kullanılabilir. Reaktifler elde etme tahmini başlangıç maliyeti 4500 $ $0.021 µg üretilen protein başına veya 0.019 $ µL tepki başına tahmini ücret karşılığında tepkiler binlerce sürdürmek olduğunu. Ayrıca, protein ifade yöntemleri piyasada bulunan sistemlerde reaktif öncesi karışımları, bir kısmını maliyeti duruma getirilmesi nedeniyle görülen tepki kurulum kolaylığı ayna. Geniş uygulamaları için CFPS platform esnek doğası kaldıraç sağlamak için biz bu şekilde ayarlanmış ve kullanılabilir kaynakları ve protein ifadesi sonuçlar bağlı olarak en iyi duruma getirilmiş platformu yönlerini çeşitli belirledik istenen.

Giriş

Boş hücre Protein sentezi (CFPS) protein üretim, fonksiyonel genomik, metabolik Mühendisliği ve son 50 yıl¹^,²içinde daha fazlası için yeni fırsatlar bir dizi kilidi bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Standart vivo içinde protein ifade platformları için karşılaştırıldığında, CFPS üç önemli avantajlar sağlar: 1) platformu boş hücre doğa olası toksik veya dış hücre³^,^{4 olurdu proteinleri sağlar} ^,⁵^,⁶; 2) ina....