Yöntem makalesi

İki boyut Electrospun Nanofiber paspaslar genişleme içine üç-boyut iskele

6.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58918

⸱

7 Ocak 2019

 ,  ,  , 
1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

Bu makalede

Özet

Bu makalede, bir üç-boyut (3D) iskele üzerinden depressurization süperkritiğe CO2 sıvı içine bir geleneksel, iki-boyut (2D) electrospun nanofiber mat genişletme tekniği gösterilir. Bu artar iskele 3D, yakından kopyalama hücresel nanotopographic yardımlar, vardır ve biyolojik moleküllerin nanofibers içinde kapsüllenmiş işlevlerini korumak.

Özet

Electrospinning üreten bir sentetik, fonksiyonel iskele hücre dışı matriks ve bileşimi, yapısı ve elyaf çapı kolaylığı kontrolünü Biyomimikri nedeniyle tercih edilen teknoloji olmuştur. Ancak, bu avantajlara rağmen geleneksel electrospun nanofiber iskele sınırlamalar da dahil olmak üzere gel nanofiber yönünü, düşük gözeneklilik, küçük gözenek boyutu ve esas olarak iki boyutlu paspaslar dağınık. Bu nedenle, yukarıdaki sınırlamalar üstesinden gelebilir electrospun nanofiber iskele imalatı için yeni bir süreç geliştirmek için büyük bir ihtiyaç vardır. Burada, roman ve basit bir yöntem gösterilmiştir. Bir geleneksel 2D nanofiber mat 3D bir iskele istediğiniz kalınlıkta, gap mesafe, porozite ve hücre tohum ve depressurization süperkritiğe CO2 sıvı yoluyla yayılması için izin vermek için nanotopographic yardımlar ile dönüştürülür. Gerçekleşmesi doku rejenerasyonu için bir iskele sağlamaya ek olarak, bu yöntem aynı zamanda yerel ilaç dağıtım için antimikrobiyal peptidler moleküllerin biyoaktif kapsüllemek için fırsat sağlar. CO2 genişletilmiş nanofiber iskele doku yenilenmesi, yara iyileşmesi, 3D doku modelleme ve topikal ilaç dağıtım büyük potansiyele sahip.

Giriş

Hastaların doku onarımı ve rejenerasyon yardım içine implante bir sentetik iskele geliştirme kavramı rejeneratif tıp alanında yıllardır nüfuz biridir. İdeal sentetik iskele sağlıklı dokuyu çevreleyen gelen hücre göç ikna etmek için hizmet vermektedir, hücre tohum, adezyon, sinyal, yayılması ve farklılaşma, destekler vaskülarizasyon için bir mimari sağlar, için yeterli oksijenlenme sağlar ve beslenme teslim ve başarı implantasyon1sonra emin olmak için ana bilgisayar bağışıklık etkinliğini teşvik etmektedir. Ayrıca, bu bir taşıyıcı olarak antimikrobiyal molekülleri gömmek için1,3,6,7,8,9şifa yarada yardımcı olmak için kullanılabilir. Sentetik iskele zamansal yayınlamasını biyolojik moleküllerin kontrol yeteneği ne zaman mühendislik1iskele olarak kabul edilir başka bir arzu özniteliğidir.

Electrospinning nanofiber iskele1,2,3,4,5,6üretimi için iyi kullanılan bir teknik olmuştur. Burada tartışılan biri gibi nanofiber iskele oluşturmak için önceki girişimleri başarı değişik derecelerde için yapılmıştır. Ancak, geleneksel nanofiber iskele bu hedeflere ulaşmak için yetenekleri sınırlı olabilir. Geleneksel nanofiber iskele çoğunlukla iki boyutlu paspaslar1,3olmuştur. Bu nonexpanded iskele yoğun küçük gözenek boyutları ile paketlenir; vivo1,7,8,9bulunanlar için benzer bir ortam teşvik değil gibi bu hücre infiltrasyonu, geçiş ve farklılaşma sınırlar. Bu nedenle, 3D electrospun nanofiber iskele hazırlık yeni teknikleri ile 2D nanofiber paspaslar gelip doğasında kusurlarını değiştirilmesi için kurulmuştur. Bu teknikler 3D iskele neden; Ancak, uygulanabilirlik sulu çözümler gerektiren ve yordamlar dağılması üretim yöntemleri nedeniyle sınırlı olabilir. Bu işleme nanofibers sınırlı organizasyon, uygun kalınlık ve/veya hücre göç ve yayılması için gerekli olan yeterli nanotopographic yardım sağlamak için istenen porozite olmadan rasgele dağıtıma sonuçlanır. Bu faktörlerin yaşam yeterli asla bilemeycek eksikliği önceki 3D electrospun nanofiber iskele neden doku1,7,8,9.

Hücre dışı matriks (ECM) daha iyi Biyomimikri ile bir genişletilmiş, 3D iskele geliştirme daha yeni girişimler performans daha iyi kontrol altında yardım etmek için bir sulu sodyum borhidrür (NaBH4) çözüm tedavi ve önceden tasarlanmış kalıpları kullanarak İskele yapısı-7,8elde edilen şekli. Ancak, bu yöntem polimerler ve suda çözünen kapsüllenmiş herhangi bir biomolecules ile girişime neden olabilir sulu çözümler, kimyasal reaksiyonlar ve dağılması kullanımını gerektirir gibi ideal değildir. Kullanılan katkı maddeleri de doku rejenerasyonu8,9sırasında yan etkilere neden olabilir. Büyük ölçüde bu makalede özetlenen CO2 genişletme yöntemi işlem zamanı azaltır, sulu çözümler ortadan kaldırır ve tutar ve biyolojik olarak aktif molekülleri daha büyük ölçüde işlevselliğini korur daha önce kurulan yöntemleri9.

Önceki çalışmalar, antibiyotik, gümüş, 1α, 25 dihydroxyvitamin D3ve antimikrobiyal peptid LL-37 yüklü nanofiber iskele ayrı ayrı ve birlikte acentelere serbest bırakmak için bu iskele potansiyelini araştırmak için daha fazla9,10,12,13şifa yarada yardım. Bu yöntem nanofiber iskele genişleme gösteren amacıyla, Coumarine 6, floresan bir boya, iskele iskele ile çeşitli istenen bileşikler katıştırma potansiyel göstermek içine yüklenir. Genişletilmiş nanofiber iskele imalatı kapsüllenmiş biyoaktif molekülleri ile birlikte bu yöntem doku yenilenmesi, yara iyileşmesi, 3D doku modellerinin oluşturulması ve ilaçların topikal teslim büyük potansiyele sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aşağıda verilen tüm vivo içinde yordamlar Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'nde IACUC Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Standart Electrospinning için çözümleri hazırlayın

  1. 20 mL Cam tüp poly(ε-caprolactone) 2 g dağıtılması (PCL, Mw = 80 kDa) diklorometan (DCM) bir solvent karışımı ve N, N-dimethylformamide (DMF) ile bir konsantrasyon % 10 (w/v), 4:1 tayın (v/v).
    Dikkat: Tanıtıcı DCM ve iyi havalandırılmış bir başlıklı DMF duman maruz önlemek için. DCM plastik malzemeler için maruz bırakmayın.
  2. Çözüm açık hale gelinceye kadar cam tüp bir laboratuvar rotator yerleştirin. Çözüm gecede karışımı.
  3. Peptidler veya uyuşturucu gibi biyoaktif maddeler iskele katıştırmak isterseniz ayrı bir çözüm oluşturmak ve kullanmak için hazır kadar 4 ° C'de depolayın.
    1. 20 mL PCL çözeltisi kullanarak floresan boya solüsyonu (50 mg/mL) hazırlayın.

2. Electrospinning aparatı (şekil 1A) ayarla

  1. PCL çözüm bağlı 21 ölçer künt iğne ile 20 mL şırınga ekleyin. Havasız şırınga ve ilişkili boru içinde olduğundan emin olun.
  2. Zemin toplayıcı 12 cm iğne ucu ile dönen bir çelik tambur yerleştirin.
  3. Timsah klipleri kullanıyor, iğne için doğru akım (DC) yüksek gerilim güç kaynağını bağlayın ve toplayıcı topraklı olduğuna dikkat edin.
    Dikkat: Her zaman bağlı herhangi bir malzeme işleme önce güç kaynağı devre dışı.

3. Electrospinning

  1. PCL çözüm 20 mL şırınga pompa parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: çapı = 20.27 mm, akış hızı = 0.5 mL/h. onay ise damlacıkları iğne ucunda oluşturuyoruz.
  2. Biyoaktif moleküllerin birleşme isterseniz aparatı koaksiyel electrospinning (Şekil 1B)izin vermek için ayarlayın. Özelleştirilmiş bir koaksiyel meme Hipodermik iğneler kullanarak oluşturun.
    Not: Bu tür püskürtme uçlarını da ticari olarak kullanılabilir. Not boya çözeltisi böyle molekülleri ekleme benzetimini yapmak için hazırlanmıştır.
    1. Floresan boyalar suda Coumarin 6 %1 çözeltisi hazırlamak. 3 mL % 1 boya küçük bir şırınga ekleyin. Şırınga aynı koaksiyel meme PCL çözüm olarak bağlayın. Bir kez daha, hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.
    2. Bu 3 mL solüsyon için şırınga pompa parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: çapı = 9,49 mm, debi 0,02 mL/h. onay = Eğer damlacıklar iğne ucunda oluşturuyoruz.
  3. Geçerli bir elektrik potansiyeli 20 kV (22'lik iğne) spinneret ve bir yere toplayıcı arasında yer alan 20 cm uzakta spinneret. 2.000 rpm'de döner davul hizalanmış nanofiber paspaslar toplamak. Bir kez onlar uzanmak ~ 1 mm kalınlığında PCL nanofiber paspaslar toplamak.

4. nesil PCL Nanofiber ile dizilmiş delik paspaslar.

  1. PCL nanofiber paspas imal.
    1. PCL boncuk 4:1(v/v) adlı bir konsantrasyon (PCL) (w/v) % 10 oranında DCM ve DMF oluşan bir solvent karışımı geçiyoruz. PCL çözüm 0.7 mL/h bir şırınga pompa süre 20 potansiyelini kullanarak akış hızında pompa kV spinneret (22-gage iğne) arasında uygulanan ve topraklı bir koleksiyoncu 12 cm spinneret dışında bulunan.
    2. Dönen bir hızla 500 rpm büyük döner davul kullanarak nanofiber membran toplamak.
  2. PCL nanofiber paspaslar sıvı N2 5 min için bırakın (i.e., sert). PCL nanofiber paspaslar sıvı N2 ' deki tutmak ve PCL nanofiber paspaslar ile 0,5 mm çap yumruk yumruk.

5. 2D Nanofiber genişlemesi dizilmiş delik üzerinden süperkritiğe CO2 sıvı olan/olmayan (Şekil 2) paspaslar.

  1. 5 min için sıvı azot PCL nanofiber paspaslar yerleştirin ve deformasyon kenarlarının önlemek için sıvı azot sular altında iken keskin cerrahi makas kullanarak 1 cm x 1 cm kareler kesin.
  2. Kesme mat ~ 1 g kuru buz bir 30 mL santrifüj tüpü yerleştirin. Sıkı kapağını kap ve kuru buz sıvı CO2değiştirmek izin vermek.
  3. Bir kere sıvı tüp oluşturmuştur, hızlı bir şekilde baskı kapağı açarak serbest bırakın.
    Uyarı: uygun Termal koruyucu giysiler sıvı azot ve kuru buz ile çalışırken kullanın. Yüz doğru Basınçlı Tüp açmayın. Santrifüj tüpü tekrar tekrar kullanılmamalıdır.
  4. Kaldırmak ve tüp kahvaltılık iskele gözlemlemek. İskele Kuru buz ile yeni bir santrifüj tüpü yerleştirin ve istenilen kalınlık elde kadar tekrarlayın. Etilen oksit kuluçka hücrelerle önce genişletilmiş nanofiber iskele sterilize.

6. genişletilmiş Nanofiber iskele karakterizasyonu

  1. Morfoloji ve Tarama elektron mikroskobu (SEM) kullanarak genişletilmiş nanofiber iskele yapısını karakterize eder.
    1. Bantlı Çift taraflı iletken metalik stud ve 40 için platin paltoyla örnekleri yer s 40, bir sputter coater kullanarak anne.
    2. SEM önceki çalışmalar9göre kullanarak lifleri inceleyin. İmge vasıl 15 hızlanan bir gerilim toplamak kV.
  2. Vitro yayın profilleri ve yayımlanan peptidler bioactivity karakterize eder.
    1. Ağırlığı 10 mg nanofiber membranlar öncesi ve sonrası genişleme CO2.
    2. PBS arabellek örneklerinde bırakın ve süpernatant farklı zaman noktaları (0-28 gün), 10 μL toplamak.
    3. Enzyme-Linked immün jelleştirici Assay (ELISA) kiti toplanan süpernatant LL-37 peptid konsantrasyon ölçmek için kullanın.
  3. Hücresel infiltrasyon vivo içinde ve ana bilgisayar yanıt inceleyin.
    1. 9 - eski hafta Sprague-Dawley (SD) fareler bir anestezi odasında koymak isoflurane buharı bağlanmak ve fareler anestezi. Fareler duygular olmadan tam anestezi olduktan sonra fareler bir işletim masa aktarın. Sürekli bir isoflurane-burun konisi buharlaştırıcı ile ameliyat sırasında kullanarak fareler anestezi. Bir hayvanın tıraş makinesi tarafından fare sırt saç tıraş ve iyot ve alkol deri bodur ile sterilize. 1,5 cm kesi yoluyla subkutan cepler supraspinal sitelerde bir neşter kullanarak patolojisi üzerinde oluşturun.
    2. Her kesi için cımbız kullanarak subkutan cep bir genişletilmiş nanofiber İskele yapısı-İskele (1.5 mm kalınlığında) takın. Bir zımba kullanarak kesi kapatın.
    3. 1, 2 ve 4 hafta, % 95 CO2farelerle ötenazi. Hafifçe explant ve cerrahi makas kullanarak çevreleyen doku incelemek. Histolojik Analizi önce formalin dokusunda en az 3 gün için bırakın ve parafin ile embed. Doku microtome ile bölüm sonra hematoksilen ve eozin (H & E), gerçekleştirmek Masson'ın trichrome boyama.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Geleneksel 2D electrospun nanofiber paspas 3D iskele yolu ile depressurization süperkritiğe CO2 sıvı içine genişletme etkinliği farklı kapasitelerde gösterilmiştir: iskele kalınlığı artmış 1 2,5 mm ile tedavi edilmediği zaman mm ve 19.2 mm CO2 tedaviler, bir ya da iki ile sırasıyla (Şekil 3A-C). Gözeneklilik-a özelliği hücre tohum için kritik mimarisinin-aynı zamanda artmış kalınlığı (Şekil 3 c

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Geleneksel 2D electrospun nanofiber paspaslar Genişletilmiş 3D iskele üzerinden CO2 depressurization araştırıldı dönüştürme. Geleneksel 2D nanofiber paspaslar başarıyla genişletilmiş üzerinden süperkritiğe CO2 sıvı vardır. 2D nanofiber paspaslar en iyi duruma getirilmiş bir koşul altında imal ve paspaslar kenarları bozulmayı olmadan kesmek için kritik adım vardır (Örn., kullanma cerrahi makas keskin). Bu CO2-genişletilmiş nanofiber iskele birçok faydası var katm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olduğunu ilan eder.

Teşekkürler

Bu eser desteklenmiştir tarafından Ulusal Enstitüsü, genel tıp bilimi (NIGMS) (2 P 20 GM103480-06 ve 1R01GM123081 J.X. için), NIH Nebraska Üniversitesi Tıp Otis Glebe Tıbbi Araştırma Vakfı, Doğu LB606 ve başlangıç fonlarından hibe Merkezi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PolikaprolaktonSigma-Aldrich440744
N, N-DimetliformamidFisher KimyasalD-199-1
DiklorometanFisher KimyasalAC61093-1000
Kumarin 6Sigma-Aldrich546283
Döner Çelik TamburözelleştirilmişBu, elektrospinning sırasında bir toplayıcı görevi görür.
Şırınga PompasıFisher Scientific14-831-200Koaksiyel eğirme, iki adet tek şırınga pompası gerektirir.
RevolverLab Net InternationalH5600Karıştırma çözeltileri için ayarlanabilir laboratuvar döndürücü
Hipodermik İğne (27G x 1 1/2")EXCELINT International Co26426Bu, gösterilen örnek özelleştirilmiş koaksiyel nozzel'in bir parçasıdır.
Hipodermik İğne (21G x 1 1/2")EXCELINT International Co26416Bu, gösterilen örnek özelleştirilmiş koaksiyel nozzelin bir parçasıdır.
Yüksek Gerilim DC Güç KaynağıGama Yüksek Gerilim AraştırmasıES30
Taramalı Elektron MikroskobuFEINova 2300
Floresan MikroskobuZeissAxio Görüntüleyici 2
LL 37 ELISA KitiHycult BiotechHK321-02

Kaynaklar

  1. Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
  2. Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626(2015).
  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
  5. Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
  7. Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
  8. Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
  9. Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
  10. Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
  11. Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
  12. Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
  13. Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
  14. Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B skele retimiKritik Alt CO2 Genle mesiPolimer zelti Haz rlamaElektrospinning D zene i KurulumuS v Azot lemeKuru Buz Uygulamasskele G zeneklilik AnaliziH cre Ekimi ProliferasyonuBiyoaktif Molek l Enkaps lasyonu

İlgili makaleler