Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

13K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58938

⸱

20 Ocak 2019

 ,  , 
1Comprehensive Cancer Center, James Cancer Hospital and Solove Research Center, Ohio State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Ohio State University

Bu makalede

Özet

Burada, floresan peptidler yerli protein yerine parçalanabilir substrat olarak kullanıldığı bir değiştirilmiş zymographic teknik için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Elektroforez floresan peptid zymograms Biyolojik örneklerin daha önceki zymographic teknikleri geniş proteaz tespiti sağlar.

Özet

Bu yöntemin amacı karmaşık biyolojik örneklerin proteolitik aktivite ölçmek etmektir. Örnekleri moleküler ağırlık kullanarak Elektroforez ile parçalanabilir bir substrat gömülü bir çözme jel ile ayrılır. Bu yöntem bir yüzeyi fluorogenic peptid kovalent jelatin veya kazein gibi tam uzunlukta proteinler yerine çözme jel içine dahil geleneksel jel zymography farklıdır. Fluorogenic peptidler proteolitik aktivite ek boyama adımları olmadan doğrudan algılama sağlar. Biyolojik örnekler içinde enzimler floresans içinde bir artış kaynaklanan çeliklerini fluorogenic peptid ayırmak. Jelleri floresan sinyalin sonra Standart Floresan jel tarayıcıyla görüntüsü ve Dansitometresi kullanarak sayılabilir. Parçalanabilir substrat olarak peptidler kullanımı büyük ölçüde zymographic teknikleri ile tespit mümkün proteaz genişletir.

Giriş

Jel zymography biyolojik örnekleri, vücut sıvıları veya hücre kültür medya1,2,3gibi içinde proteolitik aktivite ölçmek için kullanılan biyolojik bir tekniktir. Örnekleri onların moleküler ağırlıkları aracılığıyla parçalanabilir bir substrat ile gömülü bir polyacrylamide jel elektroforez ile ayrılır. Jelatin, kazein, kolajen ve elastin, matriks metalloproteinazların (MMPs) -1, -2, -3 -7 -8, -9 ve cathepsins1,2 çeşitli ek -11 etkinliğini ölçmek için kullanılan ortak parçalanabilir yüzeylerde dahil , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. sonra Elektroforez, enzim renatured vardır ve jel içinde protein düşmesine izin. Geleneksel jel zymography, jel Coomassie mavi gibi bir protein boya lekeli ve proteaz aktivitesi Yani, beyaz şeritler (protein yıkımı) koyu mavi zemin üzerine sinyal, bir kaybı algılanır.

Burada, jel zymography parçalanabilir substrat kısa bir fluorogenic peptid kovalent polyacrylamide jel (Şekil 1) dahil olduğu, alternatif bir yöntem için bir protokol açıklayın. Sentetik peptidler ikame olarak parçalanabilir yüzeylerde proteaz geleneksel jel zymography yerli protein9ile karşılaştırıldığında daha geniş olarak algılanmasını sağlar. Fluorogenic peptid kovalent bağ peptid difüzyon ve geçiş sırasında jel elektroforez ile önceki yöntemleri9,10gözlenen engeller. Ayrıca, bir fluorogenic substrat kullanımı ek boyama ve de-boyama adımları proteaz aktivitesinin doğrudan algılama sağlar. Bu yöntem genel amacı fluorogenic peptidler zymogram jeller, kovalent Incorporation aracılığıyla biyolojik örneklerde proteaz aktivitesinin algılama olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. çözme jel katman hazırlanması

  1. Jel çözüm Tablo 1göre çözme bir % 10 polyacrylamide hazırlayın. Tetramethylethylenediamine (TEMED) ve amonyum Persülfat (APS) onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.
  2. Bir boş 1.5 mm mini jel kaset yarı yolda (5 mL) % 10 çözme jel çözüm ile doldurun.
  3. Bir düzey jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için polyacrylamide jel üstüne ince bir tabaka halinde isopropanol (~ 500 µL) ekleyin. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 40 dk) tepkidir.

2. Azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül hazırlanması

  1. İlk çözme jel katman polymerizing, azido-PEG3-maleimide seti-20 ° C depolama--dan almak ve oda sıcaklığında ulaşmak bileşenleri sağlar. Her kit içinde iki bileşeni vardır. Şişe 1 maleimide-NHS ester, bir off-beyaz gri katı için içerir. Şişe 2 azido-PEG3-Amin, biraz sarı yağ içerir.
    Not: Yazarlar yalnızca kısa bir süre (1-2 saat) için saklanabilir gibi 25 mg azido-PEG3-maleimide kiti kullanmanızı-20 ° C'de aşağılamak başlamadan önce sonra hazırlıklı olmak öneririz. 25 mg 10 peptid jelleri üretmek yeterli olur. Jelleri hazırlık 3 hafta içinde kullanın.
  2. Şişe 2 bileşenlerinde hacmi dimetil sülfoksit (DMSO) ve 30 için girdap tavsiye üreticisi dağıtılması sıvılar sağlamak için s-var karışık şey.
  3. Şişe 1 içeriği bir heyecan çubuğunu içeren bir temiz, Kuru 100 mL yuvarlak alt şişesi aktarın.
    Not: şişeye aseton ile durulayın ve nem ile reaksiyonu engellemesini önlemek için kullanım önce kurumasını.
  4. Hemen bir kauçuk septum tıpa şırıngayla balonun ağız içine delinmiş bir diyafram ile ekleyin. Hızlı nem şişeye girmesini önlemek için çalışın.
  5. Ekle iki 18 gauge iğne diyafram şırınga ve bir asal gaz tankı (Örneğin argon gazı) birine bağlayın. 3 dk. Mix şişeye doldurmak için asal gaz tüpleri 1 ve 2 inert gaz altında istenmeyen reaksiyon ürünleri önlemek için bileşenleri sağlar.
    Dikkat: İkinci şırınga iğne böylece inert gaz ile doldurur gibi dışarı şişeye akmaya balonun içindeki atmosferik hava izin veren bir havalandırma sağlamaktır. Havalandırma iğne eklemeyi unutmayın!
  6. İnert gaz kapalı kapa ve iğneden bağlantısını kesin. Bir Ģırınga kullanarak, şişe 2 tam içeriğini balonun enjekte.
  7. İğne ve şırınga kaldırmak ve karıştırma sırasında oda sıcaklığında 30 dakika karıştırmak bileşenleri sağlar.
  8. Ve içeriği bir temiz 5 mL santrifüj tüpü transfer kauçuk septum tıpa çıkarın. Azido-PEG3-maleimide çözüm oda sıcaklığında 1 saat içinde kullanılmalıdır.

3. jel katman çözme peptid hazırlanması

  1. Sonra ilk çözme jel katman polimerli, isopropanol katman dökün. Pipetting 1 mL deiyonize su üstünde jel tarafından jel üst durulama ve sonra suyu dökün.
  2. -80 ° C depodan thiol functionalized floresan peptid almak ve oda sıcaklığında erimek izin.
    Not: Thiol functionalized peptid11,12daha önce açıklandığı gibi hazır olun. Piyasada bulunan peptidler de kullanılabilir ama maleimide thiol etkinleştirmek için terminal sistein kalıntıları eklenmesi tıklatın tepki gerektirir. 10 mM bir hisse senedi konsantrasyon için peptid erimesi ve tekrar tekrar donma-çözülme çevrimleri sınırlamak için küçük (30 uL) aliquots içinde-80 ° C'de saklayın.
  3. % 10 azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül ve Tablo 1göre floresan peptid içeren jel çözüm çözme hazırlayın. TEMED ve APS onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.
  4. Jel kaset (3 mL) kalan bölümünün yarısını jel çözüm çözme peptid ile doldurun.
    Not: Bir çok katmanlı çözme jel yaklaşım peptid ve bağlayıcı her jel için gerekli miktarını azaltır. Peptid çözme jel katman boyutunu gerektiği gibi moleküler ağırlık daha büyük bir dizi karşılamak için ayarlanabilir.
  5. İsopropanol (~ 500 µL) ince bir tabaka polyacrylamide düzey bir jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için jel tepesine pipette. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 40 dk) tepkidir.
    Not: Floresan peptid ışığa duyarlı olduğunu. Photobleaching jel hazırlık, Elektroforez, çamaşır ve geliştirme sırasında önlemek için alüminyum folyo ile kaplı jelleri tutun.
  6. İsopropanol katman dökün ve jel gibi adım 3.1 deiyonize su ile çözme peptid üst durulayın.
  7. Adım 4'e jelleri hemen, kullanmaya devam ederseniz, aksi takdirde, 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) jeller kurumasını önlemek için plastik bir kutu içinde 4 ° C'de x 100 ml hazırlanmış jelleri bırakın. Photobleaching önlemek için alüminyum folyo kutusunda sarın. Jelleri PBS içinde 3 hafta kadar önce kullanım için saklanır.

4. yığın jel hazırlanması

  1. Bir % 5 yığın jel çözüm Tablo 1göre hazırlayın. TEMED ve APS onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.
  2. Jel kaset (~ 2 mL) boş kalan kısmı yığın jel çözüm ile doldurun.
  3. Hızlı bir şekilde bir 1.5 mm jel tarak hava kabarcığı yok wells altında sıkışıp kalır emin yığın jel katmanına yerleştirin. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 10 dk) tepkidir.
  4. Yavaşça tarak ve kaseti jel kaset arkasından çıkarın.

5. Elektroforez için biyolojik örnek hazırlanması

  1. Klimalı hücre medya, hücre lysates, doku homogenates ve MMP standartları başka bir yerde sigara azaltarak koşulları2altında açıklandığı şekilde hazırlayın. Örnekleri ısı değil.
  2. Örneğin, aşağıdaki gibi şartına hücre medya hazırlayın:
    1. Plaka 40.000 hücreleri/cm2 hücrelerin % 10 fetal Sığır serum (FBS) Kültür medya bir 6-şey plaka. Hücrelere oksijen odası (%5 CO2 37 ° C'de) için 24 saat kuluçkaya ve % 70-80 izdiham ulaşmak izin.
      Not: hücreleri istenilen confluency 24 saat sonra ulaşılmış, ek bir 24 saat boyunca % 10 FBS kültür medyada büyümeye izin.
    2. PBS iki kez hücrelerle yıkama ve 2 mL serum serbest Kültür medya ekleyin. Oksijen odası (%5 CO2 37 ° C'de) hücrelerde için ek bir 24 saat kuluçkaya.
    3. Serolojik pipet kullanarak, klimalı ortam her kuyudan toplamak. Herhangi bir hücre artıkları kaldırmak 3 dakika için 1200 rpm'de medya santrifüj kapasitesi. Süpernatant al ve kullanarak 15 mL, 10 kDa molekül ağırlığı kesme santrifüj filtre ünitesi konsantre ol. 4000 x g sallanan bir kova Open End 15 dakika veya 15 dakika içinde bir sabit açılı rotor 5000 x g filtre daxilində santrifüj kapasitesi.
      Not: Bu adım isteğe bağlıdır ancak peptid zymography jeller proteolitik bantlarında şiddetini artırabilir.
    4. Konsantre filtrate taze 1,5 mL santrifüj tüpü aktarın. Aliquot ve mağaza örnekleri-80 ° c ilâ üç donma-çözülme döngüsü.
  3. Protein içeriği bir standart protein miktar tahlil kullanarak ölçmek (Örneğin BCA, Bradford tahlil, vb).

6. biyolojik Elektroforez peptid Zymography jeller örnekleri

  1. Geleneksel zymography örnek arabellek örneklerinde dağıtılması (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 25 gliserol, % 4 SDS, %0.01 bromophenol mavi). Hücre ve doku örnekleri için ~ 30 µg iyi başına toplam protein tavsiye edilir ve 50-100 ng protein MMP standartları için.
  2. 1 400 mL ekleyin jel aparatı Tris-glisin SDS çalıştıran arabelleğe x. Örnek iyi başına 35 µL yükleyin. 1,5 saat ya da moleküler ağırlık standartları faiz proteaz (görünür bir portakal rengi olan) jel katman çözme peptid içinde olduğunu belirtecek kadar 120 V 4 ° C'de örnekleri çalıştırmak.
    Not: Çoğu MMPs ve onların türevleri 35-100 kDa aralığı içinde düşer. Moleküler Ağırlık standartlarını o ağırlıkları jel katman çözme peptid içinde olduğunu belirttiğinizde, Elektroforez durdurulabilir. Aynı prensip diğer sınıfların proteaz bilinen moleküler ağırlıkları ile uygulanabilir. Moleküler ağırlık daha büyük bir dizi üzerinde birden fazla proteaz algılama bir ilgi ise, çözme jel katman boyutunu ve peptid çözme jel katman boyutunu artırın.
  3. Elektroforez, jelleri Plastik kaset kaldırmak ve nazik ajitasyon %2.5 Triton X-100, 1 µM ZnCl2ve 5 mM CaCl2 50 mM'içeren renaturing tampon altında oda sıcaklığında jelleri 10 min için üç kez yıkamak Tris-HCl, pH 7.5.
  4. Transfer % 1'i içeren gelişmekte olan bir arabellek çözüm Triton X-100, 1 µM ZnCl2 jelleri ve 5 mM CaCl2 . 50 mM Tris-HCl, taze geliştirme ile pH 7.5 15 dk. eski yerine koymak için çözüm tampon ve jelleri 24 saat nazik ajitasyon altında 37 ° C'de kuluçkaya , jelleri tam çözümde örtülü emin olmak istedim.

7. görüntüleme peptid Zymography jelleri

  1. 24 saat sonra tarayıcı/Imager uygun uyarma ve emisyon filtreleri kullanarak bir floresan kullanarak görüntü jelleri jel. Örneğin, temsilcisi sonuçlarında gösterilen peptid jelleri floresein ile Birleşik ve 488 bir uyarma filtre kullanarak yansıma nm ve bir emisyon filtresi 521 nm. Senin fluorophore için uygun filtreler kullanarak proteolitik aktivite tespiti en üst düzeye çıkarır.
    Not: Görüntüleri de DNA jelleri etidyum bromür ile lekeli görüntüleme için sık kullanılan bir UV transilluminator ile donatılmış bir jel Imager ile alınabilir. UV transilluminator kullanarak jelleri görüntü (365 nm) ayarı ve bir emisyon filtre 590 nm.
  2. Başka bir yerde13açıklandığı gibi ImageJ kullanarak bant yoğunluklarını densitometric değerlendirme yapmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada açıklanan yöntemi kullanarak, iki floresan proteaz parçalanabilir peptidler polyacrylamide jeller dahil edilmiştir: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (metin ve resimler QGIW kısaltılır) ve GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (metin ve resimler LACW kısaltılır). ↓ dekolte sitesi gösterir. QGIW olan bir kollajen-hücresel collagenases14algılamak için tasarlanmış sıra türetilmiş. LACW MMP-14 ve MMP-1115tespiti için optimize edilmi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Geçerli zymographic teknikleri yerel yüzeylerde birleşme polyacrylamide jeller proteolizis tespiti için içine güveniyor. Bu teknikler yaygın kullanımı topladı sahip iken, onlar-ebilmek bulmak proteaz sayısında hala sınırlıdır. Burada, bir protokol hangi floresan, proteaz parçalanabilir peptidler jel çözme polyacrylamide dahil edilmiştir tanımlanmıştır. Kovalent kullanarak kaplin bir azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül ayrılık ve proteaz daha çok tespiti ile yerel yüzeylerde Şu anda ulaşılabilir olduğunu daha sağlar. F...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Finansman Ohio Devlet Üniversitesi kolej Mühendisliği, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü ve kapsamlı Kanser Merkezi - Arthur G. James Kanser Hastanesi ve Richard J. Solove Araştırma Enstitüsü tarafından sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mm Boş Jel KasetleriThermoFisher ScientificNC2015
1,5 mm, 10 kuyulu Boş Jel Kaset TaraklarıThermoFisher ScientificNC3510
1x Fosfat Tamponlu TuzluSu Fisher Scientific10-010-049
%20 SDS ÇözeltisiAmbionAM9820
3x Zymography Örnek TamponuBio-Rad1610764
%40 (a/h) Akrilamid/Bis (19:1)AmbionAM9022
6 Kuyulu Doku KültürüPlakaları ThermoFisher Scientific087721B
Amicon Ultra-2 Santrifüj Filtre Ünitesi (10 kDa MWCO)Sigma-AldrichUFC201024
Amonyum PersülfatSigma-AldrichA3678
Azido-PEG3-Maleimid KitiKimyaya Tıklayın AraçlarAZ107
Kalsiyum KlorürThermoFisher ScientificBP510100
Dimetil SülfoksitFisher ScientificBP231
İzopropanolFisher ScientificA416P
Mikro BCA Protein Test KitiThermoFisher Scientific23235
N N N 'N' -Tetrametiletilendiamin (TEMED)Sigma-AldrichT9281
PowerPac Temel Güç KaynağıBio-Rad1645050
Precision Plus Protein Çift Renk StandardıBio-Rad161-0374
PrecisionGlide Hipodermik İğnelerFisher Scientific14-826
Yuvarlak Tabanlı Şişe (100 mL)Fisher Scientific50-873-144
Septum Kauçuk TıpaFisher Scientific50-872-546
Steril Kayma Uçlu Şırınga (1 mL)Fisher Scientific14-823-434
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Trizma hidroklroidiSigma-AldrichT5941
Typhoon 9410 Moleküler GörüntüleyiciGE Amersham8149-30-9410
Çinko KlorürSigma-Aldrich
208086

Kaynaklar

  1. Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
  2. Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
  3. Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
  4. Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
  5. Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
  6. Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
  7. van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
  8. Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
  9. Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
  10. Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
  11. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  12. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  13. Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
  14. Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
  15. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  16. Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
  17. Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
  18. Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Proteaz Aktivite TespitiPeptit Çözünürlük JeliJelatin Zimografi KarşılaştırmasıFloresan Jel TarayıcıGeliştirme Tamponu İnkübasyonuMMP İnhibitör TedavisiPeptit Substrat TasarımıBiyomalzeme Degradasyon AnaliziWestern Blot Doğrulaması
Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.