Yöntem makalesi

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

DOI:

10.3791/58945

⸱

7 Eylül 2019

 ,  , 
1Brain and Spinal Cord Innovative Research Center of Tongji Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University and Frontier Science Research Center for Stem Cells of Ministry of Education, 2College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Synthetic and Functional Biomolecules Center, and Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan bir in vitro nöral-endotel co-kültür sistemi ve biyoortogonal fonksiyonel gruplar ile sialoglycan metabolik birleşme birleştiren bir protokoldür primer nöral kök ve döl hücreleri genişletmek ve yüzey etiket hücre yüzey belirteçlerinin görüntüleme veya kütle spektrometresi analizi için siyaloglycoproteinler.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral kök ve progenitor hücreleri (NSPCs) beynin karmaşık yapıları ve fonksiyonları için hücresel temelidir. Onlar vivo özel nişler bulunmaktadır ve izole edilebilir ve in vitrogenişletilmiş , beyin hasarı onarmak için hücre nakli için önemli bir kaynak olarak hizmet vermektedir. Ancak, NSPCs heterojen ve açıkça moleküler düzeyde tanımlanmış ya da belirli hücre yüzey belirteçleri eksikliği nedeniyle saflaşmış değildir. Daha önce bildirilen protokol, primer NSPC'lerin yüzey siyaloglycoproteom'unun belirlenmesi için nöral-endotel ortak kültür sistemini metabolik glikan etiketleme yöntemiyle birleştirir. NSPC-endotel ortak kültür sistemi kendi kendine yenileme ve birincil NSPCCs in vitrogenişlemesi sağlar , NSPCCs yeterli sayıda üreten. Kültürlü NSPCs Sialoglycans ile doğal olmayan bir sialic asit metabolik muhabir kullanılarak etiketlenir biyoortogononal fonksiyonel gruplar. Kendi kendini yenileyen NSPC'lerden siyaloglycoproteome'yi karşılayarak endotel ortak kültüründe genişleyen ve nöral kültürü farklılaştıran bir membran proteinlerinin listesini tanımlıyoruz. Ayrıntılı olarak, protokol içerir: 1) bir NSPC-endotel ortak kültür ve NSPC ayırt edici kültür kurulumu; 2) azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz) ile etiketleme; ve 3) kitle spektrometresi analizi için nöral kültürden nöral kültür veya protein çıkarma fiksasyonu sonra görüntüleme için modifiye sialoglycan biotin konjugasyonu. Daha sonra, NSPC ile zenginleştirilmiş yüzey işaretleyici adayları, hem genişletilmiş NSPC hem de farklılaştırılmış sinir kültürlerinden kütle spektrometresi verilerinin karşılaştırmalı analizi ile seçilir. Bu protokol, başlangıç maddelerinde düşük miktarda ki membran proteinlerinin tanımlanması nda son derece hassastır ve uygun modifikasyonlarla diğer sistemlerde marker keşfine uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral kök hücreler, kök hücre havuzunu korumak ve nöronlar ve glia içine ayırt etmek için kendini yenileyebilen çok güçlü bir hücre popülasyonu olarak tanımlanır. Onlar sinir sisteminde önemli hücre tipleri ve hastalıklı ve yaralı beyinlere hücre nakli yoluyla rejeneratif tıpta büyük terapötik potansiyel sunabilir1,2. Gelişme ilerledikçe, nöral kök hücre popülasyonu heterojen olur3,4, ve beyindeki nöral kök hücrelerin oranı giderek azalır5. Genel olarak konuşursak, embriyonik nöral kök hücreler ve diğer nöral progenitor hücreleri, topluca nöral kök ve progenitor hücreleri denir (NSPCs), germinal bölgelerde yer almaktadır, ventriküler bölge, ventriküler bölge, ve farelerde subventriküler bölge6. Embriyonik beyinde, nöral kök hücreler doğrudan veya dolaylı olarak ara progenitor hücreleri (IPCs) aracılığıyla nöronlar oluşturmak ve dış subventriküler bölge progenitors aracılığıyla bazı türlerde (oRGs)7,8. Spesifik moleküler imza, morfoloji, kök hücre niş konumu ve farklılaşma potansiyeli tüm beyin organogenez ve klinik uygulamalarda her alt tipin rolünü belirlemek9. Ancak, şu anda kullanılabilir hücre yüzeyi belirteçleri, bu alt tiplerin anlaşılmasını ve kullanımını sınırlayarak, farklı NSPC'lerin alt türlerini kesin olarak ayırt edemez ve arındıramaz.

Birincil NSPC'lerin yüzey işaretleyicilerinin tanımlanması üç ana engelle sınırlıdır. Bunlardan ilki dokudaki sınırlı hücre li sayıdır ve hücre yüzeyi protein örneklerini ortak kütle spektrometresi analizi için hazırlamayı zorlaştırır. İkinci sınırlama, alt tipe özgü membran protein verileri üretmek için saf hücre alt tiplerini üretmedeki zorlukdur. Son olarak, üçüncü zorluk, hücre yüzeyproteinlerinin tüm hücre proteinlerindeki düşük oranıdır, bu da kütle spektrometresi analizi ile algılama hassasiyetlerini engellemektedir.

Bu sorunların üstesinden gelmek için, siyonlycoproteinleri metabolik olarak etiketleyerek primer NSPC'lerde hücre yüzeyproteinlerini seçici olarak zenginleştirmek ve tanımlamak için kemoproteomik bir yaklaşım geliştirdik10. Yeterli sayıda NSPC oluşturmak için, permeable destek kullanarak fare beyin endotel hücre hatları ile birlikte nspcs birlikte tokuş ederek, in vitro farklılaşmamış devletlerde birincil embriyonik NSPCs genişletmek ve korumak için kurulmuş bir protokol yararlandı matris insert(örneğin, transwell) sistem11. Buna karşılık, ENDOTEL HÜCRELERI olmadan tek başına kültürlü NPSCs diferansiye döloluşturmak 11,12. Böylece, bu iki kültür sisteminden alınan protein örnekleri, NSPC'lerde ve farklılaştırılmış nöronlarda farklı olarak ifade edilen proteinleri tanımlamak için karşılaştırmalı olarak analiz edilebilir. Çoğu hücre yüzey proteinleri siyalik asit13tarafından modifiye edilir gibi , doğal olmayan siyalik asit öncüsü analog N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac4ManNAz) içsel metabolik yolu kaçırmak için kullanıldı böylece endojen, yeni sentezlenmiş siyaloglikanlar azido grupları ile etiketlenir, kimyasal sapı üreten14. Azido-alkyne aracılı biyoortogonoal reaksiyonlar sayesinde, hangi sialoglycans için biotin conjugate, hücre yüzey proteinleri görselleştirilmiş ve bir streptavidin-çiftli florofor veya matris14ile proteomik tanımlama için zenginleştirilmiş olabilir.

Burada, NSPCs yüzey sialoglycoproteome yüzey sialoglycoproteome boyama gerçekleştirmek bir endotel co-kültür ve olmayan bir co-kültür sisteminde hücreleri ayırt. Ayrıca proteomik karşılaştırma için iki kültür sisteminde yüzey siyaloglycoproteme'yi seçici olarak arındırıyoruz. Protokolümüz, geleneksel santrifüj tabanlı hücre yüzeyi saflaştırma protokolleri15ile karşılaştırıldığında, belirli etiket çekimi ve afinite ile yüzey protein çıkarma prosedürleriazaltarak ekstraksiyon etkinliğini artırır Arıtma. Bu arada, sialylation çoğunlukla hücre yüzeyi proteinleri olur öncül dayalı hücre yüzeyi proteinlerinin ekstraksiyon saflığı artırır. Endotel faktörleri genişletilmiş NSPC'lerin farklılaşmasını tamamen engelleyemese de, ortak kültür ve farklılaştırılmış kültür arasındaki karşılaştırmalı çalışma, kök hücre ile zenginleştirilmiş yüzey proteinlerini FACS16tarafından saflaştırılmış NPCs gelen proteinleri analiz. Bu yaklaşımın uygun modifikasyonlarla diğer sistemlerdeki yüzey proteinlerinin çalışmalarına uygulanabileceğine inanıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan protokolleri Tsinghua Üniversitesi IACUC (Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi) tarafından onaylanmış ve IACUC kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tsinghua Üniversitesi'ndeki laboratuvar hayvanı tesisi AAALAC (Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği) tarafından akredite edilmiştir. Embriyoların evrelemesinde, tanımlanan vajinal fişin orta sıembriyonik gün 0.5 (E0.5) olarak hesaplandı.

NOT: Tüm hücreler 37 °C ve %5 CO2koşullarında hücre kuluçka makinesinde kültürlenir.

1. Geçirilebilir Destek Uçlarında Fare Endotel Kültürünün Hazırlanması

NOT: BEND3 hücreleri üreticinin talimatlarına göre korunur.

  1. 500 mL DMEM içine 50 mL FBS ve 5 mL penisilin-streptomisin ekleyerek BEND3 hücre ortamını (BM) hazırlayın ve iyice karıştırın.
  2. Çanaktan orta yıkayın ve bir kez 1 mL PBS ile BEND3 hücre kültürünü yıkayın. Hücrelere %0,25 Tripsin-EDTA 1 mL ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 4 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. Hücreleri tamamen ayırmak için Tripsin-EDTA ve pipet yavaşça aşağı nötralize etmek için hücrelere BM 1 mL ekleyin. Hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mL konik tüpe ve 400 x g'de5 dk oda sıcaklığında (RT) santrifüj ile pelete aktarın.
  4. Tüpten süpernatant aspire ve taze BM 9 mL hücreleri yeniden askıya, sonra bir geçirgen destek eklemek içine hücre süspansiyon 1 mL ekleyin. Matrisin alt odasında her kuyu başına 2 mL daha taze BM ekleyin. Hücreleri bir gün kültüre almaya devam edin.

2. Mouse Primer Kortikal NSPCs Kültürünün Hazırlanması

  1. Kültür plakası hazırlanması, papain sindirim ortamı ve kortikal yapışık kültür ortamı (AM)
    1. 6 kuyulu plakalara 1 mL PLL çözeltisi ekleyerek poli-L-lizin (PLL) içeren 6 kuyulu plakalar. Daha sonra, 30 dakika boyunca RT plakaları kuluçkaya yatırın.
    2. PLL çözeltisini 15 mL konik bir tüpe aktarın. Tabakları 3 kez çift distile su ile yıkayın. Plakaları hava kurutun ve kullanıma kadar bir kenara koyun.
    3. 5 mL DMEM'e 50 U papain, 50 μL L-glutamin ve 50 00 mg/mL asetil-L-sistein ekleyerek papain sindirim ortamını hazırlayın. Orta ortamı kısa bir süre karıştırın ve enzim aktivasyonu için 30 dk boyunca 37 °C'ye ısıtın.
    4. Kortikal hücre yapışık kültür ortamını (AM) hazırlayın: 500 μL L-glutamin, 500 μL sodyum pirüuvat, 500 μL 100 mg/mL N-asetil-L-Sistein, 500 μL N2, B27'nin 1 mL'si ve 5 μL'si 100 μg/mL bFGF'yi 50 mM DML'ye ekleyin. Orta yı iyice karıştırın ve kullanmadan önce 37 °C'ye ısıtın.
  2. Primer serebral kortikal hücrelerin hazırlanması ve sonraki kaplama
    1. Servikal çıkış ile E10.5 zamanlı hamile fare kurban.
      NOT: E10.5'te, hücrelerin çoğunluğu serebral kortekste NSPC'ler çoğalır ve in vitro büyük döl klonları ortaya çıkar.
    2. Karın kısmını %75 etanol ile sterilize edin. Orta çizginin sağ tarafı boyunca deri ve altta yatan kas keserek karın açmak için ince makas ve mikro tırtıklı forceps kullanın. Tırtıklı forceps ile yavaşça karın boşluğundan rahim çıkarın ve ince makas ile karın boşluğundan kesip.
    3. 10 cm Petri kabında rahmi 40 mL önceden soğutulmuş HBSS ile yıkayın. Daha sonra rahmi 10 cm'lik yeni bir Petri kabına aktarın ve 40 mL önceden soğutulmuş HBSS ile tekrar yıkayın.
    4. Rahmi 40 mL önceden soğutulmuş HBSS ile 10 cm'lik yeni bir Petri kabına aktarın. Rahim ve amniyotik membran dan embriyolar çıkarın, sonra Kuyumcular microforceps ile gövdeleri kapalı embriyoların başlarını kesti.
    5. Kafaları 40 mL önceden soğutulmuş HBSS ile yıkayın ve kafaları 40 mL önceden soğutulmuş HBSS ile yeni bir 10 cm Petri kabına aktarın. Beyinleri kaplayan deri ve kıkırdağı soymak için Kuyumcular mikrokosepleri kullanın, sonra serebral korteksleri kesip önceden soğutulmuş HBSS ile 15 mL konik tüp içinde toplayın.
    6. 4 °C'de 3 dk ve 300 x g'dasantrifüj ile kortikasyonlar pelet. Tüpten supernatant aspire, sonra aktif papain sindirim orta ve 15 μL ekleyin 4 mg/mL DNase I doku pelet içine.
    7. Hafif girdap ile doku pelet kısa bir süre resuspend. 30 dk için 37 °C'de doku kuluçka. Bu süre zarfında, kısa girdap her 10 dakikada bir doku gevşetin.
      NOT: Sindirim sonunda, tüp hiçbir görünür doku parçaları olmalıdır.
    8. 4 °C ve 450 x g'da10 dk santrifüj ile kortikal hücreler pelet . Tüpten süpernatant aspire ve önceden soğutulmuş DMEM ile hücre pelet yıkayın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
      NOT: Sindirim ve yıkama sırasında, güçlü bir kesme kuvveti ile hücrelere zarar önlemek için dokular ve hücre pelet kabaca pipet değil dikkatli olun.
    9. Tüpten süpernatant aspire sonra tüp içine önceden soğutulmuş HBSS 1.5 mL ekleyin. Kortikal hücre peletini nazik pipetleme ile tek bir hücreye ayırın. Hemositometreli hücre numarasını say.
    10. 6-iyi plakalar içine iyi başına 2 mL ve 2 x 104 kortikal hücreleri ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'de hücreleri tabağa bağlamak için 3 saat kuluçkaya yatırın.

3. Nöral-endotel Ortak Kültür ve Ac4ManNAz Etiketleme Sisteminin Kurulumu

  1. Kesici uçlarda BEND3 hücrelerini kaplamadan bir gün sonra, önce alt odadaki ortayı, sonra kesici uçları hafifçe aspire edin. Önceden ısıtılmış DMEM ile kesici uçların yüzünü 3 kez yıkayın. Önceden ısıtılmış DMEM ile durulayarak kesici uçların dış yüzeyini yıkayın.
  2. Bir kesici uça önceden ısıtılmış 1 mL'lik ekleyin ve kesici uçları birincil kortikal hücrelerle kuyulara aktarın. Ortak kültürü 37 °C'de ve %5 CO2'de 12 saat kuluçkaya yatırın.
  3. 200 mM'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için Ac4ManNAz'ı DMSO'da çözün. Nöral-endotel ortak kültürünü kurduktan sonra 12 saat, alt oda başına 1 μL Ac4ManNAz stokve ko-kültüre kesici uç başına 0,5 μL stok ekleyin. Orta iyi karıştırmak için hemen ve yavaşça plakaları sallayın. Kontrol hücreleri için eşit miktarda DMSO ekleyin.
  4. Kültür 37 °C ve% 5 CO2başka bir 5 gün için hücreleri . AM'yi 10x bFGF ile yeniden besleme ortamı (RM) olarak hazırlayın. Bu süre zarfında, endotel ve sinir hücrelerini her gün beslemek için kesici uç başına 100 μL ve alt oda başına 200 μL RM ekleyin. Yeniden besleme sırasında, kültüre Ac4ManNAz veya DMSO sağlamayın.

4. Genişletilmiş Primer NSPC'lerde ve Diferansiye Nöronlarda Siyaloglycoproteinlerin İmmünofloresan Boyanışı

  1. BTTAA-CuSO4 kompleks 1 30x stok içeren 1.5 mM CuSO4 ve 9 mM BTTAA çift distile su hazırlayın. PBS'de 50 μM biotin-alkin, 2,5 mM sodyum askorbat ve 1x BTTAA-CuSO4 kompleksi içeren taze biotin konjuge tampon 1 hazırlayın.
  2. Eklerin ortak kültür plakalarından çıkarılmasını. Alt kuyulardan kültür ortamıaspire ve önceden ısıtılmış PBS ile bir kez nöral hücreleri yıkayın.
  3. PBS'yi kuyulardan aspire edin. Hücrelere her biri için %4 önceden soğutulmuş %4 paraformaldehit PBS çözeltisi ekleyin ve RT'deki hücreleri 10 dakika boyunca düzeltin. Daha sonra hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile 3 kez yıkayın.
  4. Kuyulardan PBS aspire ve hücrelere iyi iyi başına taze hazırlanmış biotin konjuge tampon 1 1 mL ekleyin. HÜCRELERI 10 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
  5. Kuyulardan reaksiyon tamponu aspire edin. Hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın. %1 FBS ve 1 μg/mL Alexa Fluor 647-streptavidin içeren boyama tamponu hazırlayın. Hücrelere iyi başına 1 mL boyama tampon ekleyin ve 30 dakika boyunca RT hücreleri kuluçka.
  6. Önceden soğutulmuş PBS ile kuyulardan ve yıkanmış hücrelerden 3 kez boyama tamponu aspire edin. PBS'de %5 BSA ve %0,3 non-iyonik deterjan-100 içeren engelleme tamponu hazırlayın. Hücrelere iyi başına 1 mL engelleme tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
  7. Anti-nestin ve anti-β-tubulin III antikorlarını sırasıyla 1:20 ve 1:1000 oranlarında bloke tamponu içine seyrelterek birincil antikor çözeltisi hazırlayın. Kuyulardan engelleme tamponu çıkarın ve hücrelere her kuyu başına 1 mL primer antikor çözeltisi ekleyin. Hücreleri bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  8. Ana antikor solüsyonu kuyulardan çıkarın. Önceden soğutulmuş PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın. Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG1, Alexa Fluor 546 keçi anti-fare IgG2b seyreltme ve DAPI birlikte 1:1.000 bir seyreltme tampon engelleme içine ikincil bir antikor çözeltisi hazırlayın. PBS'yi kuyulardan aspire edin ve hücrelere her kuyu başına 1 mL sekonder antikor çözeltisi ekleyin. HÜCRELERI 2 saat boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
  9. Kuyulardan antikor solüsyonu aspire ve önceden soğutulmuş PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın. Daha sonra, hücreler görüntü yakalama için hazırdır.

5. Genişletilmiş Primer NSPC'lerden ve Farklılaştırılmış Nöronlardan Sialoglycoproteinlerin Saflaştırılması

  1. BTTAA-CuSO4 kompleks 2 1.5 mM CuSO4 ve 3 mM BTTAA içeren çift distile suda hazırlayın. Protein resuspension tamponuna %4 SDS ve 10 mM EDTA içeren çift distile suda hazırlayın; protein resuspension tampon B içeren 150 mM NaCl, 50 mM trietanolamine, ve 1% polioksietilen oleyl eter (örneğin, Brij97) pH 7.4 ile çift distile su. Kullanmadan önce, tam protein resuspension tampon hazırlamak için arabellek A:tampon B = 1:8 (vol/vol) karıştırın. PBS'de %2 SDS içeren protein yıkama tamponu 1 hazırlayın; protein yıkama tamponu 2 içeren 8 M üre 250 mM amonyum bikarbonat (ABC); ve pbs 2.5 M NaCl içeren protein yıkama tampon 3.
  2. Eklerin ortak kültür plakalarından çıkarılmasını. Alt kuyulardan kültür ortamıaspire ve önceden soğutulmuş PBS ile bir kez nöral hücreleri yıkayın.
  3. PBS'yi kuyulardan aspire edin ve plakalara her kuyu başına 200 μL önceden soğutulmuş RIPA tamponu ekleyin. Plakaları 5 dk. 1,5 mL tüpler halinde protein lisisini toplayın. 4 °C'de 10 dk ve 12.000 x gsantrifüj ile hücre enkazPelet .
  4. Supernatant'ı yeni 1,5 mL tüplere aktarın. BCA kiti ile protein konsantrasyonu üreticinin talimatlarına göre belirleyin. Protein konsantrasyonu 1 mg/mL'ye ayarlayın.
  5. 100 μM alkine-biotin, 2,5 mM sodyum askorbat ve 1x BTTAA-CuSO4 kompleks 2 ila 1 mL protein lisyonu ekleyin ve çözeltiyi iyice karıştırın. Karışımı RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  6. Reaksiyon çözeltisini 50 mL konik bir tüpte önceden soğutulmuş metanolün 20 mL'sine aktarın. Proteinleri çökeltmek için bir gecede -30 °C'de iyice karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
  7. Pelet protein 4 °C ve 4.500 x g15 dakika için santrifüj ile çökelti . Protein peletini 20 mL önceden soğutulmuş metanol ile iki kez yıkayın. Tüpten süpernatant aspire. Protein peletini 4 mL protein resuspension tamponu ile yeniden askıya alın ve protein süspansiyonu yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın.
  8. Streptavidin boncuk50 μL alın ve PBS ile 3 kez yıkayın. Yıkanmış boncukları protein süspansiyonuna ekleyin. Çözeltiyi 4 °C'de, dikey bir rotatörde 20 rpm dönüş hızında 3 saat eve inküler.
  9. Boncukları 6 çeşit tamponla sırayla yıkayın: protein yıkama tamponu 1, protein yıkama tamponu 2, protein yıkama tamponu 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC ve 0,05 M ABC.
  10. Yıkadıktan sonra boncukları 20 μL PBS ile yeniden askıya alın ve boncukları 1,5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. Boncukların içine 20 μL 2x protein yükleme tamponu ekleyin ve 95 °C'de 10 dakika tedavi edin. Protein örnekleri daha sonra SDS-PAGE tabi ve coomassie parlak mavi R-250 üreticinin talimatlarına göre lekeli olmalıdır. Kütle spektrometresi analizi için Coomassie parlak mavi R-250 tarafından belirtildiği gibi jel proteinleri kesin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer embriyonik NSPC'lerin in vitro genleşme ve metabolik etiketleme için tüm prosedür 6 gün sürer(Şekil 1A). BEND3 hücre hattının kalitesi ve yeni izole edilmiş birincil NSPC'ler başarılı bir deneyin anahtarıdır. BEND3 hücreleri, NSPC'lerin kendini yenilemesini ve çoğalmasını teşvik eden çözünür faktörlerin kaynağıdır. Bu BEND3 hücreleri herhangi bir kontaminasyon ücretsiz ve nöral hücrelerle co-culturing önce minimal hücre ölümü ile aktif olarak bölmek em...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüzey işaretleri genellikle etiket ve in vitro ve in vivo17,18belirli hücre tipleri arındırmak için kullanılır. Yüzey belirteçlerinin keşfi, bir kök hücre popülasyonunun normal veya patolojik dokulardan ve kültür yemeklerinden seçici olarak zenginleştirilen moleküler araçlar sağlayarak, arınmış bir hücre sunarak yenileyici tıp ve kök hücre araştırmalarına büyük katkıda bulunur. biyolojik özelliklerin klinik kullanımı veya incelenmesi için kaynak. Ancak, nöral kök...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa atacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1B, 1C, 1E ve 1F Bai'den üretilir ve ark . 10.000 Kraliyet Kimya Derneği'nin izniyle. X.C.'nin laboratuvarındaki Yi Hao'ya figür düzenlemesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 91753206 Q. S. ve X. C., No. 31371093 Q. S. ve No. 21425204 ve 21672013 x. C.) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BEND3ATCCCRL-229
DMEMGibco11960044
L-glutaminGibco25030081%1
Sodyum piruvatSigmaP5280%1
N2 takviyesiGibco175020481 ila 100
N-asetil-L-sisteinSigmaA72501 mM
PapainWorthingtonLS00372610 U/mL
B27 takviyesiGibco175040441 ila 50
Poli-L-lizinSigmaP4707
Temel Fibroblast büyüme faktörüGibcoPHG026110 ng/mL
Penisilin-StreptomisinGibco15140122%1
Fetal sığır serumuGibco10099141%10
HBSSGibco14175095
Tripsin-EDTA, %0.25Gibco25200056
DPBSGibco14190094
TranswellCorning3450
ParaformaldehitSigma158127%4
SükrozSangonA100335
DAPIGibco62248
RIPA tamponuThermo Scientific89900
SDS-PAGE yükleme tamponu 2xSolarbioP1018
6 oyuklu plakaCorning3335
Tris-Glisin protein jeliinvitrojenxp00100box
Fare monoklonal anti-NestinGelişimsel Çalışma Hibridoma BankasıSıçan-4011 ila 20
Fare monoklonal anti-beta-tubulin IIISigmaT88601 ila 1.000
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG1invitrogenA-211211 ila 1.000
Alexa Fluor 546 keçi anti-fare IgG2binvitrojenA-211431 ila 1.000
Albumin Bovine VAmresco0332
Triton X-100Amresco0694
BCA tahlil kitiThermo Scientific23225
Dimetil sülfoksitSigmaD2650
Brij97AladdinB129088
CuSO4Sigma209198
Alkin-biyotinTıklama Kimyası AraçlarıTA105
BTTAATıklama Kimyası Araçları1236
Ac4ManNAzClick Kimya Araçları1084100 & Laboratuvarda
sentezlenen9AzSia
Sodyum askorbatSigmaA4034
MetanolSigma34860
EDTASangonA100322
NaClSangonA100241
SDSSangonA100227
Alexa Unu 647-konjuge streptavidininvitrojenS213741 ila 1.000
TrietanolaminSigmaV900257
Dynabeads M-280 Streptavidin invitrogen60210
Amonyum bikarbonatSigma9830
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Scientific20278
IsofluranRWD Life Science Co.970-00026-00
DNase ISigmaDN2512 & mikro; g/mL
ÜreSigmaU5378
M

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365(2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N ral K k H crelerSialoglikan AnaliziEndotelyal Ko k lt rAzidosheker EtiketlemeBiyotin KonjugasyonuK tle SpektrometrisiY zey Belirteci Tan mlamaH cre Y zeyi Proteomu

İlgili makaleler