Burada, MCPyV ile birincil insan dermal fibroblast bulaştırmak için bir protokol mevcut. Protokol dermal fibroblastlar izolasyonu, MCPyV virions, virüs enfeksiyonu, ayirt boyama ve floresan hazırlanması in situ hibridizasyon içerir. Bu iletişim kuralı tarafından MCPyV MCPyV ana bilgisayar etkileşimleri karakterize ve diğer hücre tipleri infectable keşfetmek için genişletilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Merkel Hücresi Polyomavirus enfeksiyon ve algılama
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Merkel hücre polyomavirus (MCPyV) enfeksiyon Merkel Hücresi Karsinomu (MCC), cilt kanseri son derece saldırgan bir tür için yol açabilir. MCPyV moleküler biyoloji ve oncogenic mekanizmaları tam olarak araştırmak için mekanik çalışmaları yeterli hücre kültür modellerin eksikliği tarafından engel olmuştur. Burada, biz gerçekleştirmek ve birincil insan deri hücrelerinin MCPyV enfeksiyon tespit iletişim kuralları kümesi tanımlamak. İletişim kuralları insan dermal fibroblastlar, izolasyonu rekombinant MCPyV virions hazırlanması ve virüs enfeksiyonu tespiti immünfloresan (Eğer) boyama ve in situ olarak DNA hibridizasyon son derece hassas olan zincirleme (HCR), tarafından tarif floresans in situ hibridizasyon (balık) yaklaşım. İletişim kuralları burada baktılar araştırmacılar tarafından diğer hücre tipleri veya MCPyV enfeksiyon destek hücre satırları tanımlamak için adapte edilebilir. Tarif Balık yaklaşım da viral DNA'lar enfekte insan deride mevcut seviyesinin düşük algılamak için adapte.
Giriş
Merkel hücre polyomavirus (MCPyV) küçük, Çift iplikçikli DNA virüsü bir nadir ama sert cilt kanseri, Merkel Hücresi Karsinomu (mm)1,2ilişkilendirilmiş olduğunu. MM, yaklaşık % 33, ölüm oranı Melanom3,4süresini aşıyor. MCPyV ~ 5 kb1,5 erken ve geç bölgeler1kodlama içine bir kodlama-düzenleyici bölgeye göre (NCRR) böldüğü dairesel genom vardır. NCRR çoğaltma (Ori) ve çift yönlü Rehberleri viral transkripsiyon6,7içi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan yenidoğan foreskins Penn cilt hastalığı araştırma Merkezi'nden elde edilmiştir. Yetişkin insan fibroblast ameliyattan sonra atılan normal deriden elde edilmiştir. Tüm iletişim kuralları University of Pennsylvania Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi.
1. insan dermal fibroblastlar yalıtım
- İnsan yenidoğan sünnet derisi yağ ve subkutan doku kapalı trim ve yarım veya çeyrek deri örneği kesmek için bir makas kullanın.
- 5 mL 10 mg/mL dispase antibiyotik-antimycotic ile desteklenmiş PBS II de dokusunda kuluçkaya 4 ° C'de bir gecede.
- Bir steril 10 cm tabak içinde epidermis dermal katman mikrodis....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu el yazması açıklanan protokol yalıtım HDFs (Şekil 1) neredeyse homojen bir nüfusun izin. İmmünfloresan boyama tarafından gösterildiği gibi neredeyse % 100 insan deri hücreleri izole bu iletişim kuralında tanımlanan koşullara olumlu kullandığınız lekeli dermal fibroblast işaretleri, vimentin ve kollajen için ben24, ama insan için olumsuz sünnet derisi keratinosit marker K14 (Şekil 1).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İnsan cilt dokusundan dermal fibroblastlar yalıtım, rekombinant MCPyV virions hazırlanması, enfeksiyon kültürlü hücreleri, immünfloresan boyama ve HCR teknolojisinden adapte hassas bir balık yöntemi de dahil olmak üzere yukarıda açıklanan yöntemleri hangi Araştırmacılar MCPyV enfeksiyon27analiz etmek etkinleştirmeniz gerekir. MCPyV enfeksiyon tüp bebek ulaşmada en önemli adımlardan biri yüksek titresi virion hazırlıklar yapımıdır. İstimal belgili tanımlık protokol için burada açıklanan rekombinant.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Enstitüsü) ve Dr. M. Celeste Simon (Pennsylvania Üniversitesi) reaktifler ve teknik destek sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Laboratuarlarımızda yararlı tartışma için üyeleri ayrıca teşekkür ederiz. Bu eser ulusal kurumları sağlık (NIH) hibe (R01CA187718, R01CA148768 ve R01CA142723), ncı Kanser Merkezi Destek Grant (ncı P30 CA016520) ve Penn CFAR Ödülü (P30 AI 045008) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fetal buzağı serumu | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamin |
| DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| %0.05 Tripsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 orta | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Rekombinant İnsan EGF Proteini, CF | R& D sistemleri | 236-EG-200 | -80 santigrat derecede saklayın |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | -80 santigrat derecede saklayın |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | -80 santigrat derecede saklayın |
| Kollajenaz tip IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiyotik-Antimikotik | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Işıktan koruyun |
| DMEM ortamı | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Işıktan koruyun |
| Alexa Fluor 488 keçi tavşan önleyici IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Işıktan koruyun |
| OptiPrep Yoğunluk Gradyan Ortamı | Sigma | D1556 | Işıktan koruyun |
| Paraformaldehit | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 tavşan | Tavşan poliklonal serum # 10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Higromisin | Roche | 10843555001 | |
| Temel Fibroblast Büyüme Faktörleri (bFGF), İnsan Rekombinant | Corning | 354060 | -80 santigrat derecede saklayın |
| Benzonaz | Nükleaz Sigma | E8263 | |
| Plazmid Güvenli ATP'ye Bağımlı DNaz | EPICENTRE | E3101K | |
| Prob hibridizasyon tamponu | Moleküler teknolojiler | ||
| Prob yıkama tamponu | Moleküler teknolojiler | ||
| Amplifikasyon tamponu | Moleküler teknolojiler | ||
| Alexa 594 etiketli saç tokaları | Moleküler teknolojiler | B4 | Işıktan koruyun |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reaktifi | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Tampon PB | Qiagen | 19066 | |
| mavi miniprep döndürme sütunu | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Konik Santrifüj Tüpleri | Corning | 352070 | |
| T4 ligaz | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
Kaynaklar
- Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
