Yöntem makalesi

Merkel Hücresi Polyomavirus enfeksiyon ve algılama

DOI:

10.3791/58950

⸱

7 Şubat 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, MCPyV ile birincil insan dermal fibroblast bulaştırmak için bir protokol mevcut. Protokol dermal fibroblastlar izolasyonu, MCPyV virions, virüs enfeksiyonu, ayirt boyama ve floresan hazırlanması in situ hibridizasyon içerir. Bu iletişim kuralı tarafından MCPyV MCPyV ana bilgisayar etkileşimleri karakterize ve diğer hücre tipleri infectable keşfetmek için genişletilebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkel hücre polyomavirus (MCPyV) enfeksiyon Merkel Hücresi Karsinomu (MCC), cilt kanseri son derece saldırgan bir tür için yol açabilir. MCPyV moleküler biyoloji ve oncogenic mekanizmaları tam olarak araştırmak için mekanik çalışmaları yeterli hücre kültür modellerin eksikliği tarafından engel olmuştur. Burada, biz gerçekleştirmek ve birincil insan deri hücrelerinin MCPyV enfeksiyon tespit iletişim kuralları kümesi tanımlamak. İletişim kuralları insan dermal fibroblastlar, izolasyonu rekombinant MCPyV virions hazırlanması ve virüs enfeksiyonu tespiti immünfloresan (Eğer) boyama ve in situ olarak DNA hibridizasyon son derece hassas olan zincirleme (HCR), tarafından tarif floresans in situ hibridizasyon (balık) yaklaşım. İletişim kuralları burada baktılar araştırmacılar tarafından diğer hücre tipleri veya MCPyV enfeksiyon destek hücre satırları tanımlamak için adapte edilebilir. Tarif Balık yaklaşım da viral DNA'lar enfekte insan deride mevcut seviyesinin düşük algılamak için adapte.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkel hücre polyomavirus (MCPyV) küçük, Çift iplikçikli DNA virüsü bir nadir ama sert cilt kanseri, Merkel Hücresi Karsinomu (mm)1,2ilişkilendirilmiş olduğunu. MM, yaklaşık % 33, ölüm oranı Melanom3,4süresini aşıyor. MCPyV ~ 5 kb1,5 erken ve geç bölgeler1kodlama içine bir kodlama-düzenleyici bölgeye göre (NCRR) böldüğü dairesel genom vardır. NCRR çoğaltma (Ori) ve çift yönlü Rehberleri viral transkripsiyon6,7için viral kökenli içerir. Erken bölge büyük T (LT), küçük T (sT), 57kT, alternatif LT ORF (ALTO) yanı sıra autoregulatory miRNA1,8,9,10denilen tümör antijen protein kodlayan. Geç bölge kapsid protein VP1 ve VP211,12,13kodlar. LT ve sT en çok çalışılan MCPyV proteinler ve viral DNA ikileşmesi ve MCPyV kaynaklı tumorigenesis5desteklemek için göstermiştir. Klonal entegrasyon MCCs ilâ % 80 gözlenmiştir, ana bilgisayar genom MCPyV DNA'ın olası virüs-pozitif tümör geliştirme14,15nedensel bir faktördür.

MM insidansı üzerinde son yirmi yıl16kat arttı. Asemptomatik MCPyV enfeksiyon genel nüfus17,18,19' da yaygındır. MM tanılar sayısının artması ve MCPyV enfeksiyon yüksek yaygınlığı ile virüs ve oncogenic bir potansiyel anlayışımızı geliştirmek için gerek yoktur. Ancak, MCPyV biyoloji ve oncogenic mekanizmaları birçok açıdan kötü anlaşılan20kalır. Büyük ölçüde MCPyV kötü içinde kurulan hücre satırlar11,12,21,22,23 çoğaltır ve yakın zamana kadar MCPyV destekleme kapasitesine sahip hücreleri cilt, bunun nedeni enfeksiyon keşfedilen22olmasaydı. Tam olarak MCPyV ve konak hücreleri ile etkileşimi araştırmak için mekanik çalışmaları5virüs yayma için hücre kültür sistemi eksikliği ile engel olmuştur.

Biz birincil insan dermal fibroblastlar (HDFs) her iki vitro yenidoğan insan sünnet destek sağlam MCPyV enfeksiyondan izole keşfetti ve ex vivo24. Bu çalışmada, ilk hücre kültür enfeksiyon modeli MCPyV24için kurduk. Bu modeli sistemde bina, matriks metalloproteinaz (MMP) genler tarafından WNT/β-catenin yolu ve diğer büyüme faktörleri sinyal indüksiyon MCPyV enfeksiyon uyarır gösterdi. Ayrıca, FDA onaylı MEK antagonisti trametinib etkili MCPyV enfeksiyon5,25engeller bulduk. Bu çalışmalardan da insan dermal fibroblastlar24,25, izole için iletişim kuralları kümesi MCPyV virions11,12, MCPyV enfeksiyon üzerinde insan dermal fibroblastlar performans hazırlama kurduk 24 , 25 ve algılama MCPyV proteinler tarafından Eğer boyama26. Buna ek olarak, enfekte insan deri hücrelerinde MCPyV DNA'sı tespit için son derece hassas bir balık tekniği (HCR-DNA balık) geliştirmek için yerinde DNA hibridizasyon zincirleme reaksiyon (HCR) teknoloji27 uyarlanmış. Yeni yöntemlerin MCPyV hem de hücresel yanıt MCPyV enfeksiyon bulaşıcı döngüsü eğitimi için faydalı olacaktır. MCPyV enfeksiyon korumak doğal ana depo hücreleri ve mm tümörü ortaya çıkmasına hücreleri bilinmeyen kalır. Biz bu el yazması tarif teknikleri hem rezervuar hücreleri tanımlamak için insan hücreleri türleri ve MCC tümörler kökeni incelemek için uygulanabilir. HCR-DNA balık gibi bizim kurulan yöntemleri de diğer DNA tümör virüs tespiti ve konak hücre etkileşimleri karakterizasyonu istihdam olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan yenidoğan foreskins Penn cilt hastalığı araştırma Merkezi'nden elde edilmiştir. Yetişkin insan fibroblast ameliyattan sonra atılan normal deriden elde edilmiştir. Tüm iletişim kuralları University of Pennsylvania Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi.

1. insan dermal fibroblastlar yalıtım

  1. İnsan yenidoğan sünnet derisi yağ ve subkutan doku kapalı trim ve yarım veya çeyrek deri örneği kesmek için bir makas kullanın.
  2. 5 mL 10 mg/mL dispase antibiyotik-antimycotic ile desteklenmiş PBS II de dokusunda kuluçkaya 4 ° C'de bir gecede.
  3. Bir steril 10 cm tabak içinde epidermis dermal katman mikrodiseksiyon forseps kullanarak dikkatlice ayırın.
  4. Transfer elde edilen deri dokusu ile 5 mL 2 mg/mL collagenase de içeren bir 15 mL konik tüp içinde FBS içermeyen çevre antibiyotik-antimycotic ile desteklenmiş IV yazın.
  5. Sadece bir kaç makroskopik doku agrega kalıncaya kadar % 5 CO2 için 4-6 periyodik sallayarak ile h 37 ° C'de örnek kuluçkaya.
  6. Dermis tek hücrelerden (triturating yukarı ve aşağı) şiddetle on kat 10 mL pipet ile pipetting tarafından yayın.
  7. 180 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  8. DMEM orta % 10 fetal buzağı serum, % 1 esansiyel olmayan amino asitler ve % 1 ile desteklenmiş Disosiye hücrelerde plaka L-glutamin 37 ° c % 5 CO2.

2. rekombinant MCPyV virion hazırlık

  1. Özet 50 µg 250 ile pR17b plazmid (MCPyV genom taşıyan), U, BamHI-HF 200 µL birimindeki (4 h 37 ° C'de) viral genom vektör omurga (Şekil 2) ayırmak için.
  2. Arabellek PB (3 M NaAc, pH 5.2 10 µL ile desteklenmiş) 1200 µL sindirilir DNA ekleyin ve 2 miniprep spin sütunları (20 µg DNA kapasite) arındırmak. 200 µL TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA) ile her sütundan sindirilmiş pR17b plazmid elute.
  3. 50 mL santrifüj tüp ligasyonu tepki hazırlayın. Arıtılmış plazmid DNA 400 µL adımından 2.2, 8,6 mL 1.05 x T4 ligaz arabelleği ve yüksek konsantrasyon T4 ligaz 6 µL ekleyin. 16 ° C'de gecede kuluçkaya.
  4. Arabellek PB (3 M NaAc, pH 5.2 10 µL ile desteklenmiş) 45 mL için ligasyonu ekleyin ve bir vakum manifoldu 2 miniprep spin sütunları ile yüklemek için kullanın. Her sütun 50 µL TE arabelleği ile elute. DNA'ın yaklaşık 30 µg verimini bekliyoruz.
  5. Geç öğleden sonra/akşam, tohum 6 x 106 293TT28 hücrelere 10 cm % 10 fetal buzağı serum, % 1 esansiyel olmayan amino asitler ve % 1 ile desteklenmiş içeren DMEM orta çanağı L-glutamin hygromycin B. olmadan
  6. Ertesi sabah, hücreleri yaklaşık % 50 olması konfluent. 66 µL transfection reaktif (1.1 µL/cm2) kullanarak transfect, yeniden ve birleştirilmiş MCPyV 12 µg adımından 2.4, ST ifade plazmid pMtB 8.4 µg ve LT ifade plazmid pADL *299,6 µg R17b DNA izole.
  7. Transfected hücreleri ertesi gün neredeyse konfluent olduğunda hücreleri trypsinize ve sürekli genişleme için 15 cm çanak aktarmak.
  8. İsteğe bağlı olarak 293TT hücreleri üzerine genişleme az sayıda almak ve MCPyV LT (CM2B4) için boyama Eğer gerçekleştirmek ve VP1 (transfection verimliliği belirlemek için MCV VP1 tavşan30). Bu aşamada, nükleer LT sinyal görünür olabilir ama VP1 ifade muhtemelen tespit olmayacaktır.
  9. Ne zaman 15 cm çanak olur neredeyse birleşmesi (genellikle 5-6 gün sonra ilk transfection), aktarım hücreleri üç 15 cm yemekleri. Onlar neredeyse konfluent haline ve virüs hasat iletişim kuralı aşağıdaki takip 15 cm yemekleri hücrelerden hasat.
    Not: İsteğe bağlı olarak açıklandığı gibi Eğer adım 2.8 kalite kontrol gerçekleştirin. Hücrelerin çoğu MCPyV LT ve VP1 bu aşamada olumlu olmalıdır.
  10. Virüs hasat için hücreleri trypsinize, 180 x g RT, 5 min için de spin ve süpernatant kaldırın. Bir hücre Pelet birim DPBS-mg (9,5 mM MgCl2 ve 1 x antibiyotik antimycotic ile DPBS) ekleyin. Sonra 25 mM amonyum sülfat (üzerinden bir 1 M pH 9 hisse senedi çözüm) (a % 10 hisse senedi eriyik--dan), Triton X-100 %0,5 tarafından takip ekleyin ve bir ATP-bağımlı DNaz %0,1 %0.1 Benzonase. Mix iyi ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
  11. Buz üzerinde 15 dakika karışımı kuluçkaya ve 5 M NaCl 0,17 hacmi ekleyin. Mix ve başka bir 15 dakika Spin 12.000 x g 4 ° C santrifüj de 10 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya. Süpernatant belli değilse, yavaşça tüp ters çevir ve iplik adımı yineleyin. Süpernatant için yeni bir tüp aktarın.
  12. 2.11. adımda açıklandığı gibi bir 0.8 M NaCl ve spin ile tekrar takıma DPBS hacmi kullanarak Pelet resuspend.
  13. Adım 2,11 ve 2.12 supernatants birleştirmek ve 2.11 adımda anlatıldığı gibi bir kez daha spin.
  14. İodixanol degradeler ince duvar 5 mL polyallomer tüplerde (% 27, sonra % 33, sonra % 39) underlaying tarafından dökün ~0.7 mL adımları 3 mL şırınga kullanarak uzun iğne veya p1000 pipet ile donatılmış.
  15. Hazır iodixanol degradenin üzerinde eritilmiş virüs içeren süpernatant 3 mL yükleyin.
  16. 3.5 h 234,000 x g de ve 16 ° C SW55ti Open End için spin. Hızlanma ve yavaşlama yavaşlatmak için ayarlayın.
  17. Ultrasantrifüj sonra silikonlu tüpler (her kesir ~ 400 µL olan) 12 kesirleri toplamak.
  18. Virüs'ün kesirler dsDNA reaktif ve/veya VP1 için Western blot tarafından analiz (MCV VP1 tavşan30). Havuzu degrade kesirler tepe dsDNA ve/veya VP1 ile içerik ve hisse senedi viral genom eşdeğer31hesaplamak için kantitatif PCR ile karakterize. MCPyV virion hisse senedi-80 ° C'de depolayın

3. enfeksiyon

  1. Birincil insan dermal fibroblastlar DMEM içinde % %1 10 fetal buzağı serum, % 1 esansiyel olmayan amino asitler ile korumak L-glutamin. İzdiham ulaştıktan sonra iplik aşağı olmadan fibroblast 1:4 Böl.
    Not: birincil fibroblastlar pasajlar 5 ve kaplama anda aktif bölme 12 arasında en yüksek MCPyV enfeksiyon verimlilik için kullanın.
  2. İnsan dermal fibroblastlar bulaştırmak için orta Aspire edin ve DPBS hücrelerle yıkayın.
  3. 1 mL % 0.05 ekleyin tripsin-EDTA çanak ve 5-10dk için 37 ° C'de kuluçkaya.
  4. Hücreleri çanak geliyor emin olmak için mikroskop altında kontrol edin.
  5. DMEM/F12 orta 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF ve 3 µM içeren 10 mL ekleyin CHIR99021, tüm bunların MCPyV enfeksiyon24, çanak için teşvik ve hücre çözümü 15 mL tüp içine aktarın.
  6. Spin aşağı 180 x g 2 min için hücreleri ve süpernatant atın. DMEM/F12 orta 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF ve 3µM içeren hücrelerde resuspend CHIR99021 2-4 mL başına 104 hücre x.
  7. 1 mg/mL collagenase tip bir 96-şey plaka ile IV her kuyuya takıma hücre süspansiyon 200 µL tohum. MCPyV virion hisse senedi üzerinde buz çözme. 109 viral genom karşılıkları MCPyV virions iodixanol bulaşması her 2500-5000 hücreler için 1 µL (içinde hesaplanan adım 2.18) ekleyin.   Yan plaka hafifçe dokunun ve plaka da kuluçka makinesine koyun.
  8. 48-72 saat için % 5 CO2 37 ° C'de kuluçka sonra % 20 eklemek FBS her şey için.
  9. Enfeksiyon % 5 CO2 72-96 h 37 ° C'de devam etmek izin verir.

4. immünfloresan boyama

  1. 20 dk için PBS içinde % 3 paraformaldehyde ile 3.9. adımda elde hücreleri tamir.
  2. PBS hücrelerle iki kez yıkayın.
  3. Engelleme/permeabilization arabellek hücrelerde kuluçkaya (% 0.5 Triton X-100, PBS % 3 BSA filtre 0,22 µm filtreden), RT 1 h için.
  4. Aşağıdaki birincil antikorlar hücrelerle kuluçkaya: fare monoklonal anti-MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) ve 3 h için RT, tavşan poliklonal anti-MCPyV VP1 antikor (1:2000).
  5. PBS hücrelerle üç kez yıkayın.
  6. İkincil antikorlar hücrelerle kuluçkaya: Fluor 594 keçi Anti-fare IgG (1: 1000) ve Fluor 488 keçi Anti-tavşan IgG (1:500) RT, 1 h için.
  7. PBS hücrelerle üç kez yıkayın.
  8. Hücreleri 0,5 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) ile counterstain.
  9. Mount coverslips camına slaytlar ve bir ters floresan mikroskop kullanarak çözümleyebilirsiniz.

5. In situ DNA-HCR

Not: Bu teknik hücreleri üzerinde coverslips numaralı seribaşı gerekir. Bu amaç için (adım 3) açıklanan enfeksiyon koşulları 24-şey plaka biçimine ölçekli.

  1. Hücreleri tamir kültürlü coverslips % 4 ile üzerinde iki kez PBS ile 10 dk. yıkama coverslips için PBS PFA sonra tedavi onları % 70 etanol ile gecede 4 ° C'de hücreler permeabilize.
    Not: Sabit örnekleri birkaç gün için bu durumda kalabilir.
  2. Melezlemek örnekleri etanol ile sonda hibridizasyon tampon değiştirme ve 60 dk RT. az için kuluçka tarafından önceden
  3. Probe(s) (1 µM) seyreltik (Tablo 1) prob hibridizasyon içinde 1:500 seyreltme 30 dk öncesi hibridizasyon adım sonu önce tampon çözüm ve 45 ° C'de kuluçkaya
  4. İncubations sonunda, ~ 10 μL seyreltilmiş sonda karıştırın coverslip mikroskop slaytlarda başına pipet. Yer coverslips, hücre tarafı aşağı, hibridizasyon sonda onların anılan sıraya göre damlacıkları üzerinde karıştırın. Kenarları ve coverslips ermesinin kauçuk çimento liberal miktarda slaytlara kapatın.
  5. Slaytları slaytlar bir ısı blok düz tarafında ayarlayarak 94 ° C'de 3 min için eklenen probları ile ısı. Slaytları oksijen odasına aktarmak ve 45 ° C'de gecede kuluçkaya. Basit bir oksijen odası yapmak için hafifçe steril kağıt havlu dH2O ve lastik conta ile mühürler bir plastik kap dibinde yer ile nemlendirin.
    Not: kısaca kauçuk çimento Isıtma sırasında kabarcık. Ancak, değil mührü emin olun.
  6. Dikkatle kauçuk çimento forseps ile peel away ve coverslips hücre tarafa geri 24-şey plaka kuyu yerleştirin. Sonda yıkama arabelleği ile coverslips RT üç kez yıkayın.
  7. Coverslip RT, amplifikasyon arabelleği (24-şey tabak içinde 200 µL) kuluçkaya 30-60 dakika.
  8. Bu arada, her biri ayrı PCR tüpler (Tablo 1) probları Isıtma için 90 94 ° c tarafından kabul ederek iki etiketli oligonükleotid tokalar tavlama s ve ışıktan koruyarak için 30 dk RT için soğutma. Amplifikasyon arabelleği, her bir seyreltme 1:50 at iki saç tokaları karıştırın.
  9. Bir yüzey güçlendirme reaksiyon için 24-şey plaka kapak açık yüz parafin film yayarak olun. Saç tokası/amplifikasyon arabellek karışımı parafin filmin her coverslip için 50-100 µL damlacıkları pipette. Forseps dikkatle coverslips öncesi amplifikasyon çözümden kaldırmak için kullanın. Coverslip gözenekli tek kullanımlık mendil kenarına dokunarak kuru ve hücre tarafı amplifikasyon damlacık yerleştirin.
  10. Coverslips oksijen odasına tutan plaka kapak yerleştirin ve gece karanlıkta RT kuluçkaya.
  11. Coverslips kuyu için bir kez daha geri. 5 örnekleriyle kuluçkaya x SSCT [5 Sodyum Klorür sodyum sitrat (SSC) %0.1 ara 20 filtre 0,22 µm filtreden x] 0,5 µg/mL DAPI RT. 1 h için içeren örnekleri 5 ile iki kez yıkayın RT., x SSCT
  12. Coverslips mikroskop slaytlarda bağlayın. Hücreler çözümlemenize ve bir ters floresan mikroskop kullanarak örnekleri resim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması açıklanan protokol yalıtım HDFs (Şekil 1) neredeyse homojen bir nüfusun izin. İmmünfloresan boyama tarafından gösterildiği gibi neredeyse % 100 insan deri hücreleri izole bu iletişim kuralında tanımlanan koşullara olumlu kullandığınız lekeli dermal fibroblast işaretleri, vimentin ve kollajen için ben24, ama insan için olumsuz sünnet derisi keratinosit marker K14 (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan cilt dokusundan dermal fibroblastlar yalıtım, rekombinant MCPyV virions hazırlanması, enfeksiyon kültürlü hücreleri, immünfloresan boyama ve HCR teknolojisinden adapte hassas bir balık yöntemi de dahil olmak üzere yukarıda açıklanan yöntemleri hangi Araştırmacılar MCPyV enfeksiyon27analiz etmek etkinleştirmeniz gerekir. MCPyV enfeksiyon tüp bebek ulaşmada en önemli adımlardan biri yüksek titresi virion hazırlıklar yapımıdır. İstimal belgili tanımlık protokol için burada açıklanan rekombinant...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Enstitüsü) ve Dr. M. Celeste Simon (Pennsylvania Üniversitesi) reaktifler ve teknik destek sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Laboratuarlarımızda yararlı tartışma için üyeleri ayrıca teşekkür ederiz. Bu eser ulusal kurumları sağlık (NIH) hibe (R01CA187718, R01CA148768 ve R01CA142723), ncı Kanser Merkezi Destek Grant (ncı P30 CA016520) ve Penn CFAR Ödülü (P30 AI 045008) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fetal buzağı serumuHyCloneSH30071.03
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamin
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokThermo Fisher Scientific14190136
%0.05 Tripsin-EDTATermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 ortaThermo Fisher Scientific11330-032
Rekombinant İnsan EGF Proteini, CFR& D sistemleri236-EG-200-80 santigrat derecede saklayın
CHIR99021Cayman Chemical13122-80 santigrat derecede saklayın
CHIR99021SigmaSML1046-80 santigrat derecede saklayın
Kollajenaz tip IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiyotik-AntimikotikThermo Fisher Scientific15240-062Işıktan koruyun
DMEM ortamıThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgGThermo Fisher ScientificA11032Işıktan koruyun
Alexa Fluor 488 keçi tavşan önleyici IgGThermo Fisher ScientificA11034Işıktan koruyun
OptiPrep Yoğunluk Gradyan OrtamıSigmaD1556Işıktan koruyun
ParaformaldehitSigmaP6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Lot # B2717
MCV VP1 tavşanTavşan poliklonal serum # 10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HigromisinRoche10843555001
Temel Fibroblast Büyüme Faktörleri (bFGF), İnsan RekombinantCorning354060-80 santigrat derecede saklayın
BenzonazNükleaz SigmaE8263
Plazmid Güvenli ATP'ye Bağımlı DNazEPICENTREE3101K
Prob hibridizasyon tamponuMoleküler teknolojiler
Prob yıkama tamponuMoleküler teknolojiler
Amplifikasyon tamponuMoleküler teknolojiler
Alexa 594 etiketli saç tokalarıMoleküler teknolojilerB4Işıktan koruyun
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReaktifiThermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Tampon PBQiagen19066
mavi miniprep döndürme sütunuQiagen27104
50mL Konik Santrifüj TüpleriCorning352070
T4 ligazNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974(2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161(2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181(2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558(2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499(2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468(2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112(2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nsan Dermal FibroblastlarVir s zolasyonumm nofloresan BoyamaIn Situ HibridizasyonViral DNA TespitiH cre K lt r ModeliViral Protein EkspresyonuFloresan MikroskopiVir s Konsantrasyonu

İlgili makaleler