Yöntem makalesi

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

DOI:

10.3791/59071

⸱

4 Ağustos 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan dört protokolleri oluşturmak ve mayalı Saccharomyces cerevisiae muhabiri suşları insan p53 Transaktivasyon potansiyeli, çeşitli kanserle ilişkili mutasyonlar etkileri, ortak ifade etkileşim proteinleri çalışma ve istismar spesifik küçük moleküllerin etkileri.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bilinen memeli p53 proteinin, Maya S. cerevisiae 'de bir transkripsiyon faktörü (TF) olarak hareket edebilir bulgu, 1 ' in etkilerini incelemek için farklı fonksiyonel bulguların gelişmesine izin verdi) bağlayıcı site [Yani, yanıt elemanı (Re)] p53 transaktivasyonu özgüllüğü veya 2) TP53 mutasyonlar, ortak ifade edilen Cofactors veya p53 Transaktivasyon aktivitesinde küçük moleküller üzerinde sıra türevleri. Farklı temel ve translasyonel araştırma uygulamaları geliştirilmiştir. Deneysel olarak, bu yaklaşımlar Maya modelinin iki büyük avantajları sömürüyor. Bir yandan, genom düzenleme kolaylığı, yalnızca belirli bir p53-RE seviyesinde farklı olan izojenik suşları sömürüyor ve p53 bağımlına göre sıralı-özgüllüğü araştırmak için nitel veya kantitatif muhabir sistemlerinin hızlı inşası sağlar transaktivasyonu. Öte yandan, ektopik p53 ifadesi için düzenlenmiş sistemlerin kullanılabilirliği, çok çeşitli protein ifadesinde Transaktivasyon değerlendirilmesi sağlar. Bu raporda yaygın olarak renk muhabiri genler, luciferase ve Maya büyümesi temel metodolojik adımları göstermek ve eleştirel onların öngörü gücünü değerlendirmek için dayalı sistemler kullanılır. Dahası, bu yaklaşımların aşırı çok yönlülüğü, TP53 gen ailesinin diğer üyeleri olan P63 ve P73 dahil olmak üzere farklı TFs çalışmaları için kolayca yararlanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkripsiyon, belirli uyaranlara yanıt olarak kromatin bölgelerinde RNA polimerinlerinin işe alma ve modülasyonu için dinamik, uzamsal ve temporal transkripsiyon faktörleri (TFs) ve Kofaktörler organizasyonu içeren son derece karmaşık bir süreçtir1 . Çoğu TFs, insan p53 tümör bastırıcı dahil, DNA dizileri şeklinde belirli cis-etkili unsurları tanımak yanıt elemanları denilen (REs), tek (veya birden fazla) benzersiz motifleri oluşur ~ 6-10 nükleotid uzun. Bu motifler içinde, bireysel pozisyonlar varyasyon2, genellikle pozisyon ağırlık matrisleri (PWM) veya logolar3,4tarafından özetlenen çeşitli dereceleri gösterebilir.

Maya S. cerevisiae , bir ortolog Maya geni mevcut olmadığında bile, tamamlayıcı bulgular, ektopik ifade ve fonksiyonel bulgular yoluyla insan proteinlerinin farklı yönlerini incelemek için uygun bir model sistemidir. 6 , 7. transkripsiyon sisteminin bazal bileşenlerinin evrimsel koruma nedeniyle8, birçok insan TFs (ektopik Maya hücrelerinde ifade edildiğinde) için tasarlanan organizatörler aracılığıyla hareket ederek bir muhabir geni ifadesi modüle olabilir uygun REs içerir. Burada insan p53 için sunulan transkripsiyon modeli sistemi, etkileri modüle edilebilir üç büyük değişken ile karakterize edilir: 1) ifade ve p53 türünün modalitesi, 2) RE dizisi p53 bağımlı transkripsiyon kontrol, ve 3) türü (Şekil 1a).

P53 ifadesinin modalitesi ile ilgili olarak, S. cerevisiae , indüklenebilir, bastırılabilir veya kurucu organizatörler9,10,11' in seçimini sağlar. Özellikle, indüklenebilir GAL1 Organizatör bazal sağlar (bir karbon kaynağı olarak bulunan Rafinoz kullanarak) veya değişken (medyada galaktoz miktarını değiştirerek) Maya bir TF ifadesi. Aslında, ince ayarlanabilir ifade sadece p53 kendisi değil, aynı zamanda diğer p53 aile proteinlerini incelemek için kritik bir gelişimi temsil eder12,13.

P53-bağımlı ifade kontrol res türü ile ilgili olarak, S. cerevisiae başka bir izojenik arka plan ilgi Re benzersiz farklılıklar sahip farklı gazeteci suşları inşası sağlar. Bu amaç, S. cerevisiae'de geliştirilen ve delitto Perfetto12,14,15,16adlı özellikle çok yönlü genom düzenleme yaklaşımının adaptasyonu kullanılarak ulaşılır.

Ayrıca, farklı muhabir genler (i.e., URA3, HIS3, ve ADE2) niteliksel ve niceliksel S. cerevisiaeiçinde insan TFs transkripsiyonel faaliyetleri değerlendirmek için kullanılabilir, belirli özellikleri ile her Deneysel ihtiyaçlar için uyarlanmış17, 18,19,20,21. Bu muhabirin genlerinin ifadesi, sırasıyla urasil, histidin ve adenin protorofinin ifadesidir. URA3 Reporter 5-FOA varlığında hücrelerin büyümesini de izin vermez ve böylece counterselected olabilir. ADE2 Reporter sistem avantajı vardır, beslenme seçimi yanı sıra, bu vahşi tipi (i.e., ADE2 ifade işlevsel) veya Mutant (i.e.,fonksiyonel değil ifade Maya hücrelerinin tanımlanması sağlar ADE2 ) Koloni renkten p53.

Örneğin, ADE2 geni ifade Maya hücreleri normal boyutta beyaz koloniler (2.5-5.0 mg/L) adenin miktarları sınırlayıcı içeren plakaları oluşturmak, bu kötü ya da daha küçük kırmızı (veya pembe) aynı plaka üzerinde görünür transkripleme değil iken Koloni. Bu, bir orta adenin biyosentetik yol birikimi nedeniyle (yani, P-ribosylamino-imidazol, daha önce amino-imidazol ribotide veya hava denir), kırmızı bir pigment oluşturmak için dönüştürülür. Nicel Firefly photinus pyralis (LUC1)12,22ile değiştirildi bu yana nitel renk tabanlı ADE2 Reporter gen vardır. Daha yakın zamanda, ADE2 Reporter lacz Reporter ile kombine edilmiştir kolay-to-Score, yarı-niceliksel, Çift muhabiri assay bu alt sınıflandırmak için yararlanılabilir p53 mutantlar işlevselliği onların kalıntı düzeyine göre 23 yaşında.

EGFP (Gelişmiş yeşil floresan proteini) veya DsRed (Discosoma Sp. kırmızı floresan proteini) gibi floresan muhabirleri, tüm olası yanlış mutasyonlar ile ilişkili Transaktivasyon aktivitesinin nicel değerlendirilmesi için de kullanılmıştır. TP53 kodlama sırası24. Son olarak, Re ve/veya muhabir geni için farklı izojenik maya suşları ile p53 allel ifade için ayarlanabilir Rehberleri birleştirerek şans kanser ilişkili ve germline rafine sınıflandırma üreten bir veri matrisinin gelişmesine yol açmıştır mutant p53 alelleri25,26,27.

Yukarıda açıklanan yaklaşımlar p53 proteinin transkripsiyonel aktivitesini ölçmek için kullanılır. Ancak, MA S. cerevisiae28 ve şizofrenozaccharomyces pombe29 ' da Wild-Type p53 ifadesi, hücre döngüsü tutuklaması ile ilişkili olan büyüme gerilmesine neden olabilir28,30 veya hücre ölümü31. Her iki durumda da, Maya büyüme inhibisyonu yüksek p53 ifadesi ile tetiklenir ve hücre büyümesi dahil endojen Maya genlerinin potansiyel transkripsiyonel modülasyonu ile korelasyon olmuştur. Bu hipotezi destekleyen, kayıp-of-fonksiyon mutant p53 R273H mantar hücre büyüme vahşi tipi olarak benzer düzeylerde ifade edildiğinde müdahale etmedi p5332. Tersine, toksik mutant p53 V122A Maya ifadesinde (vahşi tip p53 ile karşılaştırıldığında daha yüksek transkripsiyonel aktivite için bilinen) vahşi tip p5332daha güçlü bir büyüme inhibitör etkisi neden oldu.

Ayrıca, insan MDM2 Maya, onun mayası ve sonraki bozulma33teşvik insan p53 transkripsiyonel aktivite inhibe başardı gösterildi. Buna göre, human MDM2 ve mdmx p53 indüklenen Maya büyüme inhibisyonu inhibe yeteneği gösterildi32,34. Ek bir çalışmada, p53 transkripsiyonel aktivite ve aktin ifade seviyeleri arasında bir korelasyon, Maya32 ACT1 geni üzerinde bir Putatif p53 Re upstream belirlenmesi ile kuruldu. Sürekli olarak, aktin ifadesi Wild-Type p53 ve daha çok p53 V122A tarafından, ancak mutant p53 R273H tarafından geliştirilmiştir. Tersine, p53 tarafından aktin ifadesi p53 inhibitörleri MDM2, mdmx veya pifithrin-α (p53 transkripsiyon aktivitesinin küçük bir molekül inhibitörü), Maya-büyüme tahlil dayalı sonuçlar ile tutarlı bir ortak varlığı azaldı. Daha da önemlisi, bu sonuçlar p53-indüklenen büyüme inhibisyonu ve Maya aktivitesinin derecesi arasında bir korelasyon kuruldu, hangi da tanımlamak ve küçük moleküller modüle p53 fonksiyonları çalışma sömürüldü28,34 , 35.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. özel bir RE (yAFM-RE veya yLFM-RE) içeren ADE2 veya LUC1 muhabiri maya suşları inşaatı

  1. Yafm-ıcore veya ylfm-ıcore strain,12,14 (ıcore = ı, ISCe-ı endonükleaz GAL1 Promoter altında) Streak; CO = sayaç seçilebilir URA3; RE = muhabir KanMX4 kanamyisin direnci conferring; Tablo 1) bir YPDA agar plakasında-80 °C ' de saklanan% 15 gliserol stokta (Tablo 2). 2-3 gün boyunca 30 °C ' de büyümesine izin verin.
  2. Taze plaka bir Maya kolonisi alın (fazla 3 hafta eski) ve YPDA (Tablo 2) 5 ml içeren küçük bir Flask yerleştirin. 30 °C ' de geceleyin, 150-200 rpm 'de sallayarak.
  3. Ertesi gün, dekstroz tüm izlerini kaldırmak için, 3.000 x g de 2 dakika için hücreleri Pelet ve tüp inversiyon tarafından süpernatant atmak.
    Not: bu protokoldeki tüm santrifüjleri oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirin.
  4. 30-50 mL 'Lik ön ısıtılmış CM 'lik (tam medya), galaktoz (Tablo 2) içeren hücre pelsini ve 30 °c ' de 4 h için inküreme, 150-200 rpm 'de sallayarak (ı-scei indüksiyonu için gerekli).
  5. 3.000 x g 'de 2 dakika boyunca hücreleri santrifüjle çıkarın ve tüpün inversiyonu ile süpernatant 'i atın.
  6. 30-50 ml steril su içinde hücre Pelet resuspend. 1,5 adımı yineleyin.
  7. 10 ml steril suda hücre Pelet resuspend. 1,5 adımı yineleyin.
  8. 5 ml steril liacte (Tablo 3), DNA alımı iyilik bir iyonik çözüm hücre Pelet resuspend. 1,5 adımı yineleyin.
  9. 250 μL steril liacte hücre Pelet resuspend ve bir 1,5 ml tüp hücreleri aktarmak. Tekrar adım 1,5 ve yeniden pelletini 300-500 μL steril liacte içinde hücre Pelet.
  10. Yıkanmalar sırasında, 100 °C ' de 10 dakika boyunca somon sperm DNA taşıyıcısının 10 mg/mL çözeltisini denmesi ve tek telli DNA olarak korumak için buzda hemen Chill.
  11. Ayrı bir 1,5 mL Tüp, istenilen oligonükleotid 500 picomoles ekleyin (Tablo 3), 5 μL haşlanmış somon sperm taşıyıcı DNA, 300 μL steril LiAcTE Peg (Tablo 3), ve 50 μL Maya hücre süspansiyonu (adım 1,9).
  12. 150-200 rpm 'de sallayarak, 30 °C ' de 30 dakika boyunca karıştırın ve inküye 10 s için tüpler Vortex. Sıkışmak lehine yan 1,5 mL tüpler yerleştirin.
  13. Isı şok Maya hücreleri 15 dakika 42 °C ' de bir ısıtma bloğu içinde, daha sonra 20 s için hücreleri santrifüjler 10.000 x g. Süpernatant çıkarın ve 1 ml steril su hücreleri pelletini.
  14. YPDA agar plakasında hücre süspansiyonunun 100 μL 'i yaymak ve 30 °C ' de 1 gün boyunca inküsyon (ters). İyi ayrılmış kolonilerin elde edildiğinden emin olmak için 1:10 seyreltme 100 μL de yayılır.
  15. Ertesi gün, dekstroz ve 5-FOA içeren cm agar plaka üzerine steril kadifeler kullanarak yineleme plakası (Tablo 2). (Yani, URA3 hücrelerin bazı büyüme) birçok hücre transfer ise yeni bir plaka üzerinde ikinci bir kopya plaka düşünün.
  16. Üç gün sonra, olmayan seçici ypda ve ypda üzerinde yineleme plakası G418 (bir aminoglikozid antibiyotik kanamycin benzer) agar plakaları (Tablo 2), onların sonraki karşılaştırma kolaylaştırmak için her plaka işaretleme. Levhaları bir gecede 30 °C ' de kulküat.
  17. Ertesi gün, G418-Sensitive ama YPDA plakaları (örneğin, yLFM veya yAFM-RE kolonileri) büyümeye koloniler aday muhabiri suşları tanımlayın. Tek kolonli izolatlar elde etmek ve 30 °C ' de 2 gün boyunca büyümelerine izin vermek için yeni bir YPDA plakasında tanımlanan kolonileri (3-6 koloni) çizin.
  18. Daha fazla analiz için kolonileri izole etmek için bir YPDA plakasında tek Maya kolonisi yama. 30 °C ' de 24 saat sonra, minyon mutantların büyümesini (yani solunum eksikliği mutantları) engelleyen bir YPGA agar plakasında (Tablo 2) yineleme kaplama ile test edin. Aynı zamanda, yeni bir YPDA agar plaka üzerinde yineleme plakası.
  19. Doğru yamaları test (yani, YPDA ve YPGA agar plakaları üzerinde büyüme; 1-3 koloniler) koloni PCR tarafından doğru oligonükleotit entegrasyonu varlığı için adım 1,18. 5 μL 10X PCR tampon (1,5 mM MgCl2), 2 μL 10 picomoles/μL astar (Tablo 3), 4 μL 2,5 mm dntps, 0,25 μL 5 U/μL Taq polimeraz ve son hacmine kadar su (50 μL) ekleyerek bir reaksiyon karışımını birleştirin. Her bir PCR tüpüne x 50 μL olarak taranması gereken Maya kolonilerinin sayısı için reaksiyon karışımını çarpın. Bir pipet kullanarak, tek bir PCR reaksiyon karışımı içine YPDA agar plaka Maya hücreleri çok az miktarda ekleyin.
  20. Aşağıdaki program ile PCR reaksiyonu gerçekleştirin: 94 °C ' de 8 dakika için 35 denatürasyon döngüsü, 94 °C ' de 1 dk, 55 °C ' de 1 dakika tavlama ve 72 °C ' de 2 dakika uzatma.
  21. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, doğru boyutu (~ 500 BP) kontrol etmek için bir agaroz jel üzerinde PCR reaksiyonu (yaklaşık onuncu hacmi) bir kısım yükleyin.
  22. Adım 1,19 aynı astar kullanarak istenilen RE dizisinin entegrasyonunu onaylamak için ticari bir kit ile arıtma sonra PCR ürün sırası.
  23. Doğru sıra doğrulandıktan sonra, yAFM-RE veya yLFM-RE gerinim kültürü (YPDA)% 15 gliserol stok yapmak ve at-80 °C saklayın.

2. p53 protein Transaktivasyon yeteneği nitel renk tabanlı ADE2 Maya tahlil kullanarak değerlendirilmesi

  1. 1,1 ve 1,2 yAFM-RE gerilimi (Tablo 1) kullanarak adımları yineleyin.
  2. Sonraki gün, 30-50 mL 'Lik ön ısıtılmış YPDA hücre kültürünü (1:10) seyreltir ve OD600nm 0.8-1.0 (~ 2 h) ' ye ulaşıncaya kadar 30 °c ' de sallama devam eder.
  3. 1,5-1.10 arasındaki adımları yineleyin.
  4. Ayrı bir 1,5 mL Tüp, Ekle 300-500 ng Maya p53 (veya kontrol) ifade vektörü (Tablo 4), 5 μL haşlanmış somon sperm DNA taşıyıcı, 300 μL steril LiAcTE Peg, ve 50 μL Maya hücre süspansiyonu.
  5. 1,12 ve 1,13 adımları yineleyin ama hücre Pelet, 300 μL steril su yeniden pelletini.
  6. Karbon kaynağı olarak dekstroz ve yüksek miktarda adenin (Tablo 2) içeren sentetik seçici (p53 ifade veya kontrol vektörü için) hücre süspansiyonunun μl 100 Spread 'i, sonra 2-3 gün boyunca 30 °c ' de (baş aşağı) inküsyon yapın.
  7. Yeni seçici plakaya tek Maya transformant kolonileri (plaka başına 2-6 çizgiler) serin ve 30 °C ' de bir gecede büyümelerine izin verin.
  8. Gün sonra, renk fenotipinin değerlendirilmesi için izin yeni seçici plakalar üzerine steril kadifeler çoğaltma plakası kullanarak (yani, karbon kaynağı olarak dekstroz içeren plakaları ama adenin miktarını sınırlamak; Tablo 2). Plakaları 3 gün boyunca 30 °C ' de baş aşağı inkoyun. İsteğe bağlı olarak, p53 proteinin sıcaklık hassasiyetini değerlendirmek için 3 gün boyunca üç farklı sıcaklıkta inküye: 24 °C, 30 °C ve 37 °C.
    Not: aynı çizgi birden çok kez çoğaltma kaplama olabilir.
  9. P53 protein transaktivasyonu yeteneğini değerlendirmek için, Maya kolonilerinin renk tabanlı fenotipi kontrol ve p53 Wild-tipi ve boş vektör fenotipleri ile ilgili p53 protein fenotipi karşılaştırın.

3. p53 protein Transaktivasyon yeteneğinin niceliksel lüminesans tabanlı LUC1 Maya tahlil kullanarak değerlendirilmesi

  1. P53 (veya kontrol) ifade vektörler (Tablo 4) ile Maya hücrelerini Transform protokol 2 ' de açıklanan Liac tabanlı yöntemi kullanarak. YLFM-RE gerinim (Tablo 1) kullanın.
  2. Karbon kaynağı olarak glikoz içeren yüksek miktarda adenin ile yeni bir seçici plaka üzerinde yama tek transformanlar ve onları 30 °C gecede büyümeye izin. Her dönüşüm türü için 5-7 farklı yamalar yapın.
  3. Gece büyüme sonra, karbon kaynağı olarak dekstroz veya bulunan Rafinoz içeren sentetik seçici orta plakadan steril bir küral veya pipet ucu kullanarak Maya hücrelerinin küçük bir miktar pelletini (200 bir yuvarlak ile şeffaf 96 iyi plaka, μL son hacim veya düz alt). Deney indüklenebilir p53 ifadesi gerektiriyorsa, indüksiyon seviyesini modüle etmek için bulunan Rafinoz ortamına galaktoz ekleyin (Tablo 2).
    Not: Bu hücre süspansiyonları yaklaşık 0,4 ve 1 ' den daha yüksek bir OD600nm olmalıdır.
  4. Ölçmek bir MultiLabel plaka okuyucu kullanarak indüklenebilir p53 ifade (4-8 h 30 °C ' de 150-200 RPM ile) sonra OD600nm her iyi emici. Hücre süspansiyonların her iyi çok kanallı pipet ile karıştırılarak homojen olduğundan emin olun.
  5. Transfer 10-20 μl hücre süspansiyon şeffaf 96 iyi plaka beyaz bir 384 (veya 96) iyi plaka ve eşit hacim (10-20 μl) lizis tampon ile karıştırın. , Lusiferaz substrat hücre geçirgen elde etmek için bir shaker (150-200 rpm) RT 10-15 dk için inkübe.
  6. 10-20, Firefly Lusiferaz substrat μL ekleyin ve ışık birimlerini (Lu) çok etiketli bir plaka okuyucusu ile ölçün.
  7. P53 protein transaktivasyonu yeteneğini belirlemek için, her iyi ilgili OD600nm (bağıl ışık ünitesi, RLU) Için lu 'lar normalleştirmek. Maya transformant kolonilerin 3-4 yamaları ortalama RLU ve standart sapma hesaplayın.
  8. P53 protein Transaktivasyon verilerini p53 vahşi tip ve boş vektörüne göre karşılaştırın, ya boş vektörden elde edilen değerleri çıkararak ya da boş vektörden elde edilen değerlere bölerek (yani indüksiyon kat hesaplama).
    Not: p53 Transaktivasyon aktivitesi de p53 etkileşen proteinler (örn. MDM2 ve MDMX) ve/veya ilaç tedavisi dahil olmak üzere aynı deneysel ayarlama kullanılarak değerlendirilebilir.

4. p53 protein büyüme inhibisyonu Maya fenotipi tahlil kullanarak değerlendirilmesi

  1. P53/MDM2/MDMX (veya kontrol) ifade vektörler (Tablo 4) ile Maya hücrelerini Transform Bölüm 2 ' de açıklanan Liac tabanlı yöntemi kullanarak. CG379 gerinim (Tablo 1) kullanın ve en az seçici plakalar (Tablo 2) Maya transformants yayılır.
  2. En az seçici ortamda (Tablo 2) dönüştürülmüş hücreleri YAKLAŞıK 1 od600nm'ye büyütün.
  3. Seçici indüksiyon ortamında 0,05 OD600nm için seyreltilebilir Maya hücreleri (Tablo 2) ve isteğe bağlı olarak, seçilen küçük bir molekül uygun konsantrasyon (veya sadece solvent) mutant p53 veya inhibe MDM2-içinde etkinliğini test etmek için eklemek- /MDMX-P53 etkileşimleri.
  4. Hücreleri 30 °C ' de sürekli orbital sallama (200 rpm) altında yaklaşık 42 h (negatif kontrol mayasının orta günlük faz ulaşmak için gerekli zaman, yaklaşık 0,45 OD600nm) altında kuluçka.
  5. Spot 100 en az seçici plakalar üzerinde Maya hücre kültürlerinin μL plakaya (Tablo 2).
  6. 30 °C ' de 2 gün boyunca inküye yapın.
  7. 100 μL kültür damlaları (koloni şekillendirme ünitesi, CFU sayar) elde edilen kolonilerin sayısını sayarak Maya büyümesini ölçmek. Örneğin, (100), mutant p53 ifade hücrelerin büyümesi (ancak solvent kontrolüne maruz) temsil ederken en fazla olası etkisi (p53% olarak ayarlanmış), vahşi tipi büyüme dikkate bileşiklerin mutant yeniden aktive etkisini hesaplamak yeniden etkinleştirme sıfır düzeyi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnşaatı ADE2 veya LUC1 muhabir maya suşları

Delitto perfettoyaklaşım12,14,15,16 p53 Reporter maya suşları (Şekil 1B) inşası sağlamak için adapte edilmiştir. Yönt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maya tabanlı konular p53 protein fonksiyonlarının çeşitli yönlerini araştırmak için yararlı olduğunu kanıtladı. Bu değerlendirme, fonksiyonel polimorfizmlerinin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere RE hedef sitelerin türevleri doğrultusunda p53 Transaktivasyon potansiyelini değerlendirmek için özellikle duyarlıdır. Renkli gazetecilerin kullanımı yanı sıra Lusiferaz tahlil sonucu minyatürleşme maliyet-etkili ve nispeten ölçeklenebilir gösteriyor. Ayrıca, büyüme inhibisyonu testi potansiyel kimyasal Kütüphane taramasında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Avrupa Birliği (FEDER fonları POCI/01/0145/FEDER/007728 programa Operacional factores de rekabet Vidade YARıŞıN) ve ulusal fonlar (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia ve Ministério da Educação e Ciência) altında teşekkür Ortaklık Anlaşması PT2020 UID/QUI/50006/2019 ve projeler (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT burs: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Bu çalışma Compagnia S. Paolo, Torino, Italya (Project 2017,0526) ve Sağlık Bakanlığı, (proje 5x1000, 2015 ve 2016; güncel araştırma 2016) tarafından destekleniyordu. Video kaydı ile ilgili yardım almak için Dr. Teresa López-Arias Montenegro 'ya (Trento Üniversitesi, Deneysel Bilimler Öğretim laboratuvarları) derinden teşekkür ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
L-Aspartik asitSIGMA11189
QIAquick PCR Saflaştırma KitiQIAGEN28104
L-FenilalaninSIGMA78019
PeptonBD Bacto211677
Maya ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Difco Maya Azot Bazı, Amino Asitler ve Amonyum SülfatBD olmadanTM233520
Lityum Asetat DihidratSIGMA517992
Bakteriyolojik Agar Tip ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 disülfat tuzuSIGMAA1720
Amonyum SülfatSIGMAA2939
L-Arginin Monohidro-klorürSIGMAA5131
Adenin Hemisülfat TuzuSIGMAA9126
Pasif Lizis Tamponu 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo Lusiferaz Test Sistemi PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalaktozSIGMAG0750
L-Glutamik asitSIGMAG1251
Dekstroz SIGMAG7021
L-histidinSIGMAH8125
L-İzolösinSIGMAI2752
L-LizinSIGMAL1262
L-LösinSIGMAL8000
L-MetioninSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Rafinoz PentahidratSIGMAR0250
L-SerinSIGMAS4500
L-TriptofanSIGMAT0271
L-TreoninSIGMAT8625
UrasilSIGMAU0750
L-ValinSIGMAV0500

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21(2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84(2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28(2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643(2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507(2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107(2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236(2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464(2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177(2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170(2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Maya P53 AnalizleriP53 TransaktivasyonuMaya Raporlay c Su larLusiferaz AnaliziRenk Raporlay c GenMaya B y me nhibisyonuP53 Yan t ElementiLityum Asetat TransformasyonuP53 Mutant AnaliziTranskripsiyon Fakt r al mas

İlgili makaleler