Nicel bir yöntem tanımlamak ve fenotipik Caenorhabditis elegansprofil oluşturma otomatik olarak analiz ederek kimyasal maddeler akut toksisite tahmin etmek için geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı, bir 384-şey tabak içinde solucanlar kimyasallar ile tedavi, video esir alma ve toksikolojik ilgili fenotipleri ölçmek açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir yüksek-den geçerek tahlil tarafından otomatik fenotipik profil oluşturma Caenorhabditis elegans ve kimyasal toksisitesi tahmin için
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Fare ya da sıçan, gibi daha yüksek sipariş organizmalarda kimyasal maddelerin toksisite test uygulama zaman alıcı ve pahalı, uzun ömrü ve bakım sorunları nedeniyle. Aksine, Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans (C. elegans) toksisite testleri için ideal bir seçim yapmak için avantajları vardır: kısa ömrü, kolay ekimi ve verimli üreme. Burada, otomatik fenotipik C. elegans 384-şey tabak içinde profili için bir protokol açıklayın. Yuvarlak solucanlar bir 384-şey plaka sıvı orta ve kimyasal tedavi ile kültürlü ve videolar 33 solucan özellikleri kimyasal etkisi ölçmek için her iyi alınır. Deneysel sonuçlar quantified fenotip özellikler sınıflandırmak ve akut toksisite farklı kimyasal bileşikler için tahmin ve kemirgen bir modelinde daha fazla geleneksel kimyasal toksisitesi değerlendirme sınamaları için bir öncelik listesi kurmak olduğunu göstermek.
Giriş
Sanayi üretimi ve insanların günlük yaşam için uygulanan kimyasal bileşikler hızla gelişmesi ile birlikte, sınama modelleri kimyasallar için toksisite eğitim önemlidir. Birçok durumda, kemirgen hayvan modeli farklı kimyasallar sağlığı üzerinde potansiyel toksisitesi değerlendirmek için istihdam edilmektedir. Genel olarak, öldürücü konsantrasyonları (yani, bölümü % 50 öldürücü doz [LD50] farklı kimyasallar) belirlenmesi içinde vivo bir kemirgen (fare/fare) modelinde geleneksel parametre olarak zaman alıcı ve pahalı olan kullanılır. Buna ek olarak, küçültme nedeniyle iyileştirmek veya yerine hayvan refahı ve etik merkezi bir noktada bulunuyor (3R) prensibi, yüksek hayvanlar değiştirilmesi için bilimsel araştırma1,2,3 ' e değerli sağlayan yeni yöntemler . C. elegans topraktan izole edildikten evrimleşmiş bir yuvarlak solucanlar var. Bu yaygın olarak laboratuvar araştırma organizmada kısa ömrü, kolay ekimi ve verimli üreme gibi yararlı özellikleri nedeniyle kullanılmıştır. Buna ek olarak, temel fizyolojik süreçleri ve stres yanıt C. elegans, içinde de dahil olmak üzere birçok temel biyolojik yollar daha yüksek memeliler4,5,6,7 ' konservasyonu , 8. biz ve diğerleri yapmış karşılaştırmalar bir çift olarak, C. elegans toksisite ve kemirgenler9' gözlenen toksisite arasında iyi bir uyum olduğunu. Tüm bu kimyasal toksisitesine içinde vivo etkilerini test etmek için iyi bir model C. elegans yapar.
Son zamanlarda, bazı çalışmalarda C. elegansfenotipik özellikleri sayılabilir. Özellikleri kimyasal2,3,10 toksisite ve solucanlar11yaşlanma analiz etmek için kullanılabilir. Ayrıca sistem ve solucanlar bir 384-şey plaka farklı kimyasal tedaviler12altında kültürlü bir görüntü analiz sistemi sıvı solucan birleştiren bir yöntem geliştirdi. Nicel bu teknik sonra 12-24 h sıvı orta ile 384-şey plaka kimyasal tedavi C. elegans 33 parametrelerini otomatik olarak analiz etmek için geliştirilmiştir. Bir otomatik mikroskop sahne deneysel video satın alma için kullanılır. Video özel olarak tasarlanmış bir program tarafından işlenir ve solucanlar hareketli davranış için ilgili 33 özellikleri sayılabilir. Solucan fenotipleri 10 bileşiklerin tedavi altında ölçmek için kullanılan yöntem. Sonuçlar farklı toksisitesine C. elegansfenotipleri değiştirebilir gösterir. Bu quantified fenotipleri tanımlamak ve farklı kimyasal bileşikler akut toksisite tahmin etmek için kullanılabilir. Bu yöntem genel amacı gözlem ve fenotipik miktar sıvı kültüründe C. elegans ile deneyler kolaylaştırmaktır. C. elegans uygulama kimyasal toksisitesi değerlendirme ve farklı kimyasal bileşikler akut toksisite tahmin ve için bir öncelik listesi kurmak yardımcı fenotip quantifications için bu yöntem yararlıdır daha fazla geleneksel kimyasal toksisitesi değerlendirme sınamaları kemirgen bir modeldir. Buna ek olarak, bu yöntem tarama ve yeni kimyasal madde veya bileşik Gıda katkı maddesi Ajan kirliliği, pharmacautical bileşikleri, çevre eksojen bileşik ve benzeri test toksisite için uygulanabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Protokol hastalık önleme ve kontrol Çin Pekin Merkezi hayvan Etik Komitesi hayvan bakımı kuralları izler.
1. kimyasal hazırlama
- Kimyasal maddeler (Tablo 1 ve Tablo reçetesi) edinin.
- % 100 ölümcül (LC100, 24 h) en az bir konsantrasyon ve % 100 nonlethality (LC0, 24 h) solucanlar için maksimum konsantrasyon bireysel kimyasalların en yüksek ve en düşük doz belirlemek. En az altı dilutions en yüksek konsantrasyon (Tablo 1) kullanın.
Not: LC100 ve LC0 yeni bir kimyasal için dozu belirlemek için keşfetmek için bir ön solucan ölümcül test9 kuralları. - K-orta (Malzemeler tablo) ile her kimyasal gerekli konsantrasyonu x 2 oranında seyreltin. K-orta bir denetim tarafından kimyasallar neden fenotip değişiklikleri karşılaştırmak için kullanın.
- Örneğin, Kadmiyum klorür (CdCl2) 7 degrade konsantrasyonları hazırlamak (Tablo 1). 2 x hazırlamak için en yüksek konsantre sulu çözüm (4,64 mg/mL), 8 ml K-orta CdCl2 katı tozu 92.8 mg dağıtılması ve toz tamamen çözünmüş sonra 10 mL doldurun. Diğer toplama düzeyleri seyreltme K-orta ile hazırlayın.
- Sekiz paralel wells kimyasal degrade her konsantrasyon için hazır olun. Her şey 50 µL 2 x kimyasal çözüm içerir. K-orta sekiz paralel Wells en az üç grup denetimleri (Tablo 2) hazırlayın.
Not: Kısaca, 2 çalışma çözüm x 500 µL hacmi her kimyasal tek bir doz için gereklidir.
2. solucan hazırlık
- Vahşi-türü N2 solucanlar ve Escherichia coli OP50 suşları Caenorhabditis genetik Merkezi (CGC) elde edilir.
- Eşitlenmiş L4 solucanlar edinin.
- E. coli OP50 çizgi plaka bir koloni seç. Aseptik 100 mL LB suyu, kolonimizde aşılamak ve gecede 37 ° C'de büyür
Not: E. coli OP50 çözüm şimdi nematodunun büyüme orta (NGM, Malzemeler tablo) plakalar için tohum için hazırdır. - NGM 90 mm plastik Petri plaka dökün. Tohum her gün dökme sonra E. coli OP50 çözüm 300 µL ile plaka. N2 solucanlar OP50 ile NGM plakaları 20 ° C'de yaklaşık 2-3 Bu solucanların en yetişkin sahne gelinceye gün kuluçkaya.
- 15 mL steril konik santrifüj tüpü steril H2o içine hasat gravid solucanlar En az 2 dakika sakin ol biraz, H2O Aspire edin ve çamaşır suyu arabellek (Tablo reçetesi) 5 mL ekleyin solucanlar izin.
- Girdap tüp 5 min için spin tüp 30 s (1.300 x g) de yumurta cips ve süpernatant atmak için.
- 5 mL steril H2O ve girdap ile yumurta tüp 5 s. santrifüj tüpü 30 s (1.300 x g) de, Kaldır süpernatant ve yıkama için tekrar yıkayın.
- Yeni NGM üzerine yumurta OP50 ile plaka pipet. Onları 20 ° C'de kuluçkaya Taranmış L1 solucanlar ertesi sabah izlemek; solucanlar yaklaşık 40 h L4 aşamasında ulaşacak.
- E. coli OP50 çizgi plaka bir koloni seç. Aseptik 100 mL LB suyu, kolonimizde aşılamak ve gecede 37 ° C'de büyür
- L4 solucanlar kapalı bir 50 mL steril konik tüp 90 mm Petri kalıplara K-orta ile yıkayın. Solucanlar K-orta 100 µL altında bir stereomicroscope başına ~ 40 hayvanlara konsantrasyonu ayarlayın. 50 µL (~ 20 solucanlar) 384-şey plaka her kuyunun içine ekleyin. Bu senkronize solucanları (L4 sahne) kimyasallar ile aşağıdaki tedavi için hazırsınız demektir.
3. kimyasal arıtma ve video esir alma
Not: 384-şey tabak içinde altı yedi dozlarda (Tablo 1) bireysel bir kimyasal için solucanlar (her iyi 50 µL) kabul edilir. Sekiz paralel wells, her 2 (sekiz wells aynı kimyasal ve aynı konsantrasyonu, Tablo 2dolu) her doz için kimyasal çözüm x 50 µL içeren hazır olun. Tüm videoları bir ters mikroskobu (Tablo reçetesi) bağlı bir dijital kamera ile toplanır. Kimyasal arıtma deney 24 saat sürer. Bakteriyel gıda 24 h kimyasal arıtma deneme sırasında her şey eklemeyin.
- Kimyasal eklemeden önce 384-şey plaka ile eşitlenmiş solucanlar Sahne Alanı'nda otomatik ayarla ve her şey programlanmış edinme prosedürü ile video (2 saniyede 7 kare s; her plaka inceden inceye gözden geçirmek için ~ 25 dakika sürer).
- 2 Bölüm 1 için her şey (Tablo 2) göre hazırlanan kimyasal hisse senedi x 50 µL ekleyin. Zaman 0 h noktası olarak ayarla.
- 20 ° C'de 384-şey plaka kuluçkaya ve 80 devirde bir kuluçka shaker çalkalanır.
- Ve bir otomatik sahne alanı'na transfer kuluçka makinesi plaka çıkarın. Her şey bütün tabağı, videolar, 12 h ve, 24 h, K-orta her belirli kimyasal tedavi için solucanlar fenotipleri kontrol almak. Yaklaşık 25 dk, bir tabak ekran için gereklidir.
4. deney video işleme
Not: Deneysel video ve fotoğraf işleme için bir program yazılmış ve paketlenmiş. Serbestçe ( Tablo malzemelerigörmek) karşıdan yüklenebilir. Deneysel video görüntü çerçeve sırası şeklinde saklanır ve kare dizisinin her videonun belirli bir dizinde saklanır. Program solucanlar tanımak ve fenotipleri otomatik olarak ölçmek.
- Grafik kullanıcı arabiriminde (GUI, şekil 1), çerçeve sıra dizin, belgili tanımlık verim müdür, solucan boyutu parametresi ve hareket eşik parametresi gibi parametreleri ekleyin. Deneysel görüntüleri işlemek için analiz düğmesini tıklatın.
- Kaynak resim dizin seçmek için Seç düğmesini tıklatın.
- Orta sonuç dizini içinde arabirimi ekleyin.
Not: Orta sonuçları kesimli görüntüleri içerir. Bu orta sonuçları işlenmiş görüntüler görsel gözlem için yararlıdır. - Nihai sonucu dizin içinde arabirimi ekleyin.
- Solucan boyutu metin kutusuna arabiriminde ortalama solucan boyutu parametresi ekleyin.
Not: deneylerde kullanılan boyutu 2,000 parametresidir. - Taşınan oranı eşiğinde arabiriminde ekleyin.
Not: deneylerde kullanılan 0.93 oranıdır. - Görüntü işleme başlatmak için analiz düğmesini tıklatın. Ek parametreler temizlemek için Sıfırla düğmesini tıklatın.
Not: Tanımlanan ve solucanlar için sayısal 33 özellikleri vardır. Tüm tanımlanmış fenotipleri ( Tablo 3' te listelenen) kategorilere göre sıralanır. Bu özellikler deneysel görüntülerden sayısal. Nicel bir karşılaştırma arasında farklı toksisite olan farklı kimyasallar, bu özellikler karşılaştırarak yapılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
10'dan fazla kimyasal madde12farklı konsantrasyonları maruz solucanlar fenotipleri test ettik. Olan test, 33 farklı özellikle her kimyasal üç saat noktalarda (0 h, 12 h ve 24 h) bileşik için sayısal. Daha önce bir manuel ve otomatik bir ömrü tahlil analizini arasında bir karşılaştırma11,12yapıldı. Bu tahlil bulduk kimyasallar ve konsantrasyonları solucan fenotipleri etkileyebilir. Bu yöntemin genel
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
C. elegans avantajları artan kullanımı toksikoloji9, hem mekanik çalışmalar ve yüksek üretilen iş tarama yaklaşımlar yol açmıştır. Toksikolojik araştırmalar diğer modeli sistemlerinde tamamlayan artan bir rol C. elegans için son yıllarda, özellikle yeni kimyasallar hızlı toksisitesinin değerlendirilmesi için dikkat çekici olmuştur. Bu makalede solucan yüksek üretilen iş, nicel tarama yeni bir tahlil fenotipleri 384-şey plaka otomatik tanımlama ve kimyasal toksisitesi değerlendiri...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar CGC nazikçe C. elegans gönderdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı of China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) tarafından desteklenmiştir Ulusal Doğa Bilimleri Çin Grant (#31401025, #81641184 #81273108), sermaye Sağlık Araştırma ve geliştirme Pekin (#2011-1013-03), Çevresel Toksikoloji (# Beijing anahtar laboratuvar açılış Fonu'nun özel projesinin temeli 2015HJDL03) ve doğal Bilim Vakfı, Shandong Eyaleti, Çin (ZR2017BF041).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384 oyuklu plakalar | Trome | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropin sülfat | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Çamaşır suyu tamponu | 0.5 mL 10 M NaOH, 0.5 mL %5 NaClO, 9 mL ultra saf su | ||
| Kadmiyum klorür | Sigma-Aldrich | ||
| Kalsiyum klorür | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD kamera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Kolesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Bakır(II) sülfat | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Etilen glikol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Gliserol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Orta | 1 L ultra saf suda 3.04 g NaCl ve 2.39 g KCl | ||
| LB Et suyu | 10 g/L Tripton, 5 g/L Maya Çıkart, 5 g/L NaCl | ||
| Magnezyum sülfat heptahidrat | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plakası | 3 g NaCl, 17 g ofagar, 1 L ultra saf suda 2.5 g pepton, otoklavdan sonra 1 mL kolesterol (etanolde 5 mg / mL), 1 mL MgSO4 (1 M), 1 mL CaCl2 (1 M), 25 mL PPB tamponu | ||
| Pepton | Bacto | 211677 | |
| Potasyum klorür | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| ekleyinPotasyum fosfat dibazik | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potasyum fosfat monobazik | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB tamponu | 35.6 g K2HPO4, 108.3 g KH2PO4 in 1 L ultra saf su | ||
| çalkalayıcı | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodyum florür | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodyum hidroksit | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodyum hipoklorit çözeltisi | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| bağlantısı | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tripton | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Maya özütü | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss otomatik mikroskop ve nbsp; | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Özel yazılım Zen2012 ve şarj bağlantılı cihaz (CCD) kameralı Zeiss otomatik microsco |
Kaynaklar
- Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
- Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
- Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
- Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
- Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
- Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
- Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
- Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
- Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259(2007).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18(2018).
- Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
- Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
- Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
