Yöntem makalesi

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/59084

⸱

26 Şubat 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroanatomy and Molecular Brain Research, Ruhr University Bochum, 2Central Animal Facility of the Medical Faculty, Ruhr University Bochum

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transmisyon elektron mikroskobu ve rahimde iletim sinir sisteminin iyi ultrastructure morfolojik değişiklikler geliştirme sırasında çalışmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu kombine yöntem değişiklikleri içine derin anlayışlar nöroplastisite ile ilgili topografik ifadelerinin temel yapısal detayları verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu da çalışmanın ilgi bir protein tarafından etkilenen belirsizliğe yer bırakmadan tanımlanan topografik yapılarda ultrastructural parametrelerinin kesin morfometrik analizi nişan rahimde iletim transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile birleştirir Bu viral havalesi yoluyla organizma içine giriliyor. Bu kombine yaklaşım aşağıdaki topografik navigasyon haritaları bir doku atlasında tarafından ultrastructural kimlik macrostructural yumuşak bir geçiş sağlar. Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu içinde-utero-transduced doku ortaya neuropil ve plastisite parametreleri, cross-sectioned sinaptik bouton alanları, sinaptik veziküller ve mitokondri içinde sayısı gibi iyi ultrastructure bir Bouton profil, sinaptik kişiler, cross-sectioned aksonal alanları, miyelin kılıf kalınlığı, miyelin lamellae sayısı ve mitokondri profilleri cross-sectioned alanları uzunluğu. Bu parametreler analizi genetik yapı viral havalesi ile etkilenen sinir sistemi alanlarında ultrastructural plastisite değişiklikleri içine temel görüşler ortaya koymaktadır. Bu kombine yöntem yalnızca nöronal plastisite üzerinde genetiği biomolecules ve/veya uyuşturucu etkisi doğrudan çalışmak için kullanılamaz ancak da (örneğin, bağlamında nöronal plastisite rahimde Kurtarma çalışma imkanı açılır nörodejeneratif hastalıklar).

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yok foton bir elektron derinlik sınıfta bir ultrathin doku numune nüfuz. Bu çok değerli avantajları TEM için nanometre çözünürlük fotoğraf güzel ışık mikroskobu teknikleri için karşılaştırıldığında yapıları yakalama öznitelikleri. Örneğin, mitokondri, melanosomes ve çeşitli salgı granülleri, mikrotübüller, microfilaments, kirpikler, microvilli ve hücreler arası kavşak (hücre yüzey gibi hücre içi organellerin görselleştirme için TEM sağlar uzmanlık), özellikle sinir sistemi1,2,3,4' te synapses. Metodolojik da çalışmanın genel amacı nöral plastisite değişimler ultrastructural tanıma geliştirme doğum öncesi girişim üzerine rahimde iletim ve TEM state-of--art teknikleri birleştirerek bulunuyor. İlgi virally kodlanmış proteinler rahimde omurilik6dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi5,6,7, transduced. Örneğin, rahimde iletim TEM ile birlikte hücre adezyon molekülü L1 etkisi motorlu plastisite L1-eksik farelerde özellikle L1 ve nükleer reseptör proteinler arasında etkileşimi ile ilgili öğrenme eğitimi için kullanılmıştır serebellar nöronlar7' de.

Nöroplastisite parametreler analiz sinir sistemi içinde en küçük alanlarda lokalizasyonu hakkında kesin bilgi gerektirir. Bu nedenle, ultrastructural detayları ve diğer yapıları ile ilgili tam topografik yönelimleri açıklamak yeterli olduğunu. Bu da çalışmanın, hem ışık hem elektron mikroskobu bağlı farklı morfolojik bölgelerin detaylı incelenmesi yönelik belirli bir hazırlık yöntemi gösterilir. Bu yaklaşım doku manipülasyonu, fare beyin ve omurilik rahimde iletim ile başlayan ve perfüzyon fiksasyon tarafından takip çeşitli teknikleri birleştiren kalıp gömme ve doku TEM için işleme. Kesin microphotographic ve düşük-büyütme belgelenmesi için sağlar girişim ışık yansıması tekniği kullanarak doku belgelerine gömme ve TEM için doku işleme arasında dahil önemli bir adım olduğunu doku örnekleri8,9,10. Mevcut yaklaşım dahil, bu teknik araştırmacılar topoğrafik ve yapısal detaylar sinir doku yüzeyler ve numune dilim profilleri onların hazırlık TEM için önce incelemek için sağlar.

Bütün beyin kesit için özel bir çerçeve stereotaksik koordinatlarına karşılık gelir. Bu çerçeve morfolojik üç boyutlu (3D) yeniden inşası sinir doku alanlarda faydaları ve xarakteristikaları analizi için kullanılabilir. Macrographs görüntülenmeyecektir bölümlerin topografik koordinatları atanır ve seri olarak numaralı kesitler doku atlas haritaları oluşturmak.

İşleme reçine sonra katıştırılmış doku ultrathin bölümlere kesitli (< 70 nm) yukarıda belirtilen doku atlas haritaları göre Seçili alanlar içeren. Ultrathin bölümleri TEM içeriklerini ve komşu yapılar kompleksi içinde ilgili kişilere plastisite parametreleri (örneğin, kesit profil alanları sinaptik boutons veya aksonal lifleri) yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için tabi neuropil.

Burada açıklanan yöntemi ile mikro - ve taşınımı için yumuşak bir geçiş görüntülenmeyecektir macrostructures üzerinden morfolojik nöronal plastisite karşılaştırmalı ayrıntılı çalışmalar geliştirme rahim içinde iletim sonra gergin verir sistem.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan konularda tüm yordamları Hamburg ve Nordrhein-Westfalen, Almanya federal Devletleri kurumsal hayvan etik komiteleri tarafından onaylanmıştır.  Steril aletlerin, koruyucu eldiven ve aseptik kat tüm ameliyat boyunca kullanın.

1 rahim iletim.

  1. Adeno ilişkili virüs tip 1 (AAV1) istenen hedef (4 x 1011 viral parçacıkların/µL, AAV1) için kodlama fosfat tamponlu tuz (PBS) pH 7.4 hazırlayın. 0.1 mg/µL hızlı yeşil ekleyin ve 37 ° C'de AAV1-hızlı-yeşil karışımı tutmak
  2. İnce kılcal bahşiş istediğiniz şekli ile hazırlamak (8 mm uzunluğunda, bir dış çapı 80 µm ve bir iç çapı 50 µm), bir micropipette çektirmenin kullanarak (ayarları: basınç = 500, ısı 700, çekme = = 0, hız = 80, saat = 200, malzemeler tablo bkz: < / c1 >). Böylece 4-5 mm kılcal ucunu kırmak.
  3. Kapiler uç bir aspiratör boru (44 cm x 0.7 cm) Montaj ve AAV1-hızlı-yeşil karışımı 15 µL kılcal damar Aspire edin.
  4. Hayvan konular sürekli fizyolojik vücut ısısı 37 ° c bütün prosedür boyunca tutun.
  5. Hamile C57Bl/6 fare (embriyonik gün 14,5) preincubation odanın içine yerleştirin ve gaz halinde olan yakıtlar % 4 isoflurane fareyle anestezi (hacimsel hava debisi oranı 0,6-0,8 ile L/dk).
  6. Subkutan, buprenorfin (0.1 mg/kg vücut ağırlığı) enjekte et.
  7. İmzalat fare prewarmed cerrahi tabağa (37 ° C) yerleştirin.
  8. Gözleri bir yağ ile kapak.
  9. Fare anestezi maskesi ile uygun (0,6-0,8 hacimsel hava akımı oranında gaz halinde olan yakıtlar % 1.5 isoflurane L/dk) cerrahi plaka ve tıraş karın deri bölgesi. Traş bölgeye betadine solüsyonu ile ve daha sonra 3 X %75 etanol ile silin.
    Not: Nefes alma davranışını imzalat fare sürekli izleyin. Fare inhalasyon Soluk verme desene göre isoflurane gaz konsantrasyonu ayarlayın.
  10. Plantar refleks olmaması için arka pençe parmak kemikleri fare sıkarak kontrol edin.
  11. Karın boşluğu açmak cilt eğri tırtıklı Iris forseps (10 cm) ile sürükleyici ve linea mediana boyunca cilt (10 cm) düz tungsten karbür makasla kesme ve sonra Periton duvar düz Dumont cımbız (12 cm, 0.2 mm ile sürükleyici 0,12 mm) x ve duvar boyunca linea alba ile düz Vanna'nın kesme makası (8 cm).
  12. Karın açılması Poşlu parafin film bir parça yerleştirin ve filmin her iki ucunda mikro-sivrisinek Kan durdurucu sargı forseps (12,5 cm, kavisli) ile düzeltmek.
  13. Rahim boynuzları ile zarar vermemek için embriyolar rahim boynuzları içinde kaşık benzeri bir aletle ortaya çıkarmak. Rahim boynuzları PBS (37 ° C) bir kaç damla damla ve zararların ya da rahim sac içinde malformasyonlar için embriyo incelemek.
  14. Belge düzeni ve pozisyon embriyoların rahim boynuzları. Enjeksiyon için istediğiniz konuma ulaşana kadar embriyolar rahim sac içinde dikkatlice açın.
  15. 1-2 µL AAV1-hızlı-yeşil karışımı enjeksiyon yeri (örneğin, beyin ventrikül) ve bir stereomicroscope altında boya penetrasyon görsel olarak inceleyerek enjekte.
  16. Enjekte embriyo belge ve rahim boynuzları enjekte embriyo ile karın boşluğuna yerleştirin.
  17. Karın boşluğuna PBS (37 ° C) bir kaç damla damla. Kavite Periton duvar (kullanım poliamid 6 0 boyutlu dikiş) ve Halsted'e'nın sivrisinek Kan durdurucu sargı forseps (12,5 cm, kavisli) kullanarak cilt (kullanım poliamid dikiş) 3-0-büyüklük, dikiş kapatın. Alternatif olarak, basit bir kesintiye uğramış desen veya paslanmaz çelik dikiş/zımba karın boşluğu ve cilt kapatmak için kullanın.

2. Telemacrophotography izole dokuların

  1. Arabellekleri hazırlanması
    1. Sörensen'ın arabellek (1 L) eriterek 14.95 g Na2HPO4 ve KH2PO4 1 L 200 devirde karıştırma altında distile su içinde 2.18 g hazırlayın. Perfüzyon geç gebelik pups ve/veya pups içinde doğum sonrası, dönemlere uygun bir boyut iğne karın veya intragastric enjeksiyon için kullanın ve terminal sodyum Fentobarbital anestezi konsantrasyonu 180 mg geçmediği emin olun / vücudun kg ağırlığında.
    2. Mugnaini'nın fiksasyon çözüm (5 L) 500 mL distile su ile 75 ° C Isıtma tarafından hazırlamak ve paraformaldehyde toz karıştırma altında 50 gr 200 rpm'de 5 200 µL ekleme ekleme N NaOH, Sörensen'ın arabelleği ekleyerek 1500 mL, 1750 mL distile su ve % 25 oxazolidin 500 mL. 5000 mL distile su ile doldurun. Bu son arabellek perfüzyon için kullanın.
      Not: Mugnaini'nın fiksasyon çözüm başlık altında hazırlamak, koruyucu gözlük ve duman kaçının. Metilen mavisi (0,05 g/L) perfüzyon daha iyi görselleştirme için ekleyin.
  2. Fare perfüzyon ve doku yalıtım
    1. Transcardially sıvı (durumunda embriyo çalışmalar) transduced embriyo veya istenen yaşta (örneğin, doğum sonrası gün 24) Standart prosedürler6,7göre d. transduced pub taşıyan hamile fareler, mayi terminal sodyum Fentobarbital kullanarak 11,12,13,14,15,16,17, Anestezi (200 mg/kg vücut ağırlığı).
    2. Fareler transcardially enjekte heparin çözüm (500 U) ile fareler demlemek 26 G, 1 iğne've fiksasyon önce kullanarak transcardially 10 mL kan vücuttan dışarı floş ve onları transcardially ile 40 ° C prewarmed Mugnaini'nın 30 mL sıvı için PBS ile fiksasyon çözüm.
      Not: Yetişkin fareler için alternatif bir retrograd perfüzyon abdominal aort14üzerinden gerçekleştirin.
    3. Faiz (örneğin, tüm beyin ya da omurilik) perfused dokusunun yalıtmak ve Mugnaini'nın fiksasyon çözüm için başka bir 24 h 4 ° C'de en az 10 mL dokusunda postfix
    4. Doku PBS 10 mL oda sıcaklığında 3 h için yıkayın.
  3. Özel artı belgelerine gömme ve kesit
    1. Bir tekrarlanabilir parça açısı8,9,ile10özel bir çerçeve içinde izole doku (örneğin, tüm beyin) ayarlayın. Alternatif olarak, bir vibratome bir ayarlanabilir kesme kalınlığı ile kullanın.
    2. Sinir doku çerçevesine yerleştirin, doku telemacrography için ayarlamak ve koordinatları belge.
    3. % 3 düşük erime özel gömme orta hazırlamak: 100 mL Sörensen'ın arabellek özel 3 g ekleyin ve karışımı bir su banyosu ile 90 ° c ısı
    4. %3 özel (30 ° C) doku içeren çerçevesinin içini dökmek. Bir sıcak metal blok ile çerçeve kapak ve sağlamlaştırma tamamlanana kadar bekleyin. Sertleştirme sırasında katıştırılmış doku ve koordinatlarını çerçeve içinde resim için telemacrographic cihazlar kullanın.
    5. Özel katıştırılmış doku kesme boşluklar ilk çerçeve koordinatları için karşılık gelen bir çerçeve içine aktarabilirsiniz.
    6. Bir ince ve titreşimli tıraş bıçağı olan bir cihaz ile istediğiniz kalınlıkta (örneğin, 1.5 mm) bölümlere katıştırılmış doku kesmek ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: Jilet kayma artırmak için katıştırılmış doku üzerine gliserin birkaç damla damla.
    7. PBS her doku bölümünde resim ve belgili tanımlık imge içine a ağıl toplamak.

3. iletim elektron mikroskopi için izole doku hazırlanması

Not: Cam yemekleri ile sıkı bir şekilde closable kapakları başlık altında sallayarak bir platformda, kuluçka tüm diğer adımları gerçekleştirin.

  1. 2 x 30 dk içinde PBS için doku bölümleri yıkayın. Oda sıcaklığında 2 h için % 2 sulu Osmiyum tetroxide çözüm (OsO4) bölümlerinde kuluçkaya.
    Uyarı: Osmiyum tetroxide zehirli ve deri ile temas geldiğinde zararlı olabilir.
  2. 2 x 30 dk içinde PBS için osmicated bölümleri yıkayın.
  3. 10-15 dakika oda sıcaklığında % 30, % 50 ve % 70 etanol bölümlerde kuluçkaya (isteğe bağlı: 4 ° C'de % 70 etanol gecede kuluçkaya).
  4. Sol ve sağ tarafta 45 ° açılı LED RGB ışık8,9,10 (2 x 15 W) altında % 70 etanol osmicated numuneler için örnek uygulamayı görüntü. Siyah yemekler ve mat siyah bir arka plan saçılma ve ışık yansıma aydınlatma sırasında en aza indirmek için kullanın.
    Uyarı: Bölüm görüntüleme sırasında kurumasına izin vermez.
  5. Bölüm resimleri bir atlas serisi bir klasördeki görüntüleri toplayarak koordinatları ile oluşturun.
  6. % 100 etanol (2 x 30 dk için) ve % 100 propilen oksit (2 x 30 dk) oda sıcaklığında numuneler kuluçkaya.
    Uyarı: Bölümler çözümler değiştirirken kurumasına izin vermez.
  7. 260 mL reçine dodecenylsuccinic anhidrit bir cam kap içinde 240 mL cam çubuk ile karıştırarak yavaşça karıştırın. İnhomogeneity, kabarcıklar ve smear için düzenli olarak kontrol edin. Yavaşça, el ile en az 45 dakika karıştırın.
  8. 1:2 ve 1:1 oranında reçine/propilen oksit hazırlamak ve % 3 Hızlandırıcı (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol). Ekle
  9. 1:2 3.8, 2 h ve sonra 1:1 gömme çözümündeki 3.8 için adım 2 h oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde adım çözümden katıştırma dokusunda kuluçkaya.
  10. Doku düz polipropilen yemekleri yer, doku % 3 kısayol tuşu içeren taze reçine ile kapak ve 12-24 h 65-85 ° c doku katıştırılmış tedavi.
  11. Oda sıcaklığı için katıştırılmış doku sakin ve reçine katıştırılmış örneklerden gelen polipropilen yemekler kaldırın.

4. Ultrastructural nöroplastisite parametreleri nicel analiz yelpazesi

  1. İlgi alanı eşleme
    1. İlgi (örneğin, Hipokampus veya beyincik) bir alan seçin ve bu alanı içeren atlas en (Adım 3.5) görüntü seçerek bölüm atlas alanında yerelleştirilmesine.
    2. Bölüm görüntü üzerine ilgi alanı sınırları kroki ve bu bölge sınırları üzerine reçine numune bul/üst üste.
    3. Çizik-işareti bir ince iğne ölçer (26 G, 1 inç) kullanarak reçine numune üzerinde (örneğin, Hipokampus veya beyincik) ilgi alanı sınırları.
    4. Düzeltme için reçine yumuşatmak veya alternatif olarak, bir düzeltme aygıt, ince bıçak veya zımpara kağıdı kullanmak için reçine numune ile 85 ° C arasında bir fırın ısı.
    5. Bir tıraş bıçağı ile reçine örnekten ilgi alanı tüketim ( Tablo malzemelerigörmek). Örnek üzerinde tutan tutkal ile örneğin, ile (çapı 8 mm) ve 1 cm uzunluğunda kalibre gerekli akrilik cam çubukları bağlayın. Yarı - ve ultrathin kesit için monte numune kırpın.
    6. Semithin (0,75 µm) hazırlamak ve ultrathin (70 nm) bir ultramicrotome kullanarak bölünen alanı bölümleri: 1,5 mm/s 0,75 µm kalınlık ve 0.7 mm/s'de 70 nm kalınlık ayarlamak.
    7. Semithin bölümleri cam taşıyıcılara toplamak ve % 1 toluidin bölümlerle (4 min için) PBS mavi leke.
    8. Bölümlerde birkaç kez deiyonize suyla yıkayın. 4 x kullanarak ışık mikroskop altında lekeli kısımlar inceler (0.1 ∞ NA /-), 10 (NA 0,22 ∞/0.17), x 40 (0.65 ∞/0.17 NA), x ve 100 x (NA 1,25 ∞/0.17) hedefler.
    9. Ultrathin bölümleri nikel Izgaralar üzerinde toplamak. Izgaralar TEM için 180 konu kV ve 3, 200 x, 6, 000 x ve/veya 8.000 x büyütme.
  2. TEM analizi
    1. Nicel TEM analiz (örneğin, boutons veziküller ve mitokondri veya myelinated ve nonmyelinated akson ile) için ilgi ultrastructural parametrelerini seçin ve bu parametrelerin 3 altında 500 x, 6.000 x ve/veya 8.000 x büyütme TEM fotoğraf çekmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Güvenilir ve hızlı anestezi farelerin için çok sayıda güvenlik parametreleri kabul edildi ve en iyi duruma getirilmiş bir çalışma alanı anestezi biriminin yeterli (şekil 1A) kanıtladı. Birimi fare ve sıçanlar gibi küçük hayvanlar üzerinde başarılı ameliyat için gerekli bir hassasiyetle sıvı isoflurane ve ortam havası karışımı kontrol etmek için tasarlanmıştır. Hava ve isoflurane Buharlaştırıcı istenen ayarlara göre karışık ve bir kutu içine v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok önemli bir adım rahimde iletim / enjeksiyon işlemdir. Hassas Enjeksiyon beyin ventrikül veya ilgi başka bir alan içine deneyim ve uygulamalı beceri gerektirir. Daha ince microcapillary uç, daha az doku hasarı oluşabilir; Ancak, bu enjeksiyon basıncı arttırmak pahasına. Rahimde elektroporasyon19,20,21,22aksine, enjekte embriyo rahimde iletim sonra hayatta kalma oranı çok yüksektir. Embriyola...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar meslektaşları hayvan tesisi Tıp Fakültesi, Bochum Ruhr Üniversitesi, onların desteği ve hayvan bakımı için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2,4,6-Tris(dimetil-aminometil)fenolServa36975
26 G x 1'' iğneHenke-Sass, Wolf GmbH
410 Hava pompası için Anestezi ÜnitesiBiyomedikal Aletler (Univentor)8323102
Adeno ile ilişkili virüs serotip 1 (AAV1)UKE (Viral Çekirdek Tesisi)-AAV1'in referansları ve hedef alanları için bakınız: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ ve ayrıca: Tasarımcı gen dağıtım vektörleri: gelişmiş gen transferi için adeno-ilişkili viral vektörlerin moleküler mühendisliği ve evrimi. Kwon Ben, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mart; 25(3):489-99. 1, 2 ve 5 serotiplerinden viral kapsidlerle psödotiplenmiş rekombinant AAV viral vektörleri, merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerine verildikten sonra diferansiyel verimlilik ve hücre tropizmi gösterir. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Öğr. 2004 Ağustos; 10(2):302-17. Kendini tamamlayan rekombinant adeno-ilişkili virüs (scAAV) vektörleri, DNA sentezinden bağımsız olarak verimli transdüksiyonu destekler. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gen Ther. 2001 Ağustos; 8(16):1248-54.
AgaroseSigma-AldrichA9414düşük jelleşmeli agaroz
Hava Pompası BiyomedikalAletler (Univentor)Eheim 100
AralditeCIBA-GEIGY23857.9tertibatlarının gömülmesi için reçine
Sigma-AldrichA5177-5EA
Solunum Maskesi Fare Eloksallı AlüminyumBiyomedikal Aletler (Univentor)-
buprenorfinTemjezikampullerağrı kesici
kılcal damarlarBilim-ÜrünlerGB100TF-10dolgulu
Dodecenylsüksinik anhidritFluka44160
Dumont cımbız (#3, 12 cm, düz, 0,2 x 0,12 mm)FST11203-23
elektrikli tıraş makinesiPhillips-
Ethicon sütürler (Ethilon, 6-0 ve 3-0)EnjekteEthicon-polyamid
göz yağlayıcıBepanthene-Fast
GreenSigma-AldrichF7252
Gaz Yönlendirme Anahtarı 4/2 konektörlerBiyomedikal Aletler (Univentor)8433020
durmuş Sivrisinek hemostatik forseps (12,5 cm, düz)FST13011-12
Heparin-NatriumRatiopharm25 000 IE/5 mL
Yatay hareket eden kapaklı fareler
için indüksiyon kutusu.
İç boyutlar: UxBxY: 155 mm x 115 mm x 130 mm.
Duvar kalınlığı: 6 mm		Biyomedikal Aletler (Univentor)-
iris forseps (10 cm, kavisli, tırtıklı)FST14007-14
iris makası (11 cm, düz, tungsten karbür)FST14501-14
Isofluran OP Tisch, elektrikle ısıtılan, sm
Dış boyutlar: 257 mm x 110 mm x 18 mm.
Isıtma alanı: 190 mm x 90 mm
Solunum maskesinden kaçan izofluran
çıkarılması
yönetmeliklerine uygun olarak aşağı doğru çıkarılır		Biyomedikal Aletler (Univentor)-
izofluran (Attan)JD medikalinhalasyon anestezi
LED RGB ışıklarıCameoCLQS15RGBWLED'ler 2 x 15 W
Işık mikroskobu Temel DM ELeica-4x(N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) hedefler
mikropipet çektirmeBilim-ÜrünlerP-97
Sivrisinek hemostatik forseps (12.5 cm, kavisli)FST13010-12
Nikel ızgaralar, 200 ağTed Pella1GC200
Osmiyum (VIII)-oksideDegussa73219
Propilen oksitFluka82320
tıraş bıçağıSchick87-10489
Sodyum pentobarbital (Narcoren)Merial GmbH-
TC01mR 1-Geri beslemeli kanal sıcaklık kontrol cihazıBiyomedikal Aletler (Univentor)-
Technovit 4004 iki bileşenli yapıştırıcıKulzer
TelemacrodeviceCanon-CanonSpiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objektif, 150 mm'nin altında uzatma, Manuel Uzatma Tüpü 7 mm halka, 14 mm halka, 28 mm halka, Makro ters halka (58 mm), Canon fotokopi standı.
Thermopuller P-97SutterInstruments-ince
titreşimli tıraş bıçağı cihazıKrup-Szaboile ince bıçaklar
toluidin mavisiSigma-Aldrich89640
Transmisyon elektron mikroskobu C20Phillips-200kV'a kadar
Tygon 6/4 Tüm parçaların bağlantısı için boru malzemesi
Dış çap: 6 mm
İç çap: 4 mm
Wa
ll kalınlığı: 1 mm		Biyomedikal Aletler (Univentor)-
Ultracut EReichert-Jung-ultramikrotom
Univentor ÇöpçüBiyomedikal Aletler (Univentor)8338001
Vannas makas (8 cm, düz)FST15009-08
doku aspiratörü ayar edilen sıvıların görselleştirilmesi için .

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159(1961).
  2. Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
  3. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
  4. Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
  5. Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
  6. Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
  7. Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
  8. Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139(1974).
  9. Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
  10. Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
  11. Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
  12. Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
  13. Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169(1967).
  14. Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
  15. Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
  16. Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
  17. Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84(2014).
  18. Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48(2017).
  19. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
  20. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960(2012).
  21. Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
  22. Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Transmisyon Elektron MikroskopisiSinaptik Buton AnaliziMiyelin K l f Kal nlDoku Atlas NavigasyonuOsmiyum Tetroksit BoyamaUltramikrotom Kesit AlmaAdeno li kili Vir s EnjeksiyonuEmbriyonik Fare Beyni

İlgili makaleler