Method Article

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/59189

⸱

May 10th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Otology, Shengjing Hospital of China Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda normal farelerde morfolojik özellikleri ve kurdele sinüslerinin fonksiyonel durumunu değerlendirmek için deneysel bir protokol açıklanmaktadır. Bu model aynı zamanda gürültüye bağlı ve yaşa bağlı Cochlear synaptopathy-kısıtlanmış modeller için de uygundur. Önceki fare çalışmalarından gelen göreli sonuçlar da tartışılmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cochlear iç saç hücreleri (ıhcs), şerit sinaps ile Spiral ganglion nöronlara (SGNs) akustik sinyalleri iletir. Çeşitli deneysel çalışmalar saç hücrelerinin sinaps sensorineval işitme kaybı (SNHL) ilk hedefler olabilir belirtti. Bu tür çalışmalar koklear "synaptopathy" kavramını önermiştir, hangi Şerit sinaps numarası, yapı veya fonksiyon değişiklikler anlamına gelir, ıhcs ve Sgns arasında anormal sinaptik iletim neden. Cochlear synaptopathy geri dönüşümsüz durumdayken işitme eşiğini etkilemez. Gürültü kaynaklı deneysel modellerde, belirli frekans bölgelerinde ıHC sinaps sınırlı hasar özellikle synaptopathy neden çevresel faktörleri belirlemek için istihdam edilir, yanı sıra bu iç kulak rahatsız edici fizyolojik sonuçları Devre. Burada, yetişkin fareler belirli bir frekans bölgesinde Cochlear sinaptik Morfoloji ve fonksiyon analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, belirli frekans bölgelerinin Cochlear lokalizasyonu, kokleogram verileriyle birlikte yer frekansı haritaları kullanılarak gerçekleştirilir, bu da şerit sinapsların morfolojik özelliklerinin sinaptik ile değerlendirildiği aşağıdaki immün boyama. Şerit sinapsların fonksiyonel durumu daha sonra işitsel beyin tepkisinin genlikleri göre belirlenir (ABR) dalga ı. Bu rapor, bu yaklaşımın, yeni terapötik müdahalelerin gelişmesine yardımcı olabilecek koklea 'daki sinaptik disfonksiyon patogenezi ve mekanizmalarının anlayışımızı derinleştirmek için kullanılabileceğinizi göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaklaşık aralığında Frekanslar 20 \ u201220, 000 Hz insanlar tarafından işitsel uyaranlara olarak algılanabilir. İnsan işitme normalde en 1.000 Hz, Ortalama ses basıncı düzeyi 20 μPa genç yetişkinlerde (yani, 0 desibel ses basıncı seviyesi [dB SPL]) yakın duyarlıdır. Bazı patolojik koşullarda, işitme kaybı belirli frekanslarla sınırlıdır. Örneğin, gürültü kaynaklı işitme kaybı (NIL) erken aşamalarında, bir "çentik" (yani, işitme eşik yüksekliği) 4 kHz1' de odyogram görülebilir. Memelinin koklear bölme boyunca, sertlik ve kütle geçişte bir üstel frekans Haritası üretir, koklea tabanında yüksek frekanslı ses algılama ve Apex2düşük frekanslı algılama. Aslında, baziler membranı boyunca koklear yer-frekans haritası vardır, tonotopik organizasyon2,3olarak bilinen ne yol. Baziler membranında verilen her yer, genellikle karakteristik frekans3,4olarak adlandırılan sadece bir özel ses frekansına en yüksek hassasiyete sahiptir, ancak diğer frekanslara tepkiler de görülebilir.

Bugüne kadar, işitsel sistemde normal fonksiyon, patolojik süreçler ve terapötik etkinliği araştırmak için çeşitli fare modelleri kullanılmıştır. Fare koklea 'daki fizyolojik parametrelerin kesin bilgisi, işitme kaybı gibi çalışmalar için ön şarttır. Fare koklea anatomik olarak, farklı frekans bölgelerine karşılık gelen apical, orta ve bazal dönüşler ayrılmıştır. Koklea 'daki ilgili periferik innervasyon sitelerini analiz etmek için Cochlear çekirdeğinde işitsel sinir afferentleri etiketleyerek, Müller ve al. normal fareyle saat5' te koklear yer-frekans haritasını kurmayı başardı. % 90 ile baziler membranın tam uzunluğunun% 10 ' una karşılık gelen 7.2 – 61.8 kHz aralığında, fare koklear yer-frekans Haritası basit bir doğrusal regresyon fonksiyonu ile tarif edilebilir, Koklear tabanından normalleştirilmiş mesafe ve karakteristik frekans5logaritma. Laboratuar farelerinde, yer-frekans Haritası, belirli frekans aralıkları içinde işitme eşikleri arasındaki ilişkiyi keşfetmek ve baziler membranı boyunca göreli bölgelerde eksik saç hücrelerinin sayısını gösteren kokleogramlar için kullanılabilir6. Daha da önemlisi, yer-frekans Haritası, periferik işitsel travma 7 ile farelerde belirli koklear frekans lokasyonlarında saç hücrelerinin şerit sinaps hasar gibi minimal yapısal hasar, soruşturma için bir konumlandırma sistemi sağlar ,8.

Memelide koklea 'da, şerit sinapslar, IFC içinde glutamat içeren serbest hazır sinaptik veziküllerin bir Halo ve SGN sinir terminalinde postsinaptik yoğunluk olan bir elektron-yoğun projeksiyon olan bir presinaptik şerit oluşur. glutamat reseptörleri ile9. Koklear ses dönüştürücürü sırasında, saç hücresi paketinin sapması ıFC depolarizasyonunu elde eder, bu da ıhcs 'den postsinaptik afferent terminallerine glutamat salınmasına yol açar ve böylece işitsel yolu aktive eder. Bu yolun aktivasyonu, ses kaynaklı mekanik sinyallerin SGN10' daki bir oran koduna dönüştürülmesine yol açar. Nitekim, IHC şerit sinaps yüksek temporal hassasiyet ile Hertz yüzlerce oranlarda yatıştırıcı ses iletimi için son derece uzmanlaşmıştır ve ses kodlaması presinaptik mekanizmaları için kritik öneme sahiptir. Önceki çalışmalar şerit sinaps yetişkin fare koklea11,12, büyük olasılıkla belirli ses için kodlama yapısal adaptasyon yansıtan farklı frekans bölgelerinde boyut ve sayı büyük farklılık ortaya çıktı hayatta kalma ihtiyaçları. Son zamanlarda, deneysel hayvan çalışmaları, koklear synaptopati gürültü kaynaklı işitme kaybı, yaşa bağlı işitme kaybı ve kalıtsal işitme kaybı da dahil olmak üzere birden fazla işitme bozukluğu formlarına katkı gösterdiğini göstermiştir13, 14. böylece, belirli frekans bölgelerinde sinaptik sayı, yapı ve fonksiyonlarda korelasyon değişiklikleri tanımlamak için yöntemler giderek işitsel gelişim ve iç kulak hastalığı çalışmalarında istihdam edilmiştir, aracılığıyla oluşturulan modelleri kullanarak genetik veya çevresel değişkenlerin deneysel manipülasyon15,16,17.

Mevcut raporda, Yetişkin farelerde baziler membranın belirli bir frekans bölgesinde sinaptik sayı, yapı ve fonksiyon analizi için bir protokol sunuyoruz. Koklear frekans lokalizasyonu, bir kokleogram ile birlikte belirli bir yer frekans Haritası kullanılarak gerçekleştirilir. Koklear şerit sinapsların normal morfolojik özellikleri presinaptik ve postsinaptik immünosteme yoluyla değerlendirilir. Cochlear Ribbon sinapslarının fonksiyonel durumu, ABR dalgası ı 'nin suprathreshold amplitüllerine göre belirlenir. Küçük değişikliklerle, bu protokol, fareler, kobay ve gerbils gibi diğer hayvan modellerinde fizyolojik veya patolojik koşulları incelemek için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler, Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı (8. baskı) için NRC/ıLAR Kılavuzu uyarınca gerçekleştirilmiştir. Çalışma protokolü, kurumsal hayvan bakımı ve sermaye Tıp Üniversitesi kullanım Komitesi, Pekin, Çin tarafından onaylandı.

1. hayvan seçimi

  1. Tüm deneyler için, Yetişkin C57BL/6J erkek fareler (8 hafta eski) hayvan modeli olarak kullanın.
    Not: C57BL/6J fareler Cdh23 sergi bir splice varyant taşıyan işitsel sistemde hızlandırılmış yaşlanma, koklea bazal dönüşte şerit sinsler bir% 40 kaybı olarak yansıtılır ve 6 yaş orta dönüş% 10 kayıp, takip hızlı 18yaş,19ile tüm koklea 'da bu kaybın artması. Böylece, işitme araştırması için 6 aydan büyük C57BL/6J fareler kullanırken dikkatli olmanızı öneriyoruz. Farelerin diğer suşları belirli Deneysel amaçlar bağlı olarak kullanılabilir.
  2. İşitme değerlendirmelerinden önce dış veya orta kulak patolojilerini ele almak için profesyonel bir teşhis cep otokapsamı kullanarak fareler inceleyin. Potansiyel işaretler, dış işitsel kanalda sıvı veya irin, yerel dokuda kızarıklık ve şişlik ve Timpanik membran perforasyonu içerebilir.
    Not: Bu nadiren karşılaşılsa da, bir kez belirlendiğinde, dış veya orta kulak hastalıkları olan fareler hariç tutulmalıdır.

2. işitme değerlendirmesi

  1. Ketamin hidroklorür (100 mg/kg) ve xylazine hidroklorür (10 mg/kg) karışımı intraperitoneal enjeksiyon kullanarak anestezize fareler. Anestezi derinliği ağrılı uyaranlara (örneğin, Toe-tutam refleks) ile Yargıç.
    Not: Toe-tutam refleks tamamen yokken, hayvan işitsel testler için yeterli anestezi derinliğine ulaştı. Bilateral ABR kayıtları için daha fazla zaman gerekiyorsa, orijinal anestezik uçağı geri yüklemek için anesteziklerin daha düşük bir dozajı (bir beşinci orijinal doz) yönetin. Bu fareler ölüme yol açabilir gibi, anestezik aşırı doz önlemek için dikkat alın.
  2. 37,5 °C ' de anestezik hayvanın vücut sıcaklığını, termoreglama ısıtma yastığı kullanarak koruyun. İşitme testi boyunca paraziti önlemek için anestezize edilmiş hayvanı elektrik ve akustik olarak korunan bir odaya yerleştirin.
    Not: Anestezi sonrası hipoterminin neden olduğu ölümü önlemek için hayvan tamamen uyanık olana kadar tüm prosedür süresince fizyolojik sıcaklığı koruyun.
  3. Alt dermal iğne elektrotları (20 mm, 28 G) kafatası köşesinin (kayıt elektrot), ölçülen kulak Pinna altında ipsilateral parotis bölgesinde (referans elektrot), ve Kontralateral Parotis bölgesinde (zemin elektrot), 3 mm derinliği ile Fare kafası cilt altında, sırasıyla20.
  4. Koni şeklinde bir uç ile 2 cm 'lik plastik tüp aracılığıyla Akustik Stimülasyon yapmak için kapalı alan hoparlörü kullanın. Ucu dış kulak kanalına sığdırın21.
    Not: Kayıt ve referans Elektrotlardaki elektrik empedansı 3 kOhm 'den (genellikle 1 kOhm) az olduğundan emin olun. Empedans yüksek ise, elektrot ekleme sitesini değiştirmek, alkol ile elektrot temizleyin, veya ABR dalga genlik değişiklikler önlemek için elektrot yerine.
  5. ABR kaydı için ton Pip (3 MS süresi, 1 MS yükselişi/sonbahar süreleri, 21.1/s, frekans: 4 – 48 kHz) oranında üretir ve 90 'den 10 dB 'de 5 \ u201210 dB SPL adımlarında20' ye kadar SPLs azaltır. Bu adımda, yanıtlar (10.000 kez), filtrelenmiş (0,1 – 3 kHz) ve ortalamalı (1.024 numune/Stimulus seviyesi) amplifikatörlere aittir.
    Not: ABRs, 10 dB adımda her uyarıcı seviyesi için, eşiğin yakınında ek 5 dB adım ile toplanır.
  6. Her frekansında, en az SPL 'ye başvuran, görsel muayene ile açıkça tanımlanabilen bir veya daha fazla ayırt edici dalgayla güvenilir bir ABR kaydı ile sonuçlanan ABR eşiğini belirleyin (Şekil 1).
    Not: Dalga formlarının tutarlılığı sağlamak için genellikle eşik etrafında düşük SPLs sürecini tekrarlamak gereklidir. Yanıt eşiği, dalga formunun izleneceği en düşük uyarıcı düzeydir ve 5 dB azalma dalga formunun kaybolmasına yol açacaktır.

3. koklear doku Işleme

  1. ABR kayıt olduktan sonra, servikal dislocation yoluyla anestezize fareler ötenize, onları döven, ventral taraftan bulla maruz, ve koklea erişmek için keskin makas ile açık.
  2. İnce bir forseps kullanarak, temporal kemikleri çıkarın, stapes arter koparma, oval pencereden stapes kaldırmak ve yuvarlak pencere membran rüptürü. İğne ucunu hafifçe çevirerek koklea 'nın tepesinde küçük bir delik yapın (13 mm, 27 G).
  3. 0,1 M fosfat-tamponlu tuzlu (PBS, pH 7,4) bir gecede 4 °c ' de% 4 (WT/Vol) civarında formaldehite ile yalıtılmış kemikleri düzeltin. İnce uçlu bir pipet kullanarak, oval veya yuvarlak pencerelere (giriş olarak) ve tepe kısmında (bir çıkış olarak) açılışa uygulama yoluyla perilenfatik boşluklarla hafifçe saplı fikfatif.
    Not: Bazı proteinler immünolabeling için kendi epitopları imha önlemek için fikhasyon kısa bir süre gerektirir. Bu gibi durumlarda, üreticinin immünhistokimya talimatlarına bağlı olarak 2 saat boyunca oda sıcaklığında (RT)% 4 civarında formaldehite içinde kemikleri inkük. Aynı zamanda, koklear kanı çıkarmak için kardiyak perfüzyon yoluyla da yapılabilir, özellikle koklear synaptopati fare modellerinde, daha sonraki aşamalarında spesifik olmayan lekeleme nedeniyle arka planda gürültü kaçınarak.
  4. Kalıntı paraformaldehyde kaldırmak için 0,1 M soğuk PBS ile 5 dakika için kemikleri üç kez durulayın. % 10 ethylenediaminetetraasetic asit (EDTA) ile kemikler, 4 h için RT veya 24 h için 4 °C ' de, 20 RPM 'de yatay Çalkalamalı yumuşak sallama yoluyla aşındırın. EDTA ortasında yenilenebilir.
    Not: Dekonfikasyon süreleri EDTA ve kullanıcıların tercihlerinin konsantrasyonuna tabidir. Decalcified doku tokluk belirli bir derecede korumak gerekir, hangi daha sonra adımlarla koklear tüm bağlar izole manipülasyon kolaylaştırır. Temporal kemikler dönme ile% 10 EDTA içinde decalcified olabilir, araştırmacılar ABR testleri ve fikrasyon deneyleri takiben laboratuar terk etmek için izin. Kireç çözücü süresi 4 °C ' de 20 ila 30 saat aralığında esnektir.
  5. Bir decalcified temporal kemik EDTA 0,1 M PBS transfer. #3, #5 Dumont forseps ve 27 G iğne kullanarak apical, orta ve bazal koklear bölgeleri sırayla inceleyebilir ve ardından koklea 'yı bir stereo Diseksiyon mikroskobu altında kemikten dışarı çıkarmaz (daha önce22' de açıklandığı gibi). Bir jilet kullanarak spiral bağ boyunca küçük kesikler bir dizi olun ve tektorik membran ve Reissner membranı çıkarın (Şekil 2).
    Not: Disseke koklea bozulmamış olduğu sürece, bu süreç bireysel operatörün olağan protokolüne göre değiştirilebilir.
  6. Spiral limbus dahil olmak üzere kalan işitsel Epitelyumu, tüm montaj preparatları için bireysel kokülerin (tepe, orta ve kancalı bölge ile baz) içine daha fazla kesin.
  7. Işık mikroskobu 40 x yağ amacı altında, IHCs Stereocilia boyunca ayarlanabilir mercek içinde yerleştirilen bir 250 μm ölçekli baziler membran uzunluğunu ölçmek.
  8. Her bir koklear dönüş uzunluğunu (segment başına 250 μm) tüm segment uzunlukları ekleyerek hesaplayın ve her dönüş uzunlukları özetleyerek baziler membranı toplam uzunluğunu elde.
  9. Kanca bölgesi dahil olmak üzere baziler membranın toplam uzunluğunu, kokludan uzaklığa göre bir yüzdeye dönüştürün (% 0, kokluya,% 100 ' i koklear üssüne ifade eder).
  10. Bu mesafeyi, bir Logaritmik fonksiyon (d (%) = 1-156,5 + 82,5 × log (f) kullanarak Cochlear karakteristik frekansına dönüştürdükten sonra, d (% 1,25 mm/oktav) bir eğim ile, bu da b , kokapenin yüzde cinsinden normalleştirilmiş uzaklığı kHz 'de frekans), daha önce5,6açıklandığı gibi. Böylece her koka dönüşte baziler membranı ilgili bir alanda frekans aralığı elde edilebilir.

4. immünofluorescence boyama

  1. Diseksiyon sonrası, her bir koklear dönüşün ayrı 2,5 mL santrifüjli tüpüne yerleştirin ve% 10 keçi serum/PBS/0.1% Triton 100 X
  2. Bir Diseksiyon mikroskobu altında 200 μL pipet ucu kullanarak her tüpten yukarıdaki engelleme/geçirgenleştirme çözümünü çıkarın ve numuneleri% 5 keçi serum/PBS/0.1% Triton X-100 bir gecede 4 °C ' de bir rotator 'da seyreltilmiş primer antikorlarla kuluçta yapın.
    Not: Cochlear sinaptik kurdeleler immünolabeling için, presinaptik Marker fare Anti-karboksil-Terminal bağlayıcı protein 2 IgG1 (CtBP2, rıbeye iskele protein B alanı etiketleme, 1:400) ve postsinaptik Marker fare Anti-glutamat reseptör 2 kullanın IgG2a (GluR2, AMPA reseptörü bir alt birim etiketleme, 1:200)23.
  3. 0,1 M soğuk PBS ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın ve kalan primer antikorları kaldırın ve numuneleri% 5 keçi serum/PBS/0.1% Triton X-100 ' de RT 'de 2 \ u20123 h 'de bir rotator üzerinde sulandırılmış ikincil antikorlar ile kulyın.
    Not: uygun ikincil antikor karışımları keçi Anti-fare Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) ve keçi Anti-Mouse Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500) kullanarak hazırlayın, hangi birincil antikorlar için tamamlayıcı olan adım 4,2 kullanılır. Sinaptik şeritler için etiketleme verimliliğini artırmak için, belirli ikincil antikorlar seçmenizi öneririz. Bazı Labs GluR2 immünolabeling artırmak için ikincil antikorlar ile inkübasyon uzatmak24.
  4. 0,1 M PBS ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın ve kalan ikincil antikorları çıkarın ve numuneleri 2,5 mL santrifüjten 35 mm plaka ile 0,1 M PBS 'ye aktarın.
  5. Slayt üzerine 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) içeren bir montaj ortamı damlası yerleştirin ve numuneleri PBS 'den montaj ortamına aktarın. Slayt ve serbest lamel magazini yavaşça düşmek izin bir lamel magazini bir kenarı yerleştirin.
    Not: Saç hücrelerinin yukarı doğru yüzmesini sağlamak ve prosedür sırasında koklear numunelerin katlama veya büküm oluşmadığından emin olmak için, koklear numuneleri stereo Diseksiyon mikroskobu içine monte edin.
  6. Slaytları 4 °C ' de bir slayt kutusuna yerleştirin ve slaytlar kuru ve ardından lazer Konfokal mikroskop altında görüntü sağlar.

5. Cochlear Ribbon synapses 'in morfolojik değerlendirilmesi

  1. Üç lazer ile bir konfokba mikroskop kullanarak görüntü slaytlar — bir 405 nm UV diyot, bir 488 nm argon lazer, ve bir 561 nm diyot pompalı Solid-State (DPSS) lazer DAPı heyecanlandırmak için (Excitation spektrum 409 – 464 Nm), Alexa Fluor 488 (Excitation spektrum 496 – 549 Nm) ve Alexa Fluor 568 (Uyarma spektrum 573 – 631 Nm), sırasıyla.
  2. 63x yüksek çözünürlüklü yağ daldırma merceği kullanılarak her bir kokulanın 8 μm mesafesine kadar Konfokal z-yığınları kazanın.
    Not: Bir kez tanımlanmışsa, fotomikografiler için tüm parametreler kaydedilmeli ve tüm slaytlara eşit şekilde uygulanmalıdır.
  3. Sinaptik punktum sayıları için, z-yığınları (0,3 μm adım boyutu) IHS tüm uzunluğunu yayılma, böylece tüm sinaptik puan görüntü olabilir sağlanması ayarlayın.
  4. Z-ekseni projeksiyon elde etmek için bir z-yığınında puan içeren görüntüleri birleştirin ve görüntü işleme yazılımına içe aktarın.
  5. Her IFC için sinaptik puan sayısını hesaplamak için (DAPI nükleer manuel sayar eşit) ıhcs sayısı ile belirli frekans bölgelerinde her z-yığını sinaptik toplam sayar bölmek. Her belirli frekans bölgesinde, 9 – 11 ıhcs içeren farklı mikroskobik alanların üç görüntüdeki tüm sinaptik puan ortalama.
    1. Her IHC 'nin bazolateral bölgeleri de dahil olmak üzere ilgi alanları (ROI) serbest seçimler düğmesini kullanarak özetlemektedir. Yakın bitişik noktalar arasında ayrım yapmak için puncta ve su dökme fonksiyonunun otomatik ölçülmesi için Ölçü fonksiyonunu kullanın.
    2. Her otomatik sayma işleminden sonra, delik sayımı güvenilir olmasını sağlamak için manuel düzeltmeler ile görsel denetimler gerçekleştirin.
      Not: Denemeler, slaytın tepe, orta veya bazal dönüşün koklea 'dan olup olmadığı gibi kör kalmalıdır.
  6. Görsel olarak sinaptik yapı ve dağıtım değerlendirmek, el Kalem aracı tarafından komşularından bireysel ıhcs izole etmek (M) daha iyi sitroiskelet mimarisi ve sinaptik lokalizasyonu görselleştirin.
  7. Presinaptik kurdeleler (CtBP2) ve postsinaptik reseptör yamaları (GluR2), dikdörtgen Marquee aracı tarafından şerit etrafında Voksel boşluk ayıklamak ve kırpmatarafından bireysel şerit izole kontrol etmek için. Görüntü > görüntü boyututıkladıktan sonra, bu minyatür projeksiyonların bir küçük dizi elde, hangi daha sonra eşleştirilen sinaps tanımlamak için kullanılabilir (yakından CtBP2-pozitif ve GluR2-pozitif puncta çiftleri olarak ortaya çıktı) karşı yetim şeritler (eksik postsinaptik glutamat reseptör yamaları) (Şekil 3).
    Not: Normal koksinslar saç hücresi içinde presinaptik kurdele kombine immunolabeling olarak görünür (Anti-CtBP2) ve işitsel sinir terminalinde postsinaptik glutamat reseptör yama (Anti-GluR2)25. Bazı Labs sinaptik yama boyutu veya hacim26,27ölçmek için 3D modelleme ile birlikte Konfokal projeksiyonlar kullanın. Önce şerit sinaps önemli kaybı, şeritler boyutu veya eşleştirilmiş glutamat reseptör yamaları olmadan değişiklikleri sergileme muhtemelen sinaptik disfonksiyon göstergesidir27,28.

6. Cochlear Ribbon synapses fonksiyonel değerlendirme

  1. Her frekans uyarıcı için tüm ABR dalgalar toplamak bir SPL sunulan 90 dB suprathreshold ABR dalga analizi için genlikleri.
    Not: Nörofizyoloji ve morfolojik çalışmalar, düşük spontan oran, yüksek eşik liflerinin yaşlanma ve gürültü pozlama29,30için özellikle savunmasız olduğunu göstermiştir. Şerit sinapsların basit kaybı ABR eşikleri etkilemez rağmen, genellikle ABR dalga ı amplitütler önemli azalma sonuçları, çünkü bu afferentleri düşük spontan oran, yüksek eşik lifleri ve yüksek spontan-Rate, düşük eşik lifleri Cochlear sinir liflerinin toplanan faaliyetlerine ağır katkı sağlar28,29,31. 90 dB SPL 'nin suprathreshold yoğunluğu burada seçilir.
  2. Bir çevrimdışı analiz programı (Şekil 4) kullanarak zirve-to-Peak dalga ı genlik belirleyin. ABR testinde her dalga ben bir başlangıç pozitif (p) sapması ve sonraki negatif (n) saptırma oluşur. ABR dalga ı amplitül IP (dalga ı pozitif zirve) ve ın (dalga ı)29negatif zirve arasındaki voltaj farkı olarak tanımlanır.
    Not: Patolojik koşullarda, koklear synaptopati, ABR dalgası ı 'nin suprathreshold amplitüslerine göre tespit edilebilir, bu da ses ile uyarılan SGNs 'in toplanan başlangıçlı yanıtlarını yansıtır. Ancak, OHC disfonksiyon nedeniyle tehlikeye değil koklear duyarlılığı bu yöntem için bir önkoşuldur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anestezi altında 10 C57BL/6J fare (8 hafta) için ABR İşitme testleri yapıldı. ABRs 4, 8, 16, 32 ve 48 kHz 'de ton patlaması uyarıcıları kullanılarak ortaya çıkmış. Her hayvanın işitme eşiği, ABR 'de en az bir net dalga formunu ayırt ederek görsel olarak algılanır. Tüm fareler, uyarıcı frekansına bağlı olarak 25 ile 70 dB SPL arasında değişen ton patlamalarına yanıt olarak ABR eşiklerini sergiledi. Sonuçlarımız, işitme eşiğinin 16 kHz 'de (Şekil 1) en düşük olduğu, kokainin yaklaşık% 43 mesaf...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cochlear synaptopathy ilk olarak, 2 saat31Için 100 dB SPL 'de 8 \ u201216 kHz oktav Band gürültü tarafından indüklenen geçici eşik KAYMASı (TTS) ile yetişkin farelerde karakterize edildi, araştırmacılar giderek çeşitli içinde synaptopati etkilerini araştırdılar memeliler, maymunlar ve insanlar dahil32,33. Gürültü maruz kalma ek olarak, diğer bazı koşullar Cochlear synaptopathy ile ilişkili olmuştur (örneğin, yaşlanma, ototoksisik ilaçların...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81770997, 81771016, 81830030) tarafından destekleniyordu; Pekin doğal Bilim Vakfı ve Pekin Eğitim Komitesi (KZ201810025040) ortak fon projesi; Pekin doğal Bilim Vakfı (7174291); ve Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (2016M601067).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ketamin hidroklorürGutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, ÇinH35020148100 mg / kg
Ksilazin hidroklorürSigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABDX-125110 mg / kg
TDT fizyoloji cihazıTucker-Davis Teknolojileri, Alachua, FL, ABDİşitsel Fizyoloji Sistemi III
SigGen / BioSig yazılımıTucker-Davis Teknolojileri, Alachua, FL, ABDİşitsel Fizyoloji Sistemi III
Elektrikli PedPet Fun11072931136
Dumont forseps 3#Güzel Bilim Araçları, Kuzey Vancouver, B.C., Kanada0203-3-PO
Dumont forseps 5#Güzel Bilim Araçları, Kuzey Vancouver, B.C., Kanada0209-5-PO
Stereo diseksiyon mikroskobuNikon Corp., Tokyo, JaponyaSMZ1270
Keçi serumuZSGB-BIO, Pekin, ÇinZLI-9021
Anti-glutamat reseptörü 2, hücre dışı, klon 6C4Millipore Corp., Billerica, MA, ABDMAB397fare ve nbsp;
Saflaştırılmış Fare Anti-CtBP2BD Biosciences, Billerica, MA, ABD612044fare 
Alexa Fluor 568 keçi anti-fare IgG1antikorThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ABDA21124keçi
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG2a antikoruThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ABDA21131keçi
DAPI ZSGB-BIO içeren montaj ortamı, Pekin, ÇinZLI-9557
Konfokal floresan mikroskobuLeica Microsystems, Wetzlar, AlmanyaTCS SP8 II
Image Pro Plus yazılımıMedya Sibernetik, Bethesda, MD, ABDsürüm 6.0
Profesyonel teşhis cep otoskopuLude Tıbbi Cihaz ve Aletler Ticaret A.Ş., Şangay, ÇinHS-OT10
İğne elektrotDostluk Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, Çin102920 mm, 28
G Kapalı alan konuşmacıTucker-Davis Teknolojileri, Alachua, FL, ABDCF1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056(2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341(2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054(2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907(2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ribbon SynapsesCochlear LocalizationAuditory Brainstem ResponseSynaptic ImmunostainingConfocal MicroscopyBasilar MembraneInner Hair CellsSpiral Ganglion NeuronsPlace Frequency MapsCochleogram Data

Related Articles