Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

Summary

Geleneksel overexpression cDNA tabanlı teknikleri sınırlı uygulanabilirliği için potansiyel işlevselliği ile birden çok ek yeri formlarını nedeniyle uzun kodlamayan RNA'ların overexpression var. Bu inceleme birden çok ek yeri değişik-in uzun kodlamayan RNA overexpress için CRISPR teknolojisini kullanan bir iletişim kuralı bildirir.

Abstract

Uzun kodlamayan RNA (lncRNA) Biyoloji Araştırma yayınları 2007 yılından bu yana katlanarak büyüyen bu alandan sayısı ile yeni ve heyecan verici bir alandır. Bu çalışmalar lncRNAs hemen hemen tüm hastalıklarda değişmiş doğruladı. Ancak, lncRNAs hastalığı bağlamında için işlevsel roller eğitim eksikliği protein ürünleri, doku özgü ifade, düşük ifade düzeyleri, splice formları karmaşıklığı ve türler arasında koruma eksikliği nedeniyle zor kalır. Species-specific ifade göz önüne alındığında, lncRNA çalışmalar genellikle hastalık süreçleri okurken insan araştırma bağlamları için kısıtlanır. LncRNAs moleküler düzeyde işlev beri lncRNA Biyoloji incelemek için bir yol lncRNA kaldırmak veya lncRNA ve ölçü hücresel etkileri overexpress etmektir. Bu makalede, lncRNAs tüp bebek overexpress için bir yazılı ve görüntülenmeyecektir protokol sunulmuştur. Temsil edici bir deney olarak, inflamatuvar barsak hastalığı, Interferon gama Antisens 1 (IFNG-AS1) ile ilişkili bir lncRNA bir Jurkat T-hücre modeli overexpressed gösterildi. Bunu yapmak için aktive kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) tekniği overexpression endojen genomik loci, etkinleştirmek için kullanılır. Aktive CRISPR tekniği transkripsiyon faktörleri lncRNA splice yükseltgen sağlam bir overexpression sağlayan bir gen transkripsiyon başlangıç siteye birtakım hedefler. Bu yordamı üç adım, yani (i) Kılavuzu RNA (gRNA) tasarım ve vektör inşaat, (ii) virüs üretimi ve iletimi ve (III) koloni tarama overexpression için içine bölünmüş. Temsilcisi bu deneme için bir IFNG-AS1 Jurkat T hücrelerinde 20-fold geliştirme gözlendi büyüktür.

Introduction

En Biyomedikal Araştırma protein kodlayıcı transkript üzerinde odaklanmıştır iken, kopya etmek genler çoğunluğu aslında kodlamayan RNA'ların (Ensembl yayın 93) oluşur. Mevcut araştırma lncRNAs katlanarak 2007 2017 ve¹arasında yükselen hastalığı süreçlerde yayın numarasıyla bu alanı keşfetmeye başlıyor. Bu yayınların birçok lncRNAs hastalığı ile ilişkili olduğunu gösterir. Ancak, bu lncRNAs moleküler mekanizmaları ile karşılaştırıldığında mRNA'ların farklı işlevleri nedeniyle çalışma zordur. LncRNAs hastalığında rolünün anlaşılması sorunu bileşik, lncRNAs çoğunlukla RNA'ların²kodlama daha alt seviyelerde ifade edilir. Ayrıca, lncRNAs kötü, hangi insan-cep-satır-tabanlı teknikleri³fonksiyonel çalışmalar sınırlar korunmuş. Roman bu genlerin mekanizması çalışmaya bir yöntem endogenously onları kültürlü hücrelerde overexpress sağlamaktır. Overexpression çalışmaları belirli genler işlevi hakkında önemli bilgileri sağlar ve araştırmacılar anahtar moleküler yolları incelemek için etkinleştirin.

LncRNA genlerin transkripsiyon etkinleştirmek için yeni bir yöntem başlangıçta Gersbach laboratuvar⁴tarafından geliştirilen CRISPR teknolojileri temel alır. Bu iletişim kuralı kullanmak üzere lncRNA Biyoloji ve diğer model sistemleri bu genlerin ifade için adapte edilmiştir. Teknik overexpressing CRISPR içinde CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) adı verilen bir protein DNA dizisi ile Cas9 tarafından tanınan bir antianlamlı gRNA doğru yönlendirilmiş olabilirsiniz. Normalde, Cas9 DNA bölünme neden; Ancak, daha önce için overexpression tekniği, gelişmiş değil Cas9, mutasyonların bu adım⁵devre dışı bırakın. Ne zaman bir transkripsiyon harekete geçirmek için bir "ölü" Cas9 erimiş (dCas9) ve hücre satır içine transduced, elde^4,6lncRNAs endojen overexpression olabilir. GRNA için bağlamak ek transkripsiyon faktörleri etkinleştirme gRNA, ek değişiklikler ek dCas9 gen harekete geçirmek sistem etkinliği arttı 10 kat⁷. Önemlisi, yakın bir konumda istemek transkripsiyon harekete geçirmek gösterilmiştir (< 200 bp) transkripsiyon için site genler, belirli bir upregulation gen zengini alanları⁷etkinleştirme başlatın. CRISPR nakavt teknolojileri farklı olarak, dCas9 ve gRNA kaset hücreler bir overexpression birden fazla kuşaklara korumak için izin vermek için genom entegre edilecek gerek. Bunu başarmak için bir yöntem lentiviruses dCas9 ve gRNA içeren kaset tümleştirmek için kullanmaktır. Entegrasyon sonra lncRNA gen ekspresyonu belirlenebilir.

Bu makalede, lncRNA overexpression Jurkat T-hücre modeli için bir protokol gösterilecektir. Adım adım bir yordam gösterilir ve aynı zamanda yapisan hücrelerine adapte edilebilir.

Protocol

Not: Bu protokol çoğaltma-eksik lentiviruses kullandığını unutmamak gerekir. Uygun laboratuvar güvenlik eğitimi sonra viral işleme gerçekleştirin. Tüm öğeleri ve işleme sonra en az 10 dk canlı virüs temas yüzeyleri çamaşır suyu. Kullanım tek kullanımlık laboratuvar mont ve yüz/göz koruma yanı sıra çift eldiven, her zaman. Biyogüvenlik seviye 2 + laboratuarlar viral sertifika ile Virus görevi gerçekleştirin. Doku kültürü davlumbaz ve kuluçka viral çalışmaya adamak.

1. vektör Tasarım ve üretimi

Not: GRNA serileri tanımlamak için en iyi yolu online tasarım araçları (örneğin, http://crispr-era.stanford.edu) kullanmaktır (tamamlayıcı şekil 1: gRNA tasarım). Eşlik eden temsilcisi deneme için bir şirket tasarlanmış ve oluşturulan temsilcisi deneyde kullanılan gRNA vektörel çizimler. DCas9 plazmid Ayrıca online satın alınmıştır.

1. GRNA sıra akıntıya karşı nükleotid dizisi "NGG", "N" aynı zamanda 100 base-çift içinde transkripsiyon başlangıç sitenin herhangi bir nükleotit nerede, yer alır. Orada benzer dizileri ile genom yok diğer site emin olmak için gRNA sırası için genetik veritabanları BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) gibi arama (tamamlayıcı Şekil 2: BLAT). Bu gRNA sıra faiz (GOI) gen için benzersiz olduğundan emin olun.
2. 4 ° C'de bakteri taslakları olarak gelir gRNA ve dCas9 plazmid depolamak Escherichia coli dışarı çizgi üzerinde suyu (LB) agar Ampisilin ile (ek tablo 1) plaka ve bakteri 37 ° C'de gecede büyümek bir Luria
3. Bir koloni almak ve şiddetle plaka 37 ° C kuluçka makinesine sallayarak bakteri LB 5 ml ile Ampisilin (ek tablo 1) bir gecede büyümek. Ertesi gün, 2 mL ekleyin bakteri LB 200 ml Ampisilin ile büyümek şiddetle 37 ° C kuluçka gecede şişeye sallayarak bir 2 L şişesi.
4. Spin aşağı yeri buzda bakteri içeren tüp ve bakteri 3,724 x g 20 dk. Kaldır medya için de.
5. Bakteriyel DNA bir plazmid arıtma kit başına üreticinin iletişim kuralı kullanarak arındırmak.
   Not: özel resuspension tampon, lizis arabellek, yıkama arabellek, denge arabellek ve elüsyon tampon plazmid arıtma setleri içerir.
   1. Resuspension arabellek 10 mL teçhizat--dan bakteri ve damlalıklı bakteri çözüm içine ekleyin. Sonra 10 mL lizis arabellek Seti'nden resuspended bakteri ve onları tüp ters çevirme karıştırın. Bakterileri parçalayıcı için 5 dakika bekleyin; sonra buz gibi nötralizasyon arabellek 10 mL Seti'nden lysed bakteri ve onları tüp ters çevirme karıştırın.
   2. Kit 5 dk. örnekleri DNA sütuna filtre ve filtre üzerinden geçmek çözüm izin dökmek için denge arabellek 10 mL ile DNA sütundan equilibrate.
   3. Örnekleri 2 yıkama x 30 mL ile yıkama arabellek ve sonra DNA ile 15 mL konik tüp arabellekte elüsyon 30 mL elute. Yavaş yavaş isopropanol eluted DNA üzerine oda sıcaklığında 10.5 mL katman, tüp ters çevir ve hemen 16,200 x g 4 ° C'de 30 dk için de spin
   4. Süpernatant çıkarın ve 1 mL % 70 etanol DNA Pelet ekleyin. Pelet tüp flicking tarafından resuspend. 16,200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de sıralayacağız ve 200 μL damlalıklı bahşiş etanol çoğunu kaldırmak için kullanın. 5 min için Pelet kurumasına ve su 200 μL içinde resuspend ve DNA-20 ° C'de depolayın Beklenen konsantrasyonu olacak > 1 μg/μL.

2. virüs üretimi ve parçacık sayısı

1. DCAS9 içeren lentivirus oluşturmak hazır olduğunuzda 100 mm doku kültürü yemekleri ile 5 mL % 0,01 Poli-L-lizin (ek tablo 1) de kat. Aşırı sıvı iyice plakalar kaldır ve onlara bir kaç dakika içinde bir biyogüvenlik kabini için air-dry.
2. Yemeğin tam Dulbecco'nın 10 ml başına plaka 5 x 10⁶ HEK 293T hücre kartal orta (DMEM) (ek tablo 1) değiştirilebilir ve onları gecede %5 CO₂37 ° C'de kuluçkaya. Ertesi gün, orta HEK 293T yemeklerini kaldırmak ve tam DMEM 10 mL ekleyin.
3. Plazmid pMDLg/pRRE gag/pol (virüs bileşenleri), içeren Mix 6.5 μg VSV-G (virüsün bileşeni), içeren plazmid pMDG2.G 3,5 μg plazmid pRSV-Rev içeren 2,5 µg Rev (virüsün bileşeni), bir uzun terminal tekrar (10 μg LTR)-vektör gRNA vektör veya LTR içeren bir dCas9 içeren ve bir toplam 450 μL birime su ekleyin. Karışım 0.2 µm filtre bir şırıngaya bağlı bahşiş aracılığıyla filtre.
4. 2.5 M CaCl₂ (ek tablo 1) 50 µL DNA her transfection örneği ekleyin ve karışımı yavaşça. Kalsiyum/DNA karışımı 0.2 µm filtre bir şırıngaya bağlı bahşiş aracılığıyla filtre. Damlalıklı 500 µL 5 mL polistren tüp içine 2 x HBS (ek tablo 1). 500 µL DNA/CaCl₂ mix dropwise ve yavaşça girdap ekleyin. 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
5. Yavaş yavaş DNA/CaCl₂/HBS süspansiyon 1 mL her yemek için ekleyin. Hemen içeriği eşit dağıtmak için yemekler girdap. Her yemeğin 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka geceleme kuluçkaya
6. Günde 3, yavaş yavaş kaldırmak ve bulaşıkları medyadan atın. Dikkatli bir şekilde hücreleri 1 yıkama x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile. Tam DMEM 20 mM HEPES ve 10 mM sodyum bütrat ile 6 mL ekleyin. 5-6 h 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka için hücreleri kuluçkaya
7. Hücreleri 1 yıkama x PBS ile ve 5 mL 20 mM HEPES ile tam DMEM de HEK 293T hücrelere ekleme. 12 h 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka geceleme için kuluçkaya
8. Günde 4, HEK 293T hücre supernatants toplamak ve süpernatant filtre. 1 mL aliquots-80 ° C'de dondurmak
9. Hazır olduğunuzda virüs kullanmak, bir aliquot (açıklandığı adım 2.8 olarak depolanan) klimalı ortamları buzda içeren viral parçacık çözülme. Tüm reaktifler oda sıcaklığına getirmek.
10. P24 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kiti mililitre başına viral parçacıkların sayısı ölçmek için kullanın.
    1. Yıkama konsantresi Takımı'ndan 19 bölümleri deiyonize distile su ekleyerek sulandırmak. Takımı'ndan olumlu denetim 200 ng/ml seyreltik, RMPI 1640 eritici ve yapmak kullanarak dilutions 1,5 ml standart eğri için tüpler göre p24 ELISA seyreltme tablosu (ek tablo 2).
    2. %5 20 μL eklemek belgili tanımlık substrate boş dışında bütün wells için Triton X-100. RPMI 1640 200 μL negatif kontrol wells için ekleyin. Her standardında (yinelenen) 200 μL belirlenen wells için ekleyin.
    3. Bir Spektrofotometre kullanarak, standart bir eğri kullanarak örnekleri içinde virüs konsantrasyonu ölçmek. 1:1,000, Numune dilüsyonu başlatmak ve birimin standart eğri aralığı içinde olmak için gerektiği gibi değiştirin. Triton X-100 son konsantrasyonu % 0,5 örnekleriyle sulandırmak ve her örneğinin 200 μL RPMI 1640 yılında belirlenen wells için ekleyin. Plaka mühür ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
    4. 6 tabak yıkama x 1 şey başına yıkama arabellek x 300 μL ile. Herhangi bir aşırı sıvı plaka ters çevirme ve kağıt havlu üzerinde dokunarak çıkarın. Dedektör antikor 100 μL teçhizat--dan belgili tanımlık substrate boş dışında bütün wells ekleyin. Plaka mühür ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Plaka yıkama ve ardından plaka ters çevirme ve kağıt havlu üzerinde dokunarak tarafından herhangi bir aşırı sıvı kaldırın.
    5. Dedektör antikor ölçmek amacıyla streptavidin horseradish peroksidaz (SA-HRP) kullanım 15 dakika içinde hazır olun. SA-HRP 1: 100 ile SA-HRP seyreltici, seyreltik. Seyreltilmiş SA-HRP iyice karıştırın ve boş dışında bütün wells 100 μL ekleyin. Mühür ve oda sıcaklığında 30 dk plaka kuluçkaya.
    6. 1 yıkama arabellek x ile tabak yıkama ve uzak adım 2.10.4 olduğu gibi herhangi bir aşırı sıvı dokunun. Kemiluminesan, hazırlık 15 dk içinde üretmek için gerekli yüzeylerde peroksidaz sağlar ortho-boya (OPD) substrat çözeltisi kullanın. Bir OPD tablet 11 mL substrat Dilüent için her plaka için kullanın.
    7. Girdap OPD çözüm şiddetle tamamen erimesi ve ışıktan korumak için. 100 μL OPD substrat çözeltisi, boş da dahil olmak üzere tüm wells için ekleyin. 450 Absorbans okumak bir Spektrofotometre kullanarak nm hemen, bu 10 x 1 s aralıklarla tekrarlayın ve ortalama ölçüm almak.

3. dCas9 -VP64 iletim

1. Kültür Jurkat T hücreleri bir T75 şişesi yoğunluklu medya 15 mL 2 x 10⁶ hücrelerinin içinde tam DMEM. 37 ° C kuluçka %5 CO₂hücre kültür.
2. Spin aşağı vasıl 233 x g 5 min için hücreleri ve sonra onları indirimli serum medya 10 mL resuspend. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç içeren hücreleri saymak.
3. Resuspend ve polybrene (ek tablo 1) bir T75 şişesi ile indirimli serum medya 5 mL 1 x 10⁶ Jurkat hücrelerde plakası. 1 x 10⁶ dCas9 içeren viral parçacıkların içeren HEK 293T klimalı ortam ekleyin. Viral parçacıkların sayısı p24 kabaca hesaplanabilir ELISA 1 μg/mL p24 1 x 10⁷ viral parçacıkların eşittir çünkü. 37 ° C kuluçka %5 CO₂şişe koymak.

4. seçim ve klon oluşturma

1. Üç gün sonrası enfeksiyon, 233 x g 5 min için de hücreleri aşağı spin ve onları puromisindir (ek tablo 1) ile tam DMEM 10 ml resuspend. T75 şişeler hücrelerde plaka ve onları %5 CO₂37 ° C'de kültür. 9 günlük bir süre için üçüncü her gün vasıl 233 x g 5 min için hücreleri aşağı spin ve ortamı ile puromisindir tam DMEM ile değiştirin.
2. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. Doku kültürü ile tedavi bir 96-şey plaka üzerinde tam DMEM 100 μL plaka 10.000 hücrelerde ilk puromisindir ile 1:1 tam DMEM puromisindir ile aşağıdaki Wells'le içeriğini de ve seri olarak sulandırmak. 24 dilutions gerçekleştirmek ve bu 4 x plaka başına bir şey başına hücre sayısı yeterli olduğundan emin olmak için yineleyin. %5 CO₂37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
3. Klonal hücreleri iki 24-şey tabak, sonra 6-şey plaka içine ve sonunda bir T75 şişesi içine genişletin. Üç klonların, plaka 2 x 10⁶ hücre, bir 6-şey tabak iyi üç klonların başına odaklanmak için. Diğer üç kuyu nontransduced Jurkat hücrelerle denetimleri plaka. Hücreleri gecede bir hücre kültür kuluçka makinesine koy.
4. RNA ayıklama için piyasada bulunan bir RNA izolasyon kit kullanın. Spin aşağı vasıl 233 x g oda sıcaklığında 5 min için hücreleri ve medyayı çıkarın. 1 mL damlalıklı ipucu lizis arabelleği 350 μL hücrelerde resuspend için kullanın. 350 μL % 70 etanol lysed hücrelere ekleme, 1 mL damlalıklı ile iyice karıştırın ve örnek RNA sütuna aktarmak.
5. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı aracılığıyla kaldırın ve düşük-sıkılık yıkama arabelleği 700 μL seti için sütun ekleyin. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı aracılığıyla kaldırın ve Dnaz 80 µL ekleyin ben çözüm Takımı'ndan sütun; 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya örnekleri ver.
6. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı aracılığıyla kaldırın ve yüksek-sıkılık yıkama arabelleği 700 µL seti için sütun ekleyin. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı sayesinde kaldırmak ve 700 µL düşük-sıkılık yıkama arabelleği sütun ekleyin.
7. Ve yeni bir koleksiyon tüp transfer sütun koleksiyon tüpünden çıkarın. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin ve ardından RNA sütun bir 1,5 mL tüp aktarın. Sütun ve 10.000 x g 1 dk. için spin 50 µL su ekleyin.
8. Bir Spektrofotometre RNA konsantrasyonunu ölçmek için kullanın. 100-500 ng/µL, 1.9-2.1 arasında 260/280 Absorbans ile arasında olmak için konsantrasyon bekliyoruz. RNA-80 ° C'de depolayın
9. 250 µL tüpler, RNA, tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi arabelleği 4 µL, ters transkriptaz 1 µL 1 µg ekleyin ve son hacmi 20 µL. su hiçbir ters transkriptaz denetimleri içerir. Bir termal cycler içinde cDNA 30 dk 42 ° C'de ve ters transkriptaz devre dışı bırakabilirsiniz 5 min için 95 ° C'de sentez. CDNA 60 µL su ile sonra sentez sulandırmak.
10. Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) içeren SYBR yeşil 5 µL, cDNA 4 µL, 0.5 µL ileri astar (10 µM) ve ters astar (10 µM) 0.5 µL hazırlayın. PCR aşağıdaki gibi çalıştırın: 1 = 95 ° C 3 min için adım, 2 = 95 ° C için 10 adım s, adım 3 = 60 ° C 10 s ve o zaman, tekrar adım 2 ve 3 30 x için.
    Not: DCas9 ileri astar için sıra 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA ve dCas9 ters astar için sıra 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) için ileriye doğru astar 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT ve ters astar 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.

5. gRNA iletim, seçimi, klon oluşturma ve tarama

1. Doğrulanmış Jurkat-dCas9 hücreleri ile virüs gRNA içeren madde 3 te belirtildiği gibi retransduce. Hücreleri DMEM içinde 10 gün boyunca hygromycin ile (ek tablo 1) seçin. Hücreleri aşağı spin ve medya 3 günde değiştirin.
2. Bir seri seyreltme hücre (4.2 adımda anlatıldığı gibi) gerçekleştirmek ve bireysel koloniler (4.3 adımda anlatıldığı gibi) genişletin. RNA kolonilerden tam olarak 4.5 adımda anlatıldığı gibi arındırmak ve 4,9 adımda anlatıldığı gibi cDNA sentez gerçekleştirin. GOI karşı gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek ve HPRT1 veya bir uygun temizlik gene aynı şekilde PCR ile 4.10, adımda anlatılan bu durumda, adım 3 sonra kuyu her döngüsü görüntü hariç.
3. GOI⁸kat değişiklik belirlemek için karşılaştırmalı döngüsü eşik (Ct) yöntemini kullanın. Kısaca, göreli transkript düzeyleri (RTLs) hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: 2^{-(GOI Ct ortalama-Ct temizlik gen ortalama)}. O zaman, denetimlerin ortalama RTL hesaplamak ve tüm RTL değerleri ortalama denetim kontrol örnekleri karşılaştırıldığında bir kat değişiklik oluşturmak için RTL bölün.

Results

LncRNA IFNG-AS1 overexpress için bir ikili vektör sistemi
LncRNA IFNG-AS1⁹ifade Jurkat T-hücre modeli sistemi overexpression bu el yazması olarak örnek deneydir. IFNG-AS1 Interferon gama¹⁰düzenleyen görülen iltihabi bağırsak hastalığı ile ilişkili bir lncRNA var. IFNG-AS1 gene aynı transkripsiyon başlangıç site (şekil 1A) hepimize üç ek yeri değişik içerir. Bu nedenle, 10 ve 100 bp transkrips...

Discussion

Bu el yazması CRISPR aktive lncRNAs tüp bebek overexpress kullanmak için bir protokol sunar. Transcriptomic ürün işlevsel birim olduğu gibi uzun kodlamayan RNA'ların okurken bu özellikle önemli bir tekniktir. Overexpression sonra araştırmacı, bu hücreler bağlama ortakları okurken sinyal-gürültü oranı artırmak ve bile lncRNAs, daha yüksek düzeyde hücresel sonuçlarını ölçmek için kullanabilirsiniz. Ayrıca, lncRNAs sık sık CIS-genler üzerinde hareket gibi bu endojen overexpression teknik eğitimi¹¹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampisilin	Fisher Scientific	BP1760-5
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016
cDNA sentez kiti (iScript)	BioRad	1708891
dCas9 ileri astar	Entegre DNA Teknolojileri	n/a	5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA
dCas9 ters astar	Entegre DNA Teknolojileri	n/a	5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 vektör	Addgene	50918
DMEM	Corning	10013CM
Etanol	Acros Organics	61509-0010
FBS	Sigma Aldrich	F2442
gRNA plazmid	Vektör Oluşturucu	VB180119-1195qxv
HEK293T hücreleri	ATCC&	nbsp; CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
HPRT1 ileri astar	Entegre DNA Teknolojileri	n/a	GACCAGTCAACAGGGGACAT
HPRT1 ters astar	Entegre DNA Teknolojileri	n/a	GCTTGCGACCTTGACCATCT
Higromisin B	Corning	MT3024CR
İzopropanol	Fisher Scientific	BP2618-500
Jurkat hücreleri	ATCC&	nbsp; TIB-152	klonu E6-1
L-glutamin	Corning	25005Cl
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB et suyu	Fisher Scientific	BP1426-2
Maxi-hazırlık kiti (Plazmid Saflaştırma Kiti)	Qiagen	12362
Na2HPO4	Sigma Aldrich
Optimem I serum ortamını azalttı	Gibco	31985070
p24 elisa	Perkin Elmer	NEK050B
PBS	Corning	21-040-CMR
Penisilin ve streptomisin	Corning	30-002-Cl
pMDG2.G	Addgene & nbsp;	#12259
pMDLg/pRRE	Ekle	# 60488
Poli-L-Lizin	Sigma Aldrich	P-4832
Polibren	EMD Millipore	TR-1003
pRSV-REV	Addgene	# 12253
Puromisin dihidroklorür	Sigma Aldrich	P8833
RNA saflaştırma kiti (Aurum RNA mini)	BioRad	7326820
Sodyum Butirat	Sigma Aldrich	B5887
SYBR yeşil (iTaq evrensel)	BioRad	1725122
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100