Yöntem makalesi

Farelerde Tümör Büyümesini Azaltmak için MikroRNA'nın Vivo İnhibisyonu

DOI:

10.3791/59322

⸱

23 Ağustos 2019

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM, 2Ciberonc, Instituto de Salud Carlos III

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan tiroid tümörigenezinin ksenogreft ve ortotopik fare modellerini mikroRNA tabanlı inhibitör tedavileri test etmek için bir platform olarak tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, kodlamayan RNA'ların işlevini ve yeni tedavi hedefleri olarak potansiyellerini incelemek için idealdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA'lar (miRNA'lar), mRNA'ların dengesini bozabilme ve hedef mRNA'ların çevirisini inhibe etme yetenekleri sayesinde gen ekspresyonunun önemli düzenleyicileridir. Çalışmaların giderek artan sayıda kanser tanısı ve prognoz için potansiyel biyobelirteçleri olarak miRNA'lar tespit etmiş, ve aynı zamanda terapötik hedefler olarak, kanser değerlendirme ve tedavi için ekstra bir boyut ekleyerek. Tiroid kanseri bağlamında, tümörigenez sadece önemli genlerdeki mutasyonlardan değil, aynı zamanda birçok miRNA'nın aşırı ekspresyonundan da kaynaklanmaktadır. Buna göre, tiroid gen ekspresyonunun kontrolünde miRNA'ların rolü kanserde önemli bir mekanizma olarak gelişmektedir. Burada insan tümörü ksenogreft ve ortotopik fare modellerini kullanarak tiroid kanserinde tedavi yöntemi olarak miRNA inhibitörü doğumunun etkilerini incelemek için bir protokol saklıyız. GFP ve luciferase ifade kararlı tiroid tümörhücreleri mühendislik sonra, hücreler tümörler geliştirmek için çıplak fareler içine enjekte edilir, biyolüminesans takip edilebilir. Bir miRNA in vivo inhibisyonu tümör büyümesini azaltabilir ve miRNA gen hedeflerini yükseltebilir. Bu yöntem, yeni terapötik hedeflerin belirlenmesine ek olarak, in vivo kararlı bir miRNA önemini değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tiroid kanseri artan bir insidansı ile bir endokrin malignite, genel olarak iyi bir sonuç olmasına rağmen1. Bununla birlikte, bazı hastalarda tedavi edilemez ve moleküler bazlar kötü anlaşılmaktadır hastalığın agresif formları geliştirmek2.

miRNA'lar, genellikle hedef haberci RNA'ların (mRNA'lar) 3' çevirisiz bölgesine (3'UTR) bağlanarak, mRNA bozulmasını veya çevirisel baskıyı tetikleyen, birçok dokuda gen ekspresyonunu düzenleyen 22 nükleotid-uzun kodlamayan RNA'lardır. 3.2.2 , 4. MikroRNA ekspresyonunun deregülasyonunun kanserin bir özelliği olduğunu gösteren kanıtlar artmaktadır, çünkü bu moleküller çoğalan sinyalizasyon, göç, invazyon ve metastazı modüle eder ve apoptoza karşı direnç sağlayabilir. 5,6. Son yıllarda, birçok çalışma kanser tanısı ve prognoz için potansiyel biyobelirteçler olarak miRNA'lar tespit etmiş yanı sıra terapötik hedefler7, kanser değerlendirme ve tedavisi için yeni bir boyut sağlayan.

miRNA'lar insan moleküler onkolojisinde insan tiroid neoplazmlarınınanahtaritici leri olarak 8,9,10,11,12olarak merkeze alınmıştır. MiRNA'lar arasında yukarı düzenlenmiş, miR-146b papiller tiroid karsinomu (PTC) tümörlerinde aşırı ifade edilir ve hücre proliferasyonlarını önemli ölçüde artırmış ve agresiflik ve kasvetli prognoz ile ilişkili olduğu gösterilmiştir6, 12.000.0 , 13.000 , 14.000 , 15. Ayrıca, miR-146b farklılaşma dahil çeşitli tiroid genleri düzenler12, ve ayrıca Önemli tümör baskılayıcı genler Gibi PTEN16 ve DICER117. Kanser biyolojisi önemine rağmen, miRNA tabanlı kanser tedavisi hala erken aşamalarında, ve çok az çalışma tiroid kanseri ele var - endokrin tümörlerin en sık18. Burada insan kaynaklı tümörler ile iki farklı fare modelleri kullanarak bir protokol tarif, hangi sentetik bir miRNA inhibitörü uygulanması (antagomiR) özellikle bir hücresel miRNA tümör büyümesini engelleyebilir. İlk olarak ortak bir ksenogreft modeli kullandık ve antagomir'in lokal intratümör uygulaması tümör biyolüminesansında azalma olarak ölçülen tümör büyümesini azalttı16. İnsan tümörü ilerlemesini taklit eden sağlam fare modellerinin oluşturulması benzersiz terapötik yaklaşımlar geliştirmek için gerekli olduğundan, primer insan tümörlerinin ortotopik implantasyonu yeni ilaçların klinik doğrulaması için daha değerli bir platformdur. deri altı implantasyon modelleri. Böylece, antagomir terapötik potansiyelini daha iyi değerlendirmek için, aynı sonuçları elde, kan dolaşımında sistemik doğum ile bir ortotopik fare modeli kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, İspanya) Etik Komitesi'nin onayı ile Avrupa Topluluğu Kanunu (86/609/EEC) ve İspanyol yasalarına (R.D. 1201/2005) uygun olarak hayvan deneyleri gerçekleştirilmiştir.

1. Hücrelerin böğürtlen aşısı ve intratümöral antagomiR tedavisi

  1. Hücre hazırlama
    1. Mühendis bir Cal62 insan tiroid kanseri hücre hattı (KRASG12R ve p53A161D mutasyonlar) oluşturan GFP ve luciferase (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP) ifade eden bir transgenik yapı aşırı ifade etmek için. Transgenik hücreleri antibiyotik direnci ile veya akış sitometrisi ile GFP pozitif hücreleri sıralayarak seçin.
    2. Penisilin, streptomisin ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenen Dulbecco'nun modifiye Eagle' s orta (DMEM) hücreleri 37 °C ve% 5 CO2büyümek.
    3. 4 °C'de 50 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 x 106 hücreyi askıya alın.
  2. Farelerin yanlarına hücre aşısı
    1. Bazal membran matris aynı miktarda hücreleri karıştırın. Örneğin, 50 μL PBS'lik 1 x 106 hücreyi 50 μL'lik bazal membran matrisine ekleyin (Bkz. MalzemeTablosu) ve hafifçe karıştırın.
      Not:
    2. 27G 1/2'' (0.4x13 mm) iğneile 1 mL insülin şırınga kullanarak 6 haftalık immünoeksik BALB/c nu/nu farelerin sol kanadına numunenin 100 μL'sini (PBS + bazal membran matrisindeki hücreler) deri altına enjekte edin.
  3. İntratümöral antagomiR tedavisi.
    1. AntagomiR'i (bkz. MalzemelerTablosu) veya 500 μL RNase içermeyen distile sudaki negatif kontrolü askıya alın.
    2. Enjeksiyondan önce, her enjeksiyon için bir in vivo doğum reaktifi (Bkz. MalzemelerTablosu) ile birlikte antagomiR veya kontrol2 nmol hazırlayın.
      1. Önce antagomiR çözeltisini (Bkz. MalzemelerTablosu) ve karmaşıklık tamponunu (Malzeme Tablosu'nabakınız) 1:1 oranında karıştırın. Örneğin, 80 μL miRNA inhibitörü çözeltisi (16 nmol) ila 80 μL karmaşıklık tamponu ekleyin (in vivo teslimat reaktif kitine dahil edilmiştir, bkz. MalzemeTablosu).
      2. In vivo teslimat reaktifini oda sıcaklığına getirin. 1,5 mL'lik bir tüpe 160 μL ekleyin ve hemen 160 μL seyreltilmiş antagomiR çözeltisi ekleyin. Kalan reaktifi -20 °C'ye döndürün. Gerekirse reaktifi 4 °C'de bir hafta kadar eritmeden sonra saklayın.
      3. Girdap hemen (10 s) in vivo teslimat reaktif-antagomiR karmaşıklığını sağlamak için.
      4. In vivo delivery reagent-antagomiR karışımını 50 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın. Numuneyi kurtarmak için tüpü kısa bir süre santrifüj edin.
      5. 1360 μL PBS pH 7.4 ekleyerek kompleksi 6 kat seyreltin ve iyice karıştırın.
      6. Reaktif-antagomiR kompleksinin (8 fare/durum) in vivo teslimine devam edin veya kompleksi enjeksiyondan bir hafta öncesine kadar 4 °C'de saklayın. Her tümöre 200 μL intratümöral enjekte edin (2 nmol antagomiR).
        NOT: Antagomir'in hacmi ve miktarı tümör hacminden bağımsızdır.
    3. 2 hafta boyunca her hafta (Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) 3 kez tedavi gerçekleştirin.
  4. Tümör büyümesinin analizi
    1. D-luciferin substratının 40 mg/mL çözeltisinin 50 μL'sini enjekte edin (bkz. MalzemeTablosu) her zaman noktasında 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm) iğneile 1 mL şırınga ile subkutan olarak.
      1. 8 dk enjeksiyon sonrası, oksijen ile karışık% 3 isofluran kullanarak fareler anestezi. Anestezi düzeyini pedal refleksi (firma ayak ucutu) ile değerlendirin ve anestezik doğumu cerrahi düzlemi korumak için uygun şekilde ayarlayın.
      2. Kurutmayı önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
    2. In vivo görüntüleme yazılımı ile biyolüminesans sinyali görüntüleyin (bkz.
      NOT: Kaliperler de tümör hacmi ve tümör büyümesini ölçmek için kullanılabilir.
    3. Biyolüminesans sinyalleri alındıktan sonra, her iki tedaviyi karşılaştırarak tümöral büyümeyi analiz edin ve t-testi ile önemini belirleyin. Grup içi varyansını analiz etmek için SEM'yi kullanın.
  5. Tümör eksizyonu
    1. AntagomiR tedavisinin bitiminden yedi gün sonra, fareleri kurban edin, tümörü çıkarın ve ileride analiz için protein ve/veya RNA alın. Alternatif olarak, bölüm tümörler ve immünohistokimya için onları düzeltmek.

2. Hücrelerin tiroid ortotopik aşısı ve sistemik antagomiR tedavisi

  1. Hücre hazırlama
    1. GFP ve luciferase'i oluşturan transgenik yapıyı aşırı eksprese etmek için Cal62 insan tiroid kanseri hücre hattı tasarla. Transgenik hücreleri antibiyotik direnci ile veya akış sitometrisi ile GFP pozitif hücreleri sıralayarak seçin.
    2. Antibiyotikler (penisilin ve streptomisin) ve 37 °C'de %10 FBS ve %5 CO2ile desteklenen DMEM'de bu hücreleri yetiştirin.
    3. PBS'nin 5 μL'sinde 1 x 105 hücreyi askıya alın.
  2. Farelerin tiroid bezine hücre aşısı
    1. 7 haftalık BALB/c nu/nu farelere 100 μL analjezik (buprenorfin) ve 100 μL antibiyotik (sefalosporin) deri altına enjekte edin. Enjeksiyon bölgesini alkolle dezenfekte edin.
    2. Hücre çözeltisinin 5 μL'sini farelerin tiroid bezine enjekte edin.
      1. Oksijen ile karışık% 3 izofluran kullanarak fare anestezi ve steril bir akış kabine bir stereomikroskop altında yerleştirin.  Anestezi düzeyini pedal refleksi (firma ayak ucutu) ile değerlendirin ve anestezik doğumu cerrahi düzlemi korumak için uygun şekilde ayarlayın.
      2. Kurutmayı önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
      3. Her fare için, iodopovison ile boyun dezenfekte ve makas ile deride yaklaşık 2 cm bir kesi yapmak. Açıldıktan sonra tükürük bezlerini yerinden ederek boynu ortaya çıkar.
      4. Trakea ve tiroid bezini ortaya çıkarmak için diseksiyon forceps ve / veya makas kullanarak kayış kasları diseksiyon. 10 μL mikrolitre şırınga kullanarak, hücre çözeltisinin 5 μL'ini sağ tiroid lobule enjekte edin, krikoid kıkırdağın yanında yer alır.
      5. Tükürük bezlerini yeniden konumlandırın ve kesiyi örgülü, kaplamalı, emilemez dikişler kullanarak ipekle süsler.
      6. Yara bölgesine iyodopovion ekleyin ve anestezi den kurtarır iken bir termik battaniye üzerine fare yerleştirin.
    3. Ertesi gün ameliyat sonrası, subkutan analjezik enjekte (buprenorfin) ve 1 hafta boyunca içme suyu 250 mL içine sıvı ibuprofen (40 mg / mL) 3 mL ekleyin.
  3. Sistemik antagomiR tedavi
    NOT: Biyolüminesans sinyali tespit edildiğinde, hücre enjeksiyonundan 2-3 hafta sonra bu adımı atın.
    1. Distile RNase içermeyen suda antagomiR'i veya negatif kontrolü askıya alın.
    2. Enjeksiyondan önce, her enjeksiyon için in vivo doğum reaktifi ile birlikte antagomiR veya kontrol 7 nmol hazırlayın.
      1. AntagomiR ve in vivo delivery reaktif çözüm hazırlığı için adım 1.3'e bakın, ancak fare başına miRNA inhibitöründen 7 nmol ekleyin.
    3. Farenin venöz sinüs retro-orbital enjeksiyon ile intravenöz çözüm uygulayın. Anestezi yi teşvik etmek için isoflurane kullanın.
      NOT: Anestezi düzeyini pedal refleksi (sert ayak ucutu) ile değerlendirin.
    4. Fareleri haftada 3 kez (Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) 2 hafta boyunca tedavi edin.
  4. Tümör büyümesinin analizi
    1. Tümör büyümesini hesaplamak için haftada iki kez tümör biyolüminesans sinyalini belirleyin.
      1. Deri altı enjeksiyon yoluyla her zaman noktasına D-luciferin substrat40 mg/mL çözeltisi 50 μL enjekte edin.
      2. 8 dk enjeksiyon sonrası, oksijen ile karışık% 3 izofluran kullanarak fareler anestezi ve in vivo görüntüleme yazılımı ile biyolüminesans sinyali görüntü.
    2. Biyolüminesans sinyalleri alındıktan sonra, her iki tedaviyi karşılaştırarak tümöral büyümeyi analiz edin ve t-testi ile önemini belirleyin. Grup içi varyansını analiz etmek için SEM'yi kullanın.
  5. Tümör eksizyonu
    1. AntagomiR tedavi süresinin bitiminden yedi gün sonra, fareleri kurban edin, tümörü çıkarın ve ileride analiz için protein ve/veya RNA alın. Alternatif olarak, bölüm tümörler ve immünohistokimya için onları düzeltmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir miRNA'nın nötralizasyonunun tümör büyümesini baskılayıp baskılameyeceğini belirlemek için iki farklı fare modeli kullandık. Buna göre, insan tümör tiroid Cal62-luc hücreleri subkutan bir ksekograf modeli oluşturmak için çıplak farelerin yanlarına enjekte edildi. İki hafta sonra tümörler oluşturuldu ve kaliperlerle ölçüldü. Bu noktada, farelere miR-146b inhibitörü veya uygun bir kontrol ile intratümöral enjekte edildi ve tümör hacmi iki hafta daha takip edildi (Şekil1A).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, tümör inisiyasyonu ve ilerlemesindeki rolünü ve tiroid kanserinde tedavi edici bir hedef olarak potansiyelini daha iyi anlamak için miRNA'nın in vivo fonksiyonunu incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan tümör ksenogreft modelleri, biyolüminesans sinyali ile izlenebilen hücrelerin kullanımına dayanmaktadır ve bir tedavinin etkisi altında in vivo'da tümör büyümesinin ölçülebilir. Buna ek olarak, tiroid kanseri için miRNA tabanlı bir tedavi kullanımını açıklamak, şu anda erken aşamalarında.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Raquel Arocha Riesco'ya farelerin tedavisi ve bakımındaki yardımları için minnettarız. Biz Dr J. Blanco (Katalonya Enstitüsü Advance Chemistry-CSIC için) ve Dr E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barselona (İspanya) cmv-Firefly luc- IRES-EGFP ve Cal62-Luc hücreleri, sırasıyla hediye için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitörüThermo Fisher4464088In Vivo Hazır
Bodrum Membran Matrisi: Matrigel Bodrum Membran Matrisi Yüksek KonsantrasyonluCorning#354248
DICER antikoruAbcamab14601IHQ: 1/100
in vivo< / em> dağıtım reaktifi: Invivofectamine 3.0 ReaktifThermo FisherIVF3005
In vivo görüntüleme yazılımı: IVIS-Lumina II Görüntüleme SistemiKaliper Yaşam Bilimleri
Negatif kontrol: mirVana miRNA İnhibitörü, Negatif Kontrol # 1Thermo Fisher4464077In Vivo Hazır
PCNA antikoruAbcamab92552WB: 1/2.000
PTEN antikoruSanta Cruzsc-7974WB: 1/1.000
XenoLight D-Luciferin - K + tuzu biyolüminesan substratPerkinElmer122799PBS'de seyreltilmiş

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
  2. Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
  3. Gregory, R. I., Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis and cancer. Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).
  4. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  5. Hammond, S. M. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).
  6. Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
  7. Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
  8. Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
  9. Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
  10. Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450(2014).
  11. Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
  12. Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).
  13. Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108(2016).
  14. Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
  15. Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
  16. Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
  17. Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , In press (2019).
  18. Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mikroRNA nhibisyonuTiroid Kanseri ModeliOrtotopik T m r EnjeksiyonuBiyol minesans G r nt lemeAntagomiR TedavisiT m r B y me AnaliziCAL 62 H cre HattN Mouse ModeliRetro orbital EnjeksiyonD Lusiferin Substrat

İlgili makaleler