Görselleştirme Germinosomes ve Bacillus subtilis sporlar iç zar

Summary

Germinant reseptör proteinler 'germinosomes' Bacillus subtilis sporlar iç zarda kümesinde. Biz süper çözünürlük mikroskobu ve floresan muhabir proteinleri germinosomes görselleştirmek için bir iletişim kuralı'nı açıklar. İletişim kuralı da tercihen membran boya FM4-64 ile lekeli spor iç zar etki alanları tanımlar.

Abstract

Sporlar küçük boyutu ve çimlenme proteinler, nispeten düşük bolluk neden epifluorescence mikroskobu kullanarak onların Mikroskopik analizler zorluklar. Süper çözünürlük üç boyutlu yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) bu engeli aşmak ve Bacillus subtilis (B. subtilis) sporlar çimlenme sürecinin moleküler ayrıntıları ortaya çıkarmak için umut verici bir araçtır. Burada, değiştirilmiş SIMcheck (ImageJ) nasıl kullanılacağını açıklar-Yardımcısı 3D görüntüleme işlemi ve floresan muhabir proteinler B. subtilis sporlar germinosomes, kümelere çimlenme proteinlerin SIM mikroskopi için. B. subtilis spore zarı FM4-64 boyama için (Standart) 3D-SIM görüntüleme yordamı da mevcut. Bu yordamları kullanarak germinosome yerelleştirme için eşsiz çözünürlük elde edilen ve gösteri > uyuyan sporlar elde sporulation tanımlanmış en az BEZLERİ orta sonra B. subtilis KGB80% 80'i-si olmak bir ya da iki GerD-GFP ve GerKB-mCherry resimde. Parlak foci Ayrıca içinde gözlenen FM4-64 sporlar 3D-SIM görüntüleri iç membran lipid etki alanından farklı akışkanlık olasılığı bulunduğunu düşündüren lekeli edildi. Daha fazla co yerelleştirme değerlendirmek ve böylece en iyi genel Bacillus çimlenme proteinlerin kuruluşun iç spore membran almak için çift muhabir proteinler membran boyalar ve germinosome yordamları etiketleme kullanın çalışmalar vardır mümkün.

Introduction

Sporlar siparişlerin Bacillales ve Clostridiales metabolik olarak uyuyan ve olağanüstü dayanıklı sert dekontaminasyon rejimler, ama onlar çimlenme sürece, zararlı etkileri insanlar¹' neden olamaz. İçinde besin germinant tetiklenen çimlenme Bacillus subtilis (B. subtilis) sporlar, inisiyasyon olay germinant reseptörleri (gr) Spor'ın iç zar (IM) yer alan germinant bağlamadır. Daha sonra GRs sinyalleri de IM içinde bulunan SpoVA kanal protein transduce. Bu spor çekirdek pyridine-2,6-Dikarboksilik asit (dipicolinic asit; Satım başlangıcı olur DPA; spore çekirdek kuru wt % 20'si oluşan) SpoVA kanal üzerinden su için. Daha sonra korteks peptidoglikan hidroliz aktivasyonu DPA serbest tetikler ve^2,3,4ek su alımını izler. Bu olaylar için mekanik stres yol kat kat, onun sonraki rüptürü, akıbet başlangıcı ve son olarak, bitkisel büyüme. Ancak, çimlenme işleminin tam moleküler ayrıntılarını hala uzakta çözümlenir.

Spor çimlenmesi hakkında önemli bir soru IM çimlenme proteinler ve IM SpoVA kanal proteinler çevreleyen lipidler biyofiziksel özellikleri ile ilgili. Bu büyük ölçüde hareketsiz IM lipid bilayer bazıları kendi eylem spor çekirdek veya bitkisel hücre sitoplazma^5,6sarfetmek toksik kimyasal koruyucu dahil olmak üzere birçok küçük moleküller için ana geçirgenliği engeldir. IM⁵mobil lipidler önemli bir kısmını olsa bir jel durumda IM lipid bilayer olasıdır. Spore's IM de önemli genişleme⁵için potansiyele sahiptir. Böylece, 1.6-fold IM yüzey alanını artırır çimlenme olmadan ek membran sentezi üzerine ve bu zar'ın karakteristik düşük geçirgenlik ve lipid hareketsizlik^5,6kaybı tarafından eşlik ediyor.

Çimlenme proteinler aktivasyonu ve sporlar IM lipidler organizasyonu moleküler ayrıntılarını çalışma için çekici konular olsa da, B. subtilis sporlar küçük boyutu ve çimlenme proteinler, nispeten düşük bolluk bir meydan okuma teşkil Mikroskopik analizler için. Griffiths vd. epifluorescence mikroskop kanıt zorlayıcı, floresan gazetecilere çimlenme proteinler için erimiş kullanarak önerir B. subtilis sporlar üç GR alt birimleri (A, B ve C) GerA, B ve K GRs iskele protein GerD düzenler, bir küme⁷'. Bu küme çimlenme proteinlerin için 'germinosome' terim icat ve yapıları ~ 300 nm büyük IM protein foci⁸olarak nitelendirdi. Spor çimlenmesi başlatılması floresan germinosome foci sonuçta değiştirmek içine daha büyük dağıtmak floresan desenleri ile > sporlar bu modeli görüntüleme spore nüfusun % 75 germinated L-Valin⁸ile 1 h için. Kullanılan yukarıda belirtilen kağıt istatistiksel güç kazanmak ve görüntüleme sırasında gözlenen düşük floresan sinyallerini engeli aşmak için ardışık floresan resimlerin düzinelerce görüntülerden ortalama Not. Bu görselleştirme bakteriyel sporlar bu yapıların klasik mikroskobik araçları ve ben de foci bir tek spor miktarı değerlendirilmesi teknik açıdan ne de ne de onların daha ayrıntılı hücre altı yerelleştirme yapıldı Bu yaklaşım ile mümkün.

Burada, biz, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (detaylı görsel öğeyi almak için SIM) kullanımı ve sporlar B. subtilisyanı sıra kendi IM lipid etki alanları⁹germinosome(s) miktar göstermek. Protokol için de yönergeler sporulation, slayt hazırlama ve görüntü analizi SIMcheck (v1.0, bir imageJ eklenti) tarafından ImageJ^10,11,12yanı sıra içermektedir.

Protocol

1. B. subtillis Sporulation (zamanlama: mikroskobik gözlem önce 7 gün)

1. Gün 1
   1. Bir bakteri kültürü bir Luria-Bertani suyu (LB) agar plaka (%1 tryptone % 0.5 Maya ekstresi, %1 NaCl, %1 agar)¹³ tarihinde çizgi ve gecede 37 ° C de tek kolonileri elde etmek için kuluçkaya. B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kedi, gerD-gfp kan) zorlanma ve onun üst arka plan zorlanma B. subtilis PS4150 kullanın (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)⁷daha önce açıklandığı gibi.
      Not: Sporlar ΔcotEΔgerE arka plan ile kullanımı, germinosome görsel öğeyi spore kat kat⁷autofluorescence en aza indirmek için esastır.
   2. Tüm medya, tüpler, pipets ve uygun yöntemleri ile kullanılmak üzere diğer kültür malzemeleri sterilize.
2. 2. gün
   1. Bir koloni 5 mL LB orta de sabah erken aşılamak ve OD₆₀₀ 0,3-0,4 (yaklaşık 7 h) ulaşıncaya kadar kültür sürekli ajitasyon bir vidalı kapak tüp 200 d/d/dak ve 37 ° C altında kuluçkaya.
   2. SÜPÜRGEYİ orta (pH 7.5) 500 mL olun içeren 3 nM (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 0.4 mikron H₃BO₃, 30 nM CoCl₂·6H₂O, 10 nM CuSO₄·5H₂O, 10 nM ZnSO₄·7H₂O, 1.32 mM K₂HPO₄, 0.4 mM MgCl₂·6H₂O, 0.276 mM K₂kadar₄, 0.01 mM FeSO₄·7H₂O, 0.14 mM CaCl₂·2H₂O, 80 mM MOPS, 4 mM Tricine, 0,1 mM MnCl₂·2H₂O, 10 mM D-glikoz-monohidrat ve 10 mM NH₄Cl.
   3. Vidalı kapak tüpler 10^-1- 10^-7 seri dilutions 5 ml LB kültürünün BEZLERİ orta hazırlayın ve kültürler gecede 200 d/d/dak ve 37 ° c de sürekli ajitasyon altında kuluçkaya
      Not: Burada hazırlanan seri dilutions ertesi sabah erken üssel faz bir seyreltme elde hedefliyoruz. Bu adımı ve sonraki adım hücrelere BEZLERİ tamponlu büyüme ortamına uyum sağlamak gereklidir.
3. 3. gün
   1. 0,3-0,4 BEZLERİ dilutions bir OD₆₀₀ ile birini seçin. Önceden ısıtılmış (37 ° c) BEZLERİ orta 20 mL konik 250 mL şişe içinde kültürünün 0.2 mL aşılamak ve OD₆₀₀ 0,3-0,4 (~ 7 h) ulaşıncaya kadar altında sürekli ajitasyon kuluçkaya.
   2. Adım 1.3.1 den %1 (v/v) öncesi kültür ile SÜPÜRGEYİ tabanlı sporulation orta (250 mL) aşılamak ve sürekli ajitasyon altında bir konik litre şişe içinde 37 ° C'de 3 gün kuluçkaya. FM4-64 PS4150 sporlar boyama için 2 µg/mL FM4-64 sonda ( Tablo malzemelerigörmek) sporulation orta 1 veya 2 h için bitkisel büyüme (genellikle yaklaşık 2) OD₆₀₀ değeri en yüksek ulaştıktan sonra ekleyin ve kültür için daha sonra ışık⁵korumak iken sporulate.
4. 7. gün: sporlar hasat
   1. Faz parlak sporlar faz karanlık hücrelerden ve muhtemelen olgun sporlar ayırt etmek için 100 X büyütme oranında faz kontrast mikroskobu kullanılarak sporulation verim (sporlar vs bitkisel hücreleri) belirlemek. % 90'ı faz parlak spore verim bekleniyor.
   2. Sporlar 4270 x g yuvarlak alt santrifüj tüpleri 4 ° C'de 15 dakika, cips. 2 - 3 kez ile 40 mL steril ultra-saf tip demineralize 1 su spor Pelet ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL konik santrifüj tüplerde yıkayın. Spin aşağı, her yıkamada 4270 x g 15 dakika (4 ° C).
5. 7 gün: Spore arıtma
   1. Spore arıtma: spore Pelet % 20 Nonyonik yoğunluk gradient orta 750 µL içinde askıya alma ( malzemelerin tabloyabakın) ve yük % 50 Nonyonik yoğunluk gradient orta sterilize microcentrifuge tüpler 800 µL üzerine. Santrifüj 21,500 x gde 60 dk için. Elde edilen Pelet ücretsiz sporlar içerir. Spore Pelet % 20 Nonyonik yoğunluk gradient orta 200 µL içinde askıya alma ve 1 mL % 50 Nonyonik yoğunluk gradient orta microcentrifuge tüp ve santrifüj 21,500 x gde 15 dakika içinde üzerine yükleyin.
   2. Final spor hazırlık ve depolama yıkama: Pelet elde edilen arıtılmış uyuyan sporlar içerir. Spore Pelet 1,5 mL steril ultra-saf tip 1 ile 2 - 3 kez ( Tablo malzemelerigörmek) su ve spin arasında 9,560 x g 4 ° C'de 15 dakika, aşağı yıkama Son olarak, yaklaşık 30 son OD₆₀₀ steril ultra-saf Type 1 suda Pelet askıya alma. Aliquots sporlar, 8 hafta¹⁴-80 ° C'de muhafaza edilebilir.

2. birleştirilmiş

1. PS4150 sporlar tedavi (SDS) ile 0.1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% Sodyum Lauryl Sülfat / 0,1 M dithiothreitol (DTT) 1 h. için 70 ° C'de yıkama sporlar 10 kat ile sterilize ultra-saf Type 1 su^15,16. Böylece, herhangi bir spor'ın dış membran FM4-64 soruşturma adsorbe ve dış katmanlarını kaldırılacak.

3. Coverslip ve slayt hazırlama¹¹ (zamanlama: 1s gözlem önce)

1. 30 dk içinde hafifçe sallayarak bir su banyosu için 1 M HCl ile önceden temiz yüksek hassasiyetli coverslips ( malzemelerin tabloyabakın). Coverslips iki kez ultra-saf Type 1 suda yıkayın ve %100 (vol/vol) alkol depolayabilirsiniz. Bırak kuru ve onların netlik kullanmadan önce doğrulayın. % 70 cam slaytlar önceden temiz alkol. Bırak kuru ve onların netlik kullanmadan önce doğrulayın.

4. örnekleme floresan mikroküreler veya sporlar Gene çerçevesinde slayt (15dk zamanlama)¹⁰

1. İki % 70 alkol temizlenmiş önceden sıcak ve 70 ° C Isıtma blokta birkaç saniye ( malzemelerin tabloyabakın) kurutulmuş cam slaytlar hava, steril % 2 özel bir cam slayt üzerine 70 ° C'de tutulan 65 μL damla ve diğer cam slayt özel b yaymak için üzerinde yer rasında slaytlar. Özel yama yaklaşık 5 dakika içinde kuruyacak.
2. Cam slaytlardan birini çıkardıktan sonra 1 x 1 cm bölümüne özel yama kesmek, 0.4 μL örnek (floresan mikroküreler veya ~ 10⁸/mL sporlar) ekleyin ve coverslip yama üzerine yerleştirerek yüksek hassasiyetli coverslip üzerine yama transfer ve kapalı kayar.
3. Böylece slayt kullanılmak üzere mikroskobu Tamamlanıyor çerçeve, her köşesinde kapanış coverslip üzerine yerleştirilir kurutulmuş slayda bir gen çerçeve (1.5 x 1.6 cm², 65 µL) düzeltmek.

5. görüntüleme^11,17(zamanlama: 1 H)

1. Sporlar iletim ve floresan görüntülerin yanı sıra kırmızı karışımı yakalamak ve sarı-yeşil karboksilat-modified floresan mikroküreler yapılandırılmış aydınlatma mikroskop üzerinde petrol objektif () x 100 ile donatılmış ( malzemelerin tabloyabakın) Sayısal diyafram 1.49 =), bir CCD kamera ve görüntü analiz yazılımı ( malzemelerin tabloyabakın). Ortam ışığı karışıklık olmadan oda sıcaklığında tüm görüntüler oluşturmak. Her zaman 100 x amaç ve slayt görüntüleme önce % 75 etanol ile temizlemek emin olun.
2. 100 nm (çapı) floresan mikroküreler üzerinde odaklanmak ve simetrik psf elde edilir, böylece görüntü bulanık en aza indirme kadar 100 x objektif düzeltme halkada ayarlayarak yaymak noktası işlevi (psf) en iyi duruma getirme. Psf impuls cevabı ya da bir nokta kaynak veya point nesnesi bir görüntüleme sisteminin yanıtı var.
3. Görüş alanı yaklaşık 10 yuvarlak floresan mikroküreler ile seçin. Bir ızgara geçerli odak ayarı ile her iki 561 nm ve 488 nm uyarma dalga uzunlukları görüntü analiz yazılımı için rehber olarak.
4. Sporlar iletim ışık ile odak ve bir iletim ışık her resim için 200 ms pozlama ile 16 × ortalama modunda çekim.
5. Sporlar 14 bit ve EM kazanç 175, aydınlatma modu "3D-SIM", kamera ayarlarını okuma moduna elektron teksir makinesi (EM) kazanç 10 MHz ile 3D-SIM ham floresan görüntülerini yakalamak. PS4150 sporlar 561 nm lazer ışık % 20 lazer gücü ile FM4-64 soruşturma ve 400 ms bir aydınlatma süresi heyecanlandırmak.
6. GerKB-mCherry heyecanlandıracak ve GerD-GFP KGB80 içinde sporlar ile sırasıyla, 561 nm lazer % 30 lazer güç ışığı 1 için s ve % 60 488 nm lazer ışık 3 s. Z-yığını ayarlar modu, 0.2 µm alt / adım için üst, 7 adımlar ve germinosome için 20 adımları için güç lazer ve IM analizi, anılan sıraya göre.
   Not: Bu lazer parametreler çubuk grafik penceresi yaklaşık 4000 maksimum parlaklık değeri sağlamak için uygulandı.

6. yeniden FM4-64 PS4150 sporlar lekeli 3D-SIM ham görüntüleri

1. N-SIM dilim imar PS4150 sporlar ham veri lekeli FM4 64 için gerçekleştirin. N-SIM dilim yeniden yapılandırma penceresini açmak için N-SIM defteri sekmesi sayfa Yeniden dilim için Param butonuna tıklayın.
2. Yeniden parametreler N-SIM dilim imar penceresinde ayarlayın. Mükemmel yeniden oluşturulan görüntüler elde etmek için öneri N-SIM yönergeleri izleyin ve uygun denetimleri Otomatikolarak, yüksek Aydınlatma modülasyon kontrast (IMC) ayarlamak için N-SIM dilim imar penceresinde tıklatın Çözünürlük gürültü bastırma (HRNS) 1.00 ve Odak görüntü bastırma (OFBS) dışarı için başlangıç noktaları olarak 0,05.
3. Görüntüyü yeniden oluşturmak için N-SIM dilim imar penceresinde Dilimi yeniden düğmesini tıklatın. Fast Fourier dönüşüm (FFT) görüntüler ve yeniden yapılanma¹²' den sonra görüntülemek imar skor tarafından yeniden oluşturulan görüntülerin kalitesini değerlendirmek.
4. 0,10 itibaren HRNS ayarlamak 5,00 ve OFBS 0,01 iyi parametre ayarları elde edilen kadar tıklayarak N-SIM dilim imar penceresinde uygun kontrollerin 0,50.
5. N-SIM dilim Reconstuction değişen parametreleri geçerli pencereye Uygula düğmesini tıklatın. Pencereyi kapatmak için Kapat düğmesini tıklatın.
6. Bir FM4-lekeli PS4150 sporlar raw görüntü etkin ve N-SIM Pad sekme sayfasında Yeniden dilim düğmesini tıklatın Dilim yenidenyürütmek için 64 olun. Yeniden oluşturulan resmi kaydedin.

7. görüntü analizi

1. KGB80 germinosome pseudo-Widefield görüntüleri dönüştürmek
   1. 3D-SIM KGB80 ham görüntülerini bir sol tıklama ile SIMcheck yardımcı programı Ham veri SI Pseudo-Widefield¹²ImageJ eklenti etkinleştirerek Pseudo-Widefield görüntülere dönüştürmek. Pseudo-Widefield ham SIM veri görüntülerden ortalamasını alır ve toplanır, karşılaştırma için görüntüyü geleneksel widefield aydınlatma¹²' ye eşdeğer. ImageJ için https://imagej.net/Welcome bakın. Rastgele ~ 25 sporlar floresan Pseudo-Widefield görüntüleri daha sonra germinosome analiz için her ters iletim görüntü seçin.
   2. Toplamda yaklaşık 350 (Bu örnekte, 346) KGB80 sporlar içinde iki slayt bakıldığında 14 alanları seçin. Seçili KGB80 sporlar GerD-GFP ve GerKB-mCherry floresan foci sayılar bağımsız olarak iki araştırmacılar tarafından dikkate. Araştırmacı geri 3D-SIM pişmemiş imge ne zaman sporlar ayrı floresan germinosome foci varlığı şüphe içinde anlamlara gelebilir.
   3. Her GerD-GFP ve GerKB-mCherry odak en büyük şiddetlerde ve her KGB80 spore's 3D imge ImageJ ile entegre şiddetini değerlendirmek.
2. Pseudo-Widefield KGB80 germinosome görüntülerini analiz
   1. 7 yığınları ortalama entegre yoğunluk değerini KGB80 spor tümleşik sinyal şiddeti kullanın. Arka plan yoğunluklarda aynı ayarları kullanarak arka plan zorlanma PS4150 Imaging tarafından belirler. Arka plandan açıkça ayırt olduklarında floresan noktalar tek tek KGB80 sporlar germinosome foci görür.
   2. Yazılım kökenli 9.0 kararlılıkla önemi için tek yönlü ANOVA testleri uygulanır. P değerleri dikkate alınarak < 0,05 istatistiksel olarak önemli. Spearman'ın sıralama korelasyon katsayısı¹⁸ GerD-GFP ve GerKB-mCherry foci numarası korelasyon ve tümleşik sinyal şiddeti ölçümleri değerlendirmek için kullanın.

Results

Geçerli protokol bakteriyel sporlar için bir SIM mikroskop düşsel yordam sunar. Sporulation ve slayt hazırlama işlemleri görüntüleme önce şekil 1 ' de gösterildiği gibi yapılmıştır. Daha sonra görüntüleme ve analiz prosedürleri uygulanmış olan her ikisi için dim (floresan protein çimlenme protein etiketli) ve parlak (lipofilik sonda IM lekeli) Spor örnekleri aşağıdaki metinde görüldüğü gibi.

Discussion

Sunulan Protokolü FM4- B. subtilis sporlar lekeli sporulation, slayt hazırlama ve işlemleri görüntüleme içeren 64 çözümlenmesi için bir standart 3D-SIM yordam içerir. Ayrıca, değiştirilmiş SIMcheck (ImageJ) protokolünü açıklar-işlem için SIM mikroskobu ile floresan gazetecilere etiketli B. subtilis spor germinosomes, Imaging 3D destekli. İkinci yordamı bu loş altyapı geliştirilmiş kontrast ile gözlemlemek için bize izin. İki görüntüleme yordam kaplin tarafından böylece çimlenme işleminin mekanik bir anl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hava ile kurutulmuş cam slaytlar	Menzel Glä ser	630-2870
APO TIRF N20R8 100 kez; yağ hedefi (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mKiraz kedisi, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 Δ gerE::spc, & Delta; cotE::tet)
Erlenmeyer şişeleri 1 L	Sigma-Aldrich	Z567868
Erlenmeyer şişeleri 250 mL	Sigma-Aldrich	Z723088
FluoSpheres karboksilat modifiyeli mikroküreler	Invitrogen, 0.1 & mu; m	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	F34653
Histodenz noniyonik yoğunluk gradyan ortamı	Sigma-Aldrich	D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD kamera	Andor Teknolojisi		https://imagej.net/Welcome
LB Agar	Sigma-Aldrich	L2897
Mikrofüj tüpleri 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	3451PK
Mikroskop görüntüleme yazılımı	Nikon, Japonya	NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrasaf Deminerilzed Su	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti mikroskop
Polipropilen Vidalı Kapaklı Şişe 180 mL	Thermo Fisher Scientific	75003800
Hassas Lameller	Paul Marienfeld	117650
Yuvarlak Tabanlı borular 15 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM
Vidalı kapaklı tüpler 50 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM