Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Submandibular ve parotis tükürük bezlerinden Organotipik kültürlerin radyasyon tedavisi anahtar In vivo özellikleri

7.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59484

⸱

17 Mayıs 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Arizona, 2Cancer Biology Graduate Interdisciplinary Program, University of Arizona, 3Department of Chemical Engineering, University of Arizona

Bu makalede

Özet

Morfoloji ve tükürük bezlerinin fonksiyonel belirteçleri görselleştirmek için üç boyutlu organotypic kültürler kullanarak radyasyon aşağıdaki doku hasarı mekanizmaları yeni anlayış sağlayabilir. Burada açıklanan bölüm, kültür, ışınlama, leke ve görüntü 50 – 90 μm kalınlığında tükürük bezi bölümleri önce ve iyonlaştırıcı radyasyon maruz aşağıdaki bir protokoldür.

Özet

Hiposalivasyon ve ağız kuruluğu, radyoterapi ile tedavi edilen baş ve boyun kanseri hastalarında yaşam kalitesini azaltan kronik sözlü komplikasyonlar yaratır. Tükürük bezi fonksiyon bozukluğu ve restorasyon mekanizmalarının anlaşılması için deneysel yaklaşımlar, sistematik olarak terapötik adaylara ve transfeksiyon verimliliklerini ekrana getiren bir yetersizlik ile engelli olan in vivo modellerde duruldu belirli genler işlemek için yeteneği. Bu tükürük bezi organotypic kültür protokolünün amacı, kültürün en uygun süresini değerlendirmek ve ex vivo radyasyon tedavisinden sonra hücresel değişiklikleri karakterize etmektir. 30 günlük kültür döneminde belirli hücre nüfus ve işaretçileri ne zaman bulunduğunu belirlemek için immünofluorescent boyama ve Konfokal mikroskopisi kullandık. Buna ek olarak, daha önce in vivo radyasyon modellerinde bildirilen hücresel işaretler, ex vivo ışınlanmış kültürlerde değerlendirilir. İleriye doğru hareket eden bu yöntem, tükürük fonksiyonunu geliştiren terapötik ajanlar için duvar ve insan tükürük bezi dokusu yanıtlarının hızlı ex vivo değerlendirmesi için cazip bir platformdur.

Giriş

Uygun tükürük bezi fonksiyonu ağız sağlığı için esastır ve radyoterapi ile baş ve boyun kanseri tedavisi aşağıdaki değiştirilir1. 2017 yılında Amerika Birleşik Devletleri2' de yaklaşık 50.000 yeni baş ve boyun kanseri vakaları bildirilmiştir. Doku-zararlı ve genellikle tükürük bezleri gibi normal dokulara çevreleyen radyasyon tedavisinin geri dönüşümsüz etkileri nedeniyle, hastalar sıklıkla ciddi yan etkileri ve azalan yaşam kalitesi ile bırakılır2,3, 4' ü yapın. Aksostomi (Kuru ağız subjektif hissi), diş çürükleri, çiğnemek ve yutmak, konuşma bozuklukları ve tehlikeye oral mikrobiomes2 gibi semptomlarda radyasyon hasar belirtileri nedeniyle yaygın komplikasyonlar, 3 ' ü , 4. bu belirtiler topluca kötü beslenme ve etkilenen bireyler hayatta kalma bozukluğu yol açabilir5. Bu nüfusun tükürük bezi disfonksiyon iyi belgelenmiş iken, asiner hücrelerine hasar temel mekanizmaları tartışmalı olmuştur, ve farklı hayvan modelleri arasında az entegrasyon vardır5/6.

Tükürük bezi fonksiyonu ve radyasyona bağlı hasar eğitimi mevcut yöntemler in vivo modellerin kullanımı dahil, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, iki boyutlu (2-D) Primer hücre kültürlerinin, ve üç boyutlu (3-D) salisphere kültürler8, 9,10,11,12. Geleneksel olarak, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve 2-D kültürler hücre kültürü modelleri düz yüzeyler üzerinde kültürlü tek katmanlı hücreler içerir ve hızlı, kolay ve maliyet-etkili deney için değerlidir. Bununla birlikte, yapay hücre kültürü koşulları çeşitli koşullara maruz kalan hücrelerin farklılaşma durumunu ve fizyolojik yanıtlarını değiştirebilir ve sonuçlar genellikle tüm organizmalar için14,15' e tercüme etme başarısız olur. Buna ek olarak, ölümsüzleştirilmiş hücre kültürlerinde DNA hasarı için tükürük bezi tepkisi için kritik p53 aktivite, modülasyon gerektirir16,17.

3-D salisphere kültürler, kültür erken zaman noktalarında kök ve progenitör hücreler için zenginleştirilmiştir ve bu tükürük bezi hücrelerinin bu alt kümesinin radyosensitivite anlamak için yararlı olmuştur9,18. Tüm bu kültür modellerinin kritik bir sınırlaması, tükürük bezinin 3-b yapısının görselleştirilmesinde etkisiz olup, çeşitli katmanlar üzerinde hücre içi matris (ECM) ve hücreler arası etkileşimler de dahil olmak üzere, tükürük modülasyon açısından çok önemlidir. salgı15. Bir bütün olarak doku davranışını kapsar ama aynı zamanda tedavinin etkilerini incelemek için laboratuvar koşullarında manipüle edilebilir bir yöntem için ihtiyaç daha da radyasyon kaynaklı tükürük bezi temel mekanizmaları keşfetmek için gereklidir Disfonksiyon.

Canlı doku bölümleme ve kültür önceden belgelenmiştir19,20 ve genellikle beyin-doku etkileşimleri incelemek için kullanılan21. Önceki çalışmalarda, farelerden parotis (PAR) tükürük bezi dokusu yaklaşık 50 μm ' ye kadar yer aldı ve 48 h 'ye kadar Kültürlenmiş, daha sonra19' luk, hücre ölümü ve fonksiyon analizi yapıldı. Su ve Al. (2016) Bu metodoloji üzerinde, insan submandibular bezlerinin (SMGs) 35 μm veya 50 μm ' de 14 gün20' ye kadar bölünerek genişletilmiştir. Önerilen yöntem, 50 μm ve 90 μm ' de kesitli parotis ve submandibular tükürük bezleri ve kültürlerin 30 gün boyunca değerlendirilmesi içeren bir gelişmedir. Bir dizi doku kalınlığının kesilmesi yeteneği, apikal-basolateral Polarite ve salgılanma için innervasyon dahil olmak üzere hücresel süreçler için ilgili hücre hücresi ve hücre-ECM etkileşimlerini değerlendirmede önemlidir. Ayrıca, tükürük bezi dilimleri radyasyon kaynaklı tükürük bezi hasarı incelemek için bu kültür modelinin fizibilitesi belirlemek için kültürde iken ışınlanmış.

Bu tükürük bezi organotypic kültür protokolünün amacı, kültürün en uygun süresini değerlendirmek ve ex vivo radyasyon tedavisinden sonra hücresel değişiklikleri karakterize etmektir. Kalıcı Post-diseksiyon olan maksimum zaman bölümlerini belirlemek için, tripan mavi boyama, canlı hücre boyama ve hücre ölümü için immunhistokimyasal boyama yapıldı. Özel hücre popülasyonları, morfolojik yapıları ve proliferasyon düzeylerini değerlendirmek için Konfokal mikroskobik ve immünofluorescent boyama kullanılmıştır. Doku bölümü kültürlerinin de bu 3-b modelinde çeşitli işaretçileri üzerinde radyasyon etkilerini belirlemek için iyonlaştırıcı radyasyon maruz kalmıştı. Hücre ölümü indüksiyonu, sitorinasyon bozulması, ayrım işaretçileri kaybı ve ışınlanmış ex vivo kültürlerde telafi edici proliferasyon, In vivo modellerin önceki çalışmalarla karşılaştırıldı. Bu metodoloji, radyasyon hasarını takiben hücre-hücre etkileşimlerinin rolünü araştırmak için bir yol sağlar ve terapötik müdahalelerin etkinliğini (gen manipülasyonları veya farmakolojik ajanlar) etkili bir şekilde değerlendirmek için deneysel bir model sağlar ) in vivo modellerde daha az uygun olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. vibratomun hazırlanması

  1. Tampon tepsisi, bıçak eki, agaroz blok kalıbı ve% 70 etanol ile laboratuvar filmi dahil olmak üzere vibratomun çıkarılabilir bileşenlerini sprey, daha sonra en az 30 dakika boyunca UV-sterilize.
  2. Buzun düşmesini önlemek için tampon tepsisinde ek bir laboratuvar filmi yerleştirin ve güvenli bir şekilde sabitleyin.
  3. Buz odasını ezilmiş buzla doldurun, laboratuvar filmini tampon tepsisine çıkarın ve tampon tepsisini 100 mL buz-soğuk 1x fosfat tamponlu (PBS) çözeltisi ile doldurun 1% penisilin-streptomisin-ampisilin (PSA) ile tamamlayıcı.
  4. Paslanmaz çelik bir jilet bıçak tutucusuna yerleştirin. Tornavida kullanarak sıkın/gevşetin ve blade açısını değiştirin.

2. vibratomu kullanarak agaroz blokta doku numunesi hazırlama ve sekleme

  1. Forseps, makas ve boya fırçaları dahil olmak üzere tüm gerekli diseksiyon ve sekleme araçlarını autoclave.
  2. Agaroz çözüm haline gelene kadar steril 1x PBS ve mikrodalga içinde% 3 düşük erime noktası agaroz hazırlayın. Çözelti üzerinde kaynatma değil emin olun ve karışımı için periyodik şişe girdap.
    Not: ılık su banyosunda tutarak, düşük eritme agaroz 'nin katılaşma yapılmasını engelleyin. Düşük Melt agaroz 37 °c ' de sıvıdır ve 25 °c ' de ayarlar. Ancak, su banyosu fizyolojik sıcaklıkta doku etrafında agaroz dökmek için 40 °c altında olmalıdır.
  3. Tükürük bezlerini yalıtın ve disseke dokuyu 2 ml buz-soğuk 1x PBS steril, 30 mm Kültür çanak% 1 PSA ile tamamlayıcı içine yerleştirin.
  4. Otoklavlı forseps kullanarak, 1x PBS + 1% PSA çözeltisi ve bir gömme kalıp altındaki pozisyonda tükürük bezlerini çıkarın. Dokusu kapsayacak şekilde sıvı 3% düşük erime noktası agaroz ile kalıp doldurun.
  5. Forseps kullanarak, blok ortasına doku ayarlamak ve uygun düzlemde tükürük bezi konumlandırmak. Submandibular ve parotis bezleri için en iyi çapraz bölümler dikey düzlemde bulunmaktadır.
  6. 10 dakika boyunca buz üzerinde agaroz blok yerleştirin sertleşmesine.
  7. Özenle gevşetmek için agaroz dış kenarı etrafında bir jilet çalıştırmak ve adım 1,1 UV Sterilized laboratuar filmi üzerine blok slayt izin.
  8. Tükürük bezi içeren bir agaroz kutu kesmek için bir jilet kullanın. Bölümün düzleminin düz ve blokun karşı tarafına paralel olduğundan emin olun (aşağı yapıştırılmış olacak yüzey). Agaroz dokuya sızmaz beri, doku iyi desteklenecektir böylece doku etrafında çok fazla agaroz kapalı Trim yok.
  9. Bloğu kesme yüzeyine takmak için süper tutkal kullanın.
  10. 50 μm veya 90 μm kalınlıkta, 0,075 mm/s hızda ve 100 Hz frekansında vibratom ile bölüm.
    Not: vibratomu en yüksek frekanslı ve en düşük bıçak hızıyla ayarlamak çok iyi dilimleri sağlar.
  11. 24-iyi doku kültürü yemek içeren bölümler toplamak ~ 1 mL buz-soğuk PBS her iyi bir otoklav kullanarak, doğal saç fırça, fırça yerleştirme 70% etanol arasında dilim koleksiyonları sterilitesi korumak için.

3. kültür bölümleri

  1. Otoklav, mikro spatula ve forseps.
  2. Fetal sığır serumu (FBS) ile veya olmadan Stock vibratome kültür ortamını yapın: 1% PSA, 5 μg/mL transferrin, 1,1 μM hidrokortizon, 0,1 μM retinoik asit, 5 μg/mL insülin, 80 ng/mL epidermal büyüme faktörü, 5 mM L-glutamin, 50 μg/mL ile tamamlayıcı DMEM/F12 medya gentaminisin sülfat ve 10 μL/mL iz eleman karışımı. % 0, 2,5%, 5,0% veya% 10 çözüm yapmak için uygun miktarda FBS ekleyin.
  3. Bölümleme işleminden önce 300 μL ön ısıtılmış medya ekleyin ve 12 mm çapında, 0,4 μm gözenek boyutunda, 24 kuyu dokusu kültür plakasının her bir kuyusu içine yerleştirin. Medya, kültür için sıvı hava arayüzü oluşturmak üzere membran alt kısmına ulaşmalıdır.
  4. 37 °C ' de mikro spatula ve kültürü kullanarak membran ekleminin üst kısmındaki tükürük bölümlerini nazikçe% 5 CO2 ve% 95 hava atmosferinde kuluçka cihazı ile hafifçe koyun.
    1. Yaklaşık 300 μL primer kültür ortamını kuyu içine ve birkaç damla membran eklerine (yaklaşık 40 μL) her gün veya gerektiğinde ekleyin. Uygun kültür hücreleri hayatta ve 30 gün ex vivo kadar korunur mümkün olduğunu gösterdi.

4. tükürük bezi bölümlerinin ışınlanması

  1. Kobalt-60 (veya eşdeğer) ışınlama kullanarak tek doz radyasyon (5 GY) ile bölümleri tedavi edin.
    1. Sıcaklık dalgalanmalarını önlemek için kapalı bir Strafor kabı kullanarak ışınlama tesislerine taşıma bölümleri. Buna ek olarak, medya kültürü kapak üzerine sıçrama ve kontaminasyonu sağlamak için laboratuar kuluçarı geri taşıma sırasında bakım alınması gerekir.
    2. Bir 32 "x 32" radyasyon alanının merkezinde, radyasyon kaynağından 80 cm tükürük bezi bölümleri içeren 24-kuyu plaka yerleştirin. Radyasyon dozu hesaplamaları ve radyatörde ilgili zaman enstrüman ve Kobalt-60 çürümeye göre değişir.
  2. Bölüm 3 ' te açıklandığı gibi bu bölümleri izlemeye ve kültürleme işlemine devam edin.

5. viability boyama

  1. Steril, önceden ısıtılmış 1x PBS ile eski medyayı aspirate ve dilimleri iki kez yıkayın.
  2. Tripan mavi boya ile leke bölümleri.
    1. Dilim bir cam slayt kültürden taşımak için bir mikro-spatula kullanın.
    2. Doku (10 – 20 μL) kapsayacak kadar hacim ile vibratome dilim% 0,4 tripan mavi çözüm ekleyin.
    3. Dokuya nüfuz etmek için boya için 1 – 2 dakika boyunca tripan mavi renkte oda sıcaklığında (RT) dilimleri kulyın. Uygun olmayan hücreler mavi renkte lekelenecek ve geçerli hücreler lekelenecektir.
  3. Kalcein ile leke bölümleri, canlı hücreli boya.
    1. 24 iyi plakanın (200 – 300 μL) bir kuyunda bölümü kapsayacak kadar leke hacmi ekleyin.
    2. Boya penetrasyonunu sağlamak için dilimleri RT 'de 15 dakika boyunca inküye.
    3. Dikkatle kuyu ve yerden bir cam slayt bölümü kaldırın. 1 damla montaj ortamına sahip dilimleri bağlayın.
    4. 488 nm ve 515 nm uyarma/emisyon dalga boylarında floresan mikroskop üzerinde görüntü bölümleri.

6. Antibody boyama vibratome bölümleri

Not: aşağıdaki, ki-67 için özel bir genel antikor boyama Protokolü sağlar; Ancak, bu protokol herhangi bir antikor ile kullanılabilir. Aksi belirtilmediği sürece tüm yıkıyor RT 'de gerçekleştirilir.

  1. Çok iyi doku kültürü çanak, medya Aspire ve steril 1x PBS ile en az 2x yıkayın.
  2. 4 °c ' de bir gecede% 4 civarında formaldehite (PFA) kullanarak bölümleri düzeltin.
  3. % 4 PFA kapalı aspirate ve PBT ile 3x yıkayın [1x PBS, 1% sığır serum albümin (BSA), 0,1% Triton X-100].
    Not: bölümler 4 °C ' de 1x PBS 'de saklanabilir ve daha sonraki bir zamanda lekelenebilir. Bu yazıda test edilen maksimum depolama süresi 3 haftadır. Daha uzun depolama süresi istenirse bireysel kullanıcı tarafından optimize edilmesi gerekir.
  4. 1x PBS 'de% 0,3 Triton X-100 kullanarak bölümleri 30 dakika boyunca geçirgen.
    Not: Bu adım değiştirilebilir ve özel antikor boyama ve geçirmezlik için optimize edilebilir.
  5. Geçirgen solüsyonu pipet kapalı.
  6. 1x PBS,% 1 BSA ve 0,1% Triton X-100 (PBT) ile 5 dakika boyunca 3 adet dilim yıkayın.
  7. 1 h için% 1 normal keçi serumu ile engelleme aracı ile dilimleri engelleyin.
  8. PBT ile dilimleri 3x 5 dakika yıkayın.
  9. 500 μL Anti-Ki67 tavşan monoklonal antikor 1x PBS 'de% 1 BSA 'da seyreltilmiş, 4 °C ' de gece dilimlerini kulvatın.
    Not: phalloidin boyama Için, adım 6,9 atlayın ve kullanılan belirli phalloidin için protokol kullanmaya devam edin. DNA karşı leke için, adım 6,15 atlayın.
  10. Aspirate Anti-Ki67 tavşan monoklonal antikor.
  11. Dilimleri 6x 'i 1x PBS 'de 5 dakika yıkayın.
  12. 500 μL 'de dilimleri, hafif kaplı 1,5 h için RT 'de 1x PBS 'de% 1 BSA 'da seyreltilmiş Anti-Ki67 antikor ile uyumlu floresan konjonktür ikincil antikor içinde kulvatın.
    Not: kullanılan ikincil antikor dayalı, ikincil antikor ile kuluçta süresi daha fazla bireysel kullanıcı tarafından optimize edilebilir. Buna ek olarak, ikincil antikor hafif duyarlıdır. Sonraki tüm yıkanabilir karanlıkta yapılmalıdır.
  13. İkincil antikor aspirate.
  14. 1x PBS ile dilimleri 5 dakika boyunca 3x için yıkayın.
  15. Deiyonize suda 5 dakika boyunca dilim yıkayın.
  16. RT 'de 20 dakika boyunca DAPI (1μg/mL) ile dilim karşı leke.
  17. Deiyonize suda 5 dakika boyunca dilimleri (bir kez) yıkayın.
  18. Dilimleri bir damla (~ 40 μL) montaj ortamına bağlayın. Aşırı kabarcıkları önlemek için, bir 45 ° açı ile başlayarak, yavaşça slayt üzerinde montaj ortamı üzerine lamel magazini yerleştirin.
    1. Kalın bölümleri coverslip ile kırma önlemek için, bir spacer ile her dilim monte. Bir spacer doku bölümünün etrafında bir kare vakum gres bir jant yerleştirerek oluşturulabilir.
    2. Lamel magazini döşeme zaman, lamel magazini kenarları vakum gres ile mühürlenmiş olabilir. Parmağınızla lamel magazini kenarları üzerine sıkıca slayt üzerine yapışmak için basın. Alternatif olarak, şeffaf oje kullanarak lamel magazini mikroskop slayt üzerine mühürleyin.

7. görüntüleme vibratome bölümleri

  1. Görüntü lekelenme 5 gün içinde vitray slaytlar.
  2. Bir Konfokal mikroskop kullanarak lekeli vibratome dilimleri optik bölümler elde. Bir Konfokal mikroskop ile, tanımlı bir adım boyutunda bir z-yığını elde veya kullanıcının deneysel tasarımına bağlı olarak bireysel görüntüleri almak. Resimler, Konfokal koleksiyondan sonra herhangi bir bilgisayar ekranında incelenebilir.
    Not: vibratome dilimleri kalınlığı nedeniyle, bir Konfokal mikroskop veya z-yığını özelliği ile bir kapsam örnekleri içindeki ayrıntıları görselleştirmek için kullanılan önerilir. Bu yazıda kullanılan görüntüler için 63x yağ amacı kullanılmıştır; Ancak bu, bireysel kullanıcı ve kullanılan belirli kapsam tarafından uyarlanmış ve daha da değiştirilebilir. Her bir amaç ve zoom faktörü için önerilen piksel çözünürlüğü, 2,5 piksel X ve Y 'de en küçük optik olarak çözülebilir yapı için kullanılan Nyquist örneklemesi kullanılmıştır. Ancak, bazı yorumcular 2,3 piksel önerirken, diğerleri 2,8 piksel önerir. Bu hesaplamaların nasıl yapılacağı hakkında daha fazla bilgi için lütfen biyolojik Konfokal mikroskopinin el kitabı22 ' ye bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Primer 2-D kültürlerinde fetal sığır serumu (FBS) tamamlayıcı ortamlarda yetiştirilen, primer 3-D salisphere kültürü genellikle serum içermeyen koşullarda kültürlenmiştir10,11. Buna ek olarak, tükürük bezlerinden vibratom kültürlerini kullanan iki önceki çalışmalar% 0 veya% 10 FBS tamamlayıcı medyadaki bölümlerini kültürlü19,20. Fare submandibular dilimleri bir vibratome k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tükürük bezi araştırmaları, ölümsüzleşmiş 2-d kültürler, primer 2-d kültürler, 3-d salisphere kültürler ve embriyonik Method 3-b organ kültürlerini temel biyoloji ve Fizyoloji hakkında bazı soruları tespit etmek gibi birçok kültür modelini kullandı. Bu kültür modelleri araştırma soruları çeşitli bir dizi üzerinde anlayışlı bilgi vermiştir ve tükürük araştırma önemli araçlar olmaya devam edecektir. Bu kültür modellerinin sınırlamaları, ölümsüzleştirme sırasında p53 aktivitesinin modülasyonu, primer kültürlerin geçici canl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Arizona Üniversitesi araştırma ve keşif ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 DE023534) tarafından Kirsten Limesand için sağlanan pilot finansman tarafından kısmen destekleniyordu. Kanser biyoloji eğitim Grant, T32CA009213, Wen yu Wong için maaş desteği sağladı. Yazarlar değerli teknik katkısı için M. Rice teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Vibratom VT1000SLeica BiosystemsN/AKesit için Vibratom
Çift Kenarlı Paslanmaz Çelik Tıraş Bıçakları ElektronMikroskobu Bilimleri72000
AgarozFisher ScientificBP165-25Düşük eriyik
ParafilmSigma-AldrichP6543
Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin BLonza17-745HPSA
24 oyuklu plakalıCellTreat229124
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (DPBS)Gibco14190-144
Loctite UltraGel Control SuperglueLoctiteN/AHırdavatçıdan satın alındı
Doğal Kırmızı Samur Yuvarlak Boya FırçasıPrinceton Art & Fırça Co7400R-2
Gentamisin SülfatFisher ScientificICN1676045
TransferrinSigma-AldrichT-8158-100mg
L-glutatminGibco25030-081
EserElementler MP BiyomedikalICN1676549
İnsülinFisher Scientific12585014
Epidermal Büyüme FaktörüCorning354001
HidrokortizonSigma-AldrichH0888
Retinoik asitFisher ScientificR2625-50MG
Fetal Sığır SerumuGibcoA3160602
DMEM / F12 MedyaCorning150-90-CV
Milicell Hücre KültürüMilipore SigmaEklePICM0125012 mm, 24 oyuklu plaka için 0,4 um gözenek boyutu
%0,4 Tripan BlueSigma-AldrichT8154
CANLI/ÖLÜ Hücre Görüntüleme Kiti (488/570)Thermo-FisherR37601Yalnızca kullanılan CANLI boya bileşeni
Anti-Ki-67 AntikorHücre Sinyal Teknolojisi9129S
Anti-E-kaderin AntikorHücre Sinyalizasyon Teknolojisi3195S
Bölünme Önleyici Kaspaz-3 AntikorHücre Sinyalizasyon Teknolojisi9661L
Anti-SMA AntikoruSigma-AldrichC6198
Anti-amilaz AntikoruSigma-AldrichA8273
Anti-CD31 AntikoruAbcamab28364
Anti-TUBB3 AntikorHücre Sinyal Teknolojisi5568S
Alexa Fluor 594 Antikoru Etiketleme KitiThermo-FisherA20185
Alexa Fluor 594 PhalloidinThermo-FisherA12381
Sığır Serumu AlbüminFisher ScientificBP1600
Triton X-100Sigma-Aldrich21568-2500
Paraformaldehit PrillsFisher Scientific5027632
New England Nükleer Bloke Edici AjanPerkin Elmer2346249artık satılmamaktadır
DAPIHücre Sinyalizasyon Teknolojisi4083S
Prolong Gold Antifade Montaj OrtamıInvitrogenP36934
Leica SPSII Spektral KonfokalLeica BiosystemsN/AKonfokal görüntüleme için
Leica DMIL Ters Faz Kontrast MikroskobuLeica BiosystemsN/A
Kanada Ltd Kobalt-60 Teleterapi AletiAtom Enerjisi Theratron-80N / A
,Konteyner Deposunu Temizleyin60140Agaroz blok kalıbı
Amac Kutusu

Kaynaklar

  1. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  3. Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
  4. Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
  5. Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
  6. Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
  7. Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
  8. Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
  9. Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942(2018).
  10. Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170(2003).
  11. Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
  12. Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
  13. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  14. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
  17. Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
  18. Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
  19. Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
  20. Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
  21. Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932(2015).
  22. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
  23. Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
  24. Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417(2010).
  25. Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347(2018).
  26. Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
  27. Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
  28. Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
  29. Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
  30. Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
  31. Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
  32. Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Tükürük Bezi Organotipik KültürüEx Vivo Radyasyon TedavisiDoku Kesit AlmaVibratom Kesit Almaİmmünofloresan BoyamaKonfokal MikroskopiKi-67 İmmünoboyamaKlivajlı Kaspayz-3E-kaderin BoyamaAmilaz Tespiti
Submandibular ve parotis tükürük bezlerinden Organotipik kültürlerin radyasyon tedavisi anahtar In vivo özellikleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.