Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Otto Warburg kanser hücrelerinin glikoz kadar almak ve yeterli oksijen varlığında lakdamak üretmek için mayalanmaya alışılmadık yeteneği elde gözlenen-bir fenomen Warburg etkisi veya aerobik glikoliz olarak adlandırılan^1,2. Mitokondriyal solunum kusurları kanser hücrelerinde aerobik glikoliz için temel temel olarak spekülasyon³. Gerçekten de, Warburg etkisi fluorodeoxyglukoz (FDG)-pozitron emisyon tomografi (PET), klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan tümör görüntüleme temeli^4,5. Aerobik glikoliz yüksek bir oran kanserin önemli bir özelliği olarak kabul edilir ve son zamanlarda biri olarak kabul edilmiştir "kanser damgalar," D. Hanahan ve B. Weinberg⁶tarafından açıklandığı gibi. Onkogenler ve tümör bastırıcı genlerde somatik mutasyonlar — HRAS/KRAS/NRAS, EGFR, BRAF, MYC, TP53, isocitrate dehidrogenaz (idh) ve Fumarik hidataz (FH) gibi )-Warburg etkisi⁷bir sonucu olduğuna inanılan, kanser hücrelerinde belirli metabolik değişikliklere bağlı olmuştur.

Metabolomik analiz sadece kanser hücrelerinde metabolik düzenlemeyi anlamak için değil, aynı zamanda erken evre kanser biyomarkerleri ve kemoterapi tepkisi tahmini tanımlamak için umut verici bir yaklaşımdır. Antikanser bileşikleri ile hassas veya dayanıklı kanser hücrelerinin tedavisi takiben, metabolik tepkiler Takibi kanser hastalarında spesifik antikanser tedavisinin etkinliğini tahmin etmek için metabolik biyomarkerlerin tanımlanması kolaylaştırır^{8 ,9,10,11}. Bu yazıda, diamid ile tedavi edilen bir EGFR mutasyonu ile akciğer adenokarsinomdan elde edilen kanser hücresi hatları-metabolomik analiz için modeller olarak oksidatif strese neden oldu. Bu analitik yöntemin, kapiller Elektroforez-kütle spektrometresi (CE-MS) kullanarak avantajı, kütle aralığı m/z 50-1000^12,13ile şarj edilen metabolitlerin kapsamlı ölçüsüdür. Bu makalenin amacı, özellikle CE-MS tarafından kültürlü kanser hücreleri ve sonraki metabolomik analiz, sulu metabolitlerin hazırlanması için acemiler ayrıntılı bir step görsel protokol sağlamaktır.

1. gün hücre kültürü 1

Not: metabolit ekstraksiyon için her örnek, orta ama tam olarak (yaklaşık 2 – 5 milyon hücre içeren) tek bir 100 mm doku kültürü çanak hazırlanmalıdır. Tahlil için gerekli yemek sayısını hesaplayın ve buna göre hazırlayın.

1. Kültür HCC827 ve PC-9 hücreleri 5% CO₂ at 37 ° c rpmi-1640 orta% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile tamamlayıcı.
2. 100 mm Kültür yemeklerinden hücre kültürü medyasını aspirate.
3. Kalsiyum ve magnezyum olmadan 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi kullanarak her bir çanak üzerinde yıkayın hücreleri. PBS çözeltisi tamamen çanak yüzeyini kapsar, böylece yavaşça her çanak kaya.
4. Kültür yemeklerinden yıkama tamponunu aspirate.
5. Sıcak 0,25% Trypsin-EDTA çözeltisi 37 °C ' ye ve 5 mL serolojik pipet ile 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Yavaşça her yemek böylece tripsin tamamen çanak yüzeyini kapsar kaya.
6. 37 °C ' de kültür yemeklerine yaklaşık 5 dakika boyunca inküye yapın.
7. Yemek başına ön ısıtılmış tam büyüme orta 4 mL ekleyin. Birkaç kez hafifçe pipetleme tarafından orta hücreler resuspend.
8. Her bir hücre süspansiyonunu ayrı bir 15 mL Konik Tüpe aktarın ve 800 × g 'de Santrifüjlü 5 dk.
9. 2 ml önceden ısıtılmış komple büyüme orta her hücre Pelet resuspend.
10. Otomatik hücre sayacı ve 0,4% tripan mavi çözüm kullanarak hücrelerin toplam sayısını ve yüzde canlılığı belirleyin.
    1. 10 μL hücreli süspansiyon ve 10 μL 0,4% tripan mavi çözeltisi karıştırın.
    2. 10 μL örnekteki hücre sayma bölmesi kaydırağı içinde kapiller eylem yükleyin.
    3. Oda slaytı otomatik hücre sayacına yerleştirin. İletilen ışık otomatik olarak aydınlatır ve cihaz otomatik olarak hücreye odaklanır.
    4. Görüntüyü yakalamak ve sonuçları görüntülemek için Capture düğmesine basın.
    5. Gerekirse, istenilen hücre konsantrasyonunu elde etmek için daha fazla büyüme ortamı ekleyin.
11. 100 mm hücreli kültür çanak başına yaklaşık 1 – 2.5 milyon hücre tohum.
    Not: CE-MS analizine göre belirlenen metabolit konsantrasyonları, uygun hücrelerin sayısına göre normalleştirilir. Hücre sayımı amacıyla, her grup için en az bir ekstra seribaşı kültür çanak hazırlamak gerekir.
12. 37 °C ' de 18 saat için% 5 CO₂ ' de kültür yemeklerini kulbe etmek.

2. Reaktiflerin hazırlanması

1. L-metionine sülfona karaciğerde dönüştürülür ve d-Camphor-10-sülfonik asit 1000-Ultra Apure su dahil olmak üzere ticari bir iç standart çözüm seyreltilen.
   Not: 80 ' den az numune için, sadece 50 μL iç standart çözüm 1 ve 45 ml Ultra saf su için bir 50 ml hacimsel Flask, sonra çözüm kadar 50 ml Ultra saf su ile getirmek.
2. 0,05 g/ml mannitol çözeltisi yıkama tamponu olarak ultra saf suda hazırlayın.
   Not: 30 ' dan az numune için 500 ml 'lik Ultra Saf suyla 25 gr mannitol çözülür. 100 mm Kültür çanak başına yaklaşık 15 mL yıkama tamponu gereklidir, bu nedenle numune sayısına göre yeterli miktarda yıkama tamponu hazırlayın.

3. santrifüj filtre üniteleri ön yıkama

1. Pipet 250 her santrifüj filtre ünitesinin filtre bardağı içine ultra saf su μL ( malzeme tablosunabakın).
   Not: örnek başına Iki filtre birimi gereklidir.
2. Filtre birimlerini sıkıca kapa ve 9.100 × g 'de 4 °c ' de 5 dakika santrifüjün.
3. Her süzgecin hacmini kontrol edin — ilk kısa Spin sırasında önemli filtrat birikirse, filtre ünitesi arızalı olabilir. Bu durumda, filtre birimini atın ve bunun yerine yeni bir filtre ünitesi kullanın.
4. Filtre ünitelerinin kapakları sıkıca kapatın ve 9.100 × g 'de 30 dakika boyunca 4 °c ' de tekrar santrifüjün.
5. Filtre bardakları herhangi bir ultra saf su kalır emin olun; Her bir toplama tüpünde süzülmüş ultra saf suyu bir pipet ile çıkarın ve atın.
   Not: filtreye zarar verebilmek için bir filtre bardağın içinde kalan suyu pipet ile kaldırmaya çalışmayın.
6. Filtre bardakları toplama tüplerine değiştirin.
   Not: santrifüj filtre ünitelerini bir saat içinde kullanın, çünkü filtreler kurutulduktan sonra hasar görebilir.

4. gün hücre kültürü 2

1. 100 mm Kültür yemeklerini kuluçlatıcından çıkarın.
   Not: önerilen hücre kültürü süresi 18 h 'dir.
2. Her 100 mm Kültür çanak hücre kültürü orta aspirate.
3. Hücre katmanını rahatsız değil bakım alarak, her çanak için bileşiklerin veya ilaçların uygun konsantrasyonları içeren hücre kültürü orta 10 mL ekleyin.
   Not: Gösterim amacıyla, bu deneyde PBS 'de (250 μM son konsantrasyon) çözülmüş 10 μL 250 mM diamid ekledik.
4. 37 ° c 'de kültür yemeklerini diamid veya PBS 'de kontrol olarak 30 dakika süreyle kulyın.
5. Her 100 mm Kültür çanak hücre kültürü orta aspirate.
6. Her bir yemeğin kenarına hafifçe 2 mL% 5 mannitol çözeltisi ekleyerek hücreleri yıkayın, hücre tabakasını rahatsız etmek için değil, daha sonra biraz çanak eğim özen.
   Not: PBS veya tuz çözeltisi CE-MS tabanlı metabolomik analizlerle müdahale eder ve ölçüm sonuçlarını olumsuz yönde etkiler ve böylece yıkama tamponu olarak kullanılmamalıdır.
7. Her kültür çanak yıkama tamponu aspirate, sonra hafifçe çanak başına yıkama tampon 10 mL ekleyerek ve biraz çanak eğerek hücreleri tekrar yıkayın.
8. Tamamen her kültür çanak kenarından yıkama tampon Aspire.
   Not: hücreleri Aspire değil dikkat ederken, mümkün olduğunca çok yıkama tampon Aspire. Kalan mannitol CE-MS analizine engel olabilir; hücrelerin aspirasyonu hücre sayısını azaltır ve böylece veri normalleştirme bir hata kaynağı haline gelir.

5. kültürlü hücrelerden metabolitlerin çıkarılması

1. Kültür çanak başına 99,7% metanol 800 μL ekleyin. Yavaşça tüm yüzeyi kapsayacak şekilde ileri geri her kültür çanak kaya. Yemekleri oda sıcaklığında 30 s için bırakın.
2. Pipetin ucunu metanol içine daldırarak ve birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme yaparak, tabak başına seyreltilmiş iç standart çözeltinin 550 μL değerini yavaşça ekleyin.
3. Yavaşça tüm yüzeyi kapsayacak şekilde ileri geri her kültür çanak kaya.
4. Yemekleri oda sıcaklığında 30 s için bırakın.

6. hücre ekstraktlarının ultrafiltrasyonu

1. Her kültür yemeğinden çıkarılan solüsyonu ayrı bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
2. 5 dk için 4 °C ' de 2.300 × g 'de tüpleri santrifüjün.
3. Her bir süpernatant 350 μL 'yi örnek başına iki santrifüj filtre birimine aktarın.
   Not: her kültür çanak, toplam 700 μL ayıklanan çözüm iki filtre tüpleri (350 μL/tüp) aktarılır.
4. Filtre tüplerini yaklaşık 2 saat için 9.100 × g olarak 4 °c ' de Santrifüjden ayırana kadar hiçbir sıvı süzgeç bardakları içinde kalmaz.
5. Filtre bardakları çıkarın ve sıkıca toplama tüpleri kapakları kapatın.

7. örnek buharlaşma

1. Bir santrifüj Buharlaştırıcı hazırlayın-genellikle, bu bir evaporatör oluşur, bir soğuk tuzak, ve bir vakum pompası.
2. Toplama tüplerini santrifüj evaporatörün içine yerleştirin.
   Not: tüplerin kapaklarının açık olmasını bırakın.
3. Ayıklanan numune solüsyonları, vakum koşullarında oda sıcaklığında Buharlık yapın.
   Not: rotasyonlar ve basınç sayısı için tipik konfigürasyonlar 1.500 rpm ve 1.000 PA, sırasıyla, ve genellikle yaklaşık alır 3 tamamen örnekleri Buharlık saat.
4. Hiçbir sıvı toplama tüpleri içinde kalır ve sıkıca tüpler kapakları kapatın onaylayın.
5. Toplama tüplerini Ultra düşük sıcaklıkta (− 80 °c) derin dondurucu ile metabolomik analizine kadar saklayın.

8. CE-MS tarafından metabolomic Analizi

1. CE-MS analizinden hemen önce 50 μL ultra saf su içinde filtrat yeniden resuspend.
2. Daha önce^12,13 kapiller elektroforez sistemi ve izokrat pompa, CE-MS adaptörü ve CE-ESI-MS püskürtücü ile donatılmış uçuş zaman kitle Spektrometre sistemi kullanılarak açıklanan yöntemlerle CE-MS analizi gerçekleştirin.
   Not: her iki sistemde de sistem satıcılarının yazılımı tarafından kontrol edilebilir ve erimiş silika kapiller (50 μm iç çapı × 80 cm toplam uzunluğu) ile bağlanır.
   1. Enstrümanlar ve numune şişeleri ayarlayın, kapiller bir kapiller kaseti ile hazırlamak, kılıf sıvıları ve uygun Elektroforez tamponları anyon veya kstasyon analiz moduna bağlı olarak doldurmak ve sonra gerilimler uygulanır.
      Not: enstrümantasyon ve analitik koşullar,^12,13başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
   2. Yazılımı açın ve veri alma yöntemleri ve örnek bilgileri içeren bir çalışma listesi hazırlayın.
   3. Bir test çalışması başlatın ve sinyal yoğunluğu ve iç standartların tepe şekli ve diğer standart bileşiklerin tepe çözünürlüğü gibi verileri kontrol edin.
   4. Gerekirse analitik koşulların ince ayarını yapın.
   5. Örnek çözümleri 3 s için 50 mbar 'a ve 30 kV 'lik bir gerilime enjekte edilir.
      Not: CE-MS ya pozitif ya da negatif iyon modunda yürütülmüştür. M/z 50 – 1000 kitle aralığını taramak için Spektrometre ayarlayın. Kapiller voltajı 4 kV olarak ayarlandı; Azot Gazı debisi (ısıtıcı sıcaklığı 300 °C). Pozitif mod için, fragmentor, Skimmer ve OCT RFV voltaj sırasıyla 75, 50 ve 125 V olarak ayarlandı. Negatif iyon modu için fragmentor, Skimmer ve OCT RFV gerilimi sırasıyla 100, 50 ve 200 V olarak ayarlandı.
3. Spektrum verilerini analiz edin.
   1. M/z, tepe alanı ve göç SÜRESI (MT) dahil olmak üzere en yüksek bilgileri elde etmek için otomatik entegrasyon yazılımını kullanarak kitle spektrum verilerinden zirveleri ayıklayın.
      Not: Yöntem, başka bir yerde¹⁴ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
   2. İzotopomerler, yaklaştırmak iyonlarına karşılık gelen sinyal zirveleri ve bilinen metabolitlerin diğer ürün iyonlarının dışlama.
   3. M/z değerlerine ve MTS 'ye göre hmt metaboliti veritabanından gelen bilgilerle kalan zirveler ek açıklama ekleyin.
   4. Açıklama eklenmiş zirvelerin alanlarını iç standart düzeylere ve örnek başına hücre sayılarının normalleştirin.
   5. Her metabolit için hazırlanan standart eğrileri kullanarak kültürlü hücrelerde (pmol/10⁶ hücreli) her metabolitin konsantrasyonunu değerlendir.
   6. Sonraki istatistiksel analizler ve biyolojik Yorumlar için nicelik metabolitin konsantrasyonlarını kullanın¹⁴.

Kanser hücrelerinde metabolit konsantrasyonları (pmol/106 hücreler) uygun hücrelerin sayısına normalleştirilmiş olduğundan, koşullar arasında geçerli hücrelerin sayısında varyasyonu en aza indirmek için deneysel koşullar bakım ile ayarlanması gerekir. Örneğin, diamid tedavisi nispeten yüksek bir konsantrasyonda (250 μm) ama kısa bir süre için tüm hücrelerin mümkün olduğunca eşit büyüymesine izin vermek, böylece analiz uygulanabilir hücrelerin sayısını eşitleme oldu. Bu deneysel koşullarda, HCC827 ve PC-9 hücreleri eşit olarak büyüdü 3 h (Şekil 1). Diamide işlenmiş hücrelerin CE-MS analizi ile karşılaştırıldığında PBS-tedavi (kontrol) hücreleri ortaya 175 ve 150 diferansiyel metabolitleri HCC827 ve PC-9 hücrelerinde, sırasıyla. Bunlar arasında, pentoz fosfat yolu (PPP) ve üst glikoliz içinde birkaç ara iki hücre hatlarında diamid tedavi koşullarda önemli ölçüde daha yüksek, birkaç tricarboksilik asit (TCA) döngüsü ara tedavi daha düşük iken (Şekil 2 ve Şekil 3).

PPP, redoks homeostazı bakım ve yağlı asit biyosentezi15için kullanılan azaltılmış nikotinamide adenin dinükleotid fosfat (NADPH) şeklinde azalan eşdeğerleri üretir. Diamid tedavi takipte, Glukonik asit düzeyi-oksitlenmiş glikoz-12 kat HCC827 hücre ve PC-9 hücrelerde 10 kat arttı; benzer şekilde, diamid tedavisini takiben, glikoz 6-fosfat (G6P)-fosforile glikoz ve ilk hexokinase-katalizlenmiş glikoliz ürünü-Ayrıca 6,3-ve 3,5-fold HCC827 ve PC-9 hücrelerinde, sırasıyla (Şekil 4) artmıştır. Buna ek olarak, diamid tedavisinden sonra, 6-fosfoglukonat (6PG)-PPP 'de ilk ara seviyeleri-HCC827 hücrelerinde 89-Fold ve PBS kontrollerinde görülen seviyelere kıyasla PC-9 hücrelerinde 231-kat artar (Şekil 4). Bunun aksine, fruktoz 6-fosfat (F6P) ve fruktoz 1, 6-bisfosfat (F1, 6p) gibi diğer glikolitik ara maddelerin seviyeleri diamid deneysel durumda değişmez (Şekil 4). Toplam nikotinamide adenin dinükleotid fosfat (NADP+) seviyeleri diamid tedavi ve PBS kontrol koşulları arasında neredeyse eşdeğerdir (Şekil 4), GLIKOZ esas olarak PPP üzerinden katabolize olduğunu düşündürmektedir.

Şekil 1. Diamid tedavi üzerine değişmeden hücre numaraları. 250 μm diamid hücre büyüme tepkiler tripan mavi boyama kullanılarak ölçülmüştür. 1 veya 3 saat için PBS (mavi) veya diamid (kırmızı; 250 μm) Ile tedavi edilen (A) HCC827 ve (B) PC-9 hücrelerinin hücre numaraları gösterilir. Veriler ortalama ± SD (n = 6) olarak gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2. Metabolitlerin temsilcisi MS doruklarına. (A) Glukonik asit, (B) glikoz 6-fosfat (G6P), (C) 6-phosphogluconate (6PG) ve (D) CE-MS analizi ile elde edilen nikoinamid ADENIN dinükleotid fosfat (NADP+) olarak açıklamalı elektrophergramlar. Her satır, kullanılan hücre çizgisini (katı, HCC827; noktalı, PC-9) ve tedavi (mavi, PBS; kırmızı, diamide) gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3. Hücre içi metabolitlerin metabolome profilleri. (A) HCC827 ve (B) diamid ile tedavi edilen PC-9 hücrelerinde metabolitlerin kat değişiklikleri günlük2(diamıde/PBS) olarak gösterilir. Toplam olarak, 175 ve 150 metabolitleri sırasıyla HCC827 ve PC-9 hücrelerinde açıklamalı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4. Diamit tedavisi üzerine PPP 'nin yukarı düzenlenmesi. Diamid ile tedavi edildikten sonra glikoliz ve pentoz fosfat yolu (PPP) dahil anahtar metabolitlerin hücre içi konsantrasyonları (pmol/106 hücreler) gösterilir. Metabolitler HCC827 ve PC-9 hücrelerinde PBS (mavi) veya diamid (kırmızı, 250 μm) ile tedavi edilen Glukonik asit, glukoz 6-fosfat (G6P), fruktoz 6-fosfat (F6P), 6 gibi 30 dk. temsili metabolitleri elde edildi -fosfoglukonat (6Pg) ve nikotinamide adenin dinükleotid fosfat (NADP+) gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.