Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilen nöral hücrelerin terapötik transplantasyonu ile fare beyin yaralanması kontrollü Kortiik darbe modeli

10.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59561

⸱

10 Temmuz 2019

 ,  , 
1Center for Neuroscience and Regenerative Medicine, Uniformed Services University, 2Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, 3Graduate Program in Neuroscience, Uniformed Services University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Açık kafatası travmatik beyin hasarı ve kültür insan kaynaklı pluripotent kök hücre türeyen hücrelerin transplantasyonu için bir fare modeli için metodolojileri yaralanma sitesine gösterir. Bu prosedürlerden gelen sonuçların davranışsal ve histolojik testleri de kısaca açıklanmıştır.

Özet

Travmatik beyin hasarı (TBı) dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir. TBı 'dan kaynaklanan hastalık patolojileri, birincil mekanik hakaret ile apoptozis ve inflamasyon da dahil olmak üzere ikincil yaralanma süreçlerine ilerler. Hayvan modelleme yaralanma mekanizmaları çözmek ve potansiyel nörokoruyucu tedaviler değerlendirmek için arama değerli olmuştur. Bu protokol, odak, açık kafa TBı kontrollü kortikal etkisi (CCı) modeli açıklanmaktadır. Özellikle, hafif tek taraflı kortikal yaralanma üreten parametreler açıklanmıştır. CCı 'nın davranışsal sonuçları, bilateral sensorimotor entegrasyonunun yapışkan bant kaldırma testi kullanılarak analiz edilir. TBı patolojisinde deneysel tedavi ile ilgili olarak bu protokol aynı zamanda kültürlü hücrelerin beyne nakli için bir süreç göstermektedir. İnsan İndüksiyonlu pluripotent kök hücrelerinden (hiPSCs) elde edilen nöral hücre kültürlerinin insan TBı hastalarında üstün fonksiyonel restorasyon gösterilmesi potansiyeli seçilmiştir. Ev sahibi fare beyin dokusunda Hiponinin kronik hayatta kalması, değiştirilmiş DAB immünhistokimyasal süreç kullanılarak algılanır.

Giriş

Travmatik beyin hasarı (TBı) ya dolaylı mekanik kuvvetler (rotasyonel hızlanma/yavaşlama veya Contra-darbe) kafasına darbeler veya nesnelerin veya patlama dalgaları doğrudan hasar nedeniyle beyin elde edilen yaralanma için genel bir terimdir. TBI 'ın dünya çapında ölümlerin yaklaşık% 9 ' unda olduğu tahmin edilmiştir ve yılda1,2' de tahmini 50.000.000 olguda görülür. Hastalık kontrol ve önleme merkezlerinden bir 2017 Raporu 2013 yılında, ABD3yılında tbı nedeniyle 2.800.000 hastane ziyaretleri ve ölümlerin toplam olduğunu tahmin etti. Pek çok hafif TBIs her yıl bildirilmemiş olarak gider. Ciddi TBı, yaşam boyu biliş bozukluğu, motor fonksiyonu ve genel hayat kalitesine yol açabilir. Hafif TBI sonuçları, özellikle tekrarlanan spor ile ilgili tbi, sadece son zamanlarda onların sinsi sağlık etkileri için takdir edilmiştir4,5.

Preklinik modelleme, TBı için yeni mekanik Öngörüler ve potansiyel restoratif terapi geliştirmenin hayati bir bileşenidir. TBı kontrollü kortikal etkisi (CCı) modeli korteks mekanik çürüme yaralanması açık kafalı bir modeldir. Darbe parametreleri, hafif ve şiddetli6arasında bulunan CCI yaralanmaları üretmek için değiştirilebilir. CCı yaralanmaları, TBı 'ın diğer kapalı baş modelleri ile görüldüğü gibi, diffün yerine odak noktasıdır. CCI tek taraflı yaralanmaya neden olabilir, böyle kontralateral korteks bir iç karşılaştırıcı olarak hizmet verebilir. Bu protokol, primer somatoduyusal ve motor bölgelerini kapsayan korteks bir kısmına hafif bir CCı 'nın özelliklerini gösterir. Bu kortikal alan, çeşitli davranış testlerinin yaralanma kaynaklı açıkları7' sini algılayabilen sensorimotor davranışlarına katılımı için seçilmiştir. TBı için terapötik girişimler nedeniyle davranışsal iyileştirmeler de tespit edilebilir.

TBı bir damgasını yaralı bölgede yaygın nöral disfonksiyon olduğunu. Yaralı nöronlar hücre ölümü geçmesi ve nöronal ağ bağlantısı8,9kesintiye uğratıldı. TBı endojen kök hücrelerinin alımı bozar, bu da daha fazla aşağı davranış açıkları10,11yol açar.  Sinir kök hücrelerinin transplantasyonu ve kök hücre türevi hücreler, yaralı beynin fonksiyonunu geri almak için bir olasılık olarak incelenmiştir. Hasarlı nöral devrelerin geri yüklenmesi potansiyeline ek olarak, nakledilen hücreler TBı12' den nöronal hayatta kalma ve fonksiyonel iyileşmeyi teşvik eden paracrin efektlerini ekirler. Nöroloji bozuklukları modellerinde restoratif potansiyelini değerlendirmek için klinik olarak çeşitli hücre çeşitleri13,14,15. İndüklenen pluripotent kök hücre teknolojisinin son popülarizasyonu16 deneysel kullanım için çok sayıda insan kök hücresi hatları gelişimini kolaylaştırdı. HiPSC türevi hücrelerle preklinik testler, belirli bir hücre hattının insan hastalıklarına karşı potansiyel terapötik etkinliğini karakterize etmek için önemli bir ilk adımdır. Bu laboratuar, travmatik beyin yaralanmalarından kurtarmaya yardımcı olmak için nakledilen hücrelerin peşinde17 ' lik nöro fenotipleri için hippleleri ayırt etmek için protokoller geliştirmiştir.

Bu protokoldeki deneyler, TBı 'yi yetişkin farelerin sol somatoduyusal ve motor kortörüne teşvik etmek için tek taraflı bir CCı kullanır. Hafif bir CCı hasarı, hiPSC türevi nöral hücre engraftinin fonksiyonel iyileşme üzerindeki etkilerini izlemek için kullanılan sağ forepaw 'da sürekli işlevsel bir açığın sonucu olarak görülmektedir. Bu protokolde forepaw sensorimotor testi Bouet ve meslektaşları18 tarafından kurulan metodolojisi uyarlanmıştır ve Fleming ve meslektaşları tarafından daha önce göstermiştir19.  Bu protokol deneysel beyin yaralanması, kalça hücrelerinin terapötik nakli ve deneysel sonuç önlemlerinin davranış ve histolojik analizini gerçekleştirmek için tam bir iş akışını özetliyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm deneyler Uniformed Services Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından incelendi ve onaylanmıştır.

1. Kraniyektomi ve kontrollü kortikal etki

  1. Kontrollü kortikal darbe cihazının ve cerrahi malzemelerin hazırlanması.
    1. Yara sulama için 0,5 mL steril tuz ile 1 mL kayma ucu şırınga yükleyin. Sulama kontrol etmek için şırıngaya 25 G iğne takın.
    2. DMSO 'da 1 mg/mL son konsantrasyonuna kadar bir CsA seyreltmeli çözüm hazırlayın. Bağışıklık baskısı için 0,5 ml 'lik siklosporin a (CSA) çözeltisi ile ikinci 1 ml kayma uçlu şırınga yükleyin. CsA şırınga için 25 G iğne veya daha büyük takın.
    3. Kontrollü kortikal darbe pistonu, stereotaktik çerçevedeki bir koluna takın ve 15 ° açı olarak ayarlayın. Pistona 3 mm 'lik bir sondaj sondası takın.
    4. 1,5 m/s darbe hızını ve hafif bir kortikal yaralanma üretmek için 0,1 s darbe bekleme süresi ayarlayın.
  2. Tek taraflı Kraniyektomi gerçekleştirin
    1. Fareyi, sıkıştırılmış oksijen kaynağı olan bir Isoflurane Buharlaştırıcı 'e bağlı bir anestezi indüksiyon odasına yerleştirin. ~ 0,7 L/min oksijeni ~% 3 Isoflurane ile anesteziye neden olur. Ayak-tutam yanıt eksikliği ile anestezi derinliği kontrol edin.
    2. Elektrikli kırpıcılar kullanarak kafa derisi tıraş ve herhangi bir gevşek kürk silin.
    3. Fareyi ekli anestezik teslimat burun koni ile bir stereotaktik çerçevede yerleştirin.
      1. Anestezi altında vücut sıcaklığını korumak için Mouse altında stereotaktik çerçevede 37 °C ' ye ayarlanmış bir ısınma yastığı yerleştirin. Kulak çubukları ve bir ısırık çubuğu ile yerinde kafa düzeltmek ve kafatası ön kemik yatay olduğu gibi kafa yönlendirmek. Cerrahi süresi boyunca% 1.5-2% Isoflurane anestezi koruyun.
    4. Preoperatif bakım ve aseptik cerrahi hazırlık gerçekleştirmek için, steril bir pamuklu çubuk kullanarak gözlere antibiyotik oftalmik merhem uygulayın. Traş kafa derisi alanına iyot bazlı bir çözüm uygulayın. 70% etanol ile bu çıkarın. Kafa üst görünür ama gözleri kaplıdır böylece bir Fenestre cerrahi asmak ile hayvan kapak.
    5. Bir neşter veya makas kullanarak kafa derisi üzerinde bir orta çizgi kesi (1,5-2 cm) olun.  Yara temizlemek ve bregma orta çizgi sol fasya temizlemek için steril pamuk bezlerden kullanın.
    6. Kraniyektomi sitesini tanımlamak için etkili prob kullanın.
      1. Stereotaktik referans noktasını (X = 0, Y = 0) bregma olarak ayarlayın.  Prob, orta hat 2 mm sol yanal ayarlayın. İnce uç cerrahi olarak güvenli bir marker kullanarak prob etrafında 5 mm çapında bir daire anahattı. Arttırın ve alan dışına döndürün.
    7. Yaklaşık% 70-80% maksimum hızda yuvarlak uçlu 0,6 mm veya 0,8 mm Burr matkap biti kullanarak kafatasında açık bir delik açmak için yüksek hızlı döner Mikromotor kiti El aracını kullanın. Bu kenarlık ince 5 mm çevresel anahat boyunca sondaj sırasında kafatası ışık basıncı uygulayın.
      1. Sondaj sırasında aşırı basınç uygulanmaz. Bu, titreşim, sıkıştırma veya kazara penetrasyon nedeniyle kortikal yaralanmalara neden olabilir. Matkap biti hızını iş yapmak için izin verin.
      2. Kafatasının aşırı sürtünme ısıtılması önlemek için çok uzun süre herhangi bir noktada matkap yapmayın. Kraniyektomi zaman zaman steril tuz ile enkaz kaldırmak ve döner aletten Isıtma azaltmak için irrigate.
      3. Bu noktalar hemoraja karşı savunmasız olduğu için koronal dikiş hattı üzerinde Sondaj yaparken yakından dikkat edin.
    8. Kraniyektomi anahat yeterince inceltmiştir kafatası flep kaldırmak için ince cımbız bir çift kullanın. Flep medially tutun ve yavaşça kaldırın ve radyal hareket ile yanal çekin.
      1. Flep kaldırırken Dura mater zarar vermez; Bu ciddi yaralanma ve kanama neden olabilir.
  3. Hafif kontrollü kortikal darbe hasarı gerçekleştirin
    1. Dezenfe sondasını steril bir alkol hazırlama yastığı ile temizleyin. Daralan sondasını, maruz kalan korteks üzerinde yere geri taşıyın. Dura mater yüzeyine dokunana kadar sondayı indirin. Bu konumu Z = 0 olarak işaretleyin.
    2. Pistonu çekin ve Z =-1,0 mm 'ye gidin. korteks etkisi için piston deşarj.
    3. Pistonu hızlıca kaldırın ve kolunu pozisyondan çıkarın. Yaralanmadan sonra korteks sulamak için tuzlu bol miktarda uygulayın. Cerrahi Site gerektiğinde tuz ile durulayın ve 5,0 ipek sütür ile basit kesilmiş dikiş kullanarak kafa derisi kesi sütür.
  4. Fare üzerinde postoperatif bakım gerçekleştirin
    1. Anestezi durdurma. 10 mg/kg dozda skruff içine Subkutan Enjeksiyon ile CsA sunun. Fareyi temiz ve önceden ısıtılmış postoperatif kafeye yerleştirin.
    2. 1,0 mg/ml 'de içme suyunda asetaminofen analjezik sağlayın.
      Not: uygun ıASUC standart çalışma prosedürü ve deneysel sonuç değişkenleri (örneğin, sedasyon, nöroinflamasyon) dikkate alınarak analjezi sağlayın.
    3. Rehidrasyon ve iyileşmeye yardımcı olmak için ısıtılmış bir kurtarma kafesi içinde nemlendirilmiş yemek gıdaları sağlayın.
  5. Yalnızca Kraniyektomi (Sham) kontrolleri yapılırken Bölüm 2 ' den Bölüm 4 ' e geçin.

2. hücre süspansiyonunun stereotaktik nakli

  1. Kraniyektomi sonrası yaklaşık 24 saat hücre transplantasyon prosedürü başlar.
  2. Hücre transplantasyonu ekipmanlarını ve cerrahi malzemeleri hazırlayın
    1. 1 mL kayma ucu şırıngayı yara sulama için steril tuz ile doldurun. Sulama kontrol etmek için şırıngaya 25 G iğne takın.
    2. 1 mL 'Lik slip-ucu şırıngayı, bağışıklık baskısı için CsA çözümüyle doldurun. CsA şırınga için 25 G iğne veya daha büyük takın. Ameliyat arasında gerektiğinde CsA şırıngasını doldurun.
    3. 1,0 mm OD borosilikat cam kapiller pipetlerinden standart yöntemler kullanılarak cam iğneler hazırlayın.
    4. Yaklaşık bir 200 μm çapına iğne uçları kırmak için ince cımbız kullanın. İğnenin silindirik şaftının 2,5 cm 'den uzun olmadığından emin olun.
  3. Şırınga pompasının 10 μL şırınga ile kullanılması için kalibre edin.  2,0 μL toplam hacmi sağlamak için 0,2 μL/dak debisi girin.
  4. Hazırlamak insan indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) süspansiyon.
    1. Standart steril işleme teknikleri kullanarak bir hücre kültürü BSL-2 kaput tüm hücre işleme gerçekleştirin.
    2. Hücre kültürlerini hücre türü için tanımlanan standart koşullara göre önceden hazırlayın. Örnek olarak Lischka ve ark.17 ' ye bakın.
      Not: Bu gösteride gösterilen denemeler, hiPSCs 'den elde edilen çeşitli nöral fenotip hücrelerini kullandı.
    3. Hücreleri, hücre dekolmanı çözeltisi veya diğer tercih edilen enzimatik veya kimyasal araçlar kullanılarak tek hücreli bir süspansiyona hafifçe ayırmak.
    4. Süspansiyon hücreleri sayma, daha sonra 5 x 104 hücreler/μL asgari hücre kültürü ortamında (örn., dmem) bir 1,7 ml Flip üst test tüpünde süspansiyon seyreltmeli.
    5. Transplantasyon için aşağıdaki notları inceleyin:
      1. İşlemler süresince 37 °C ' de süspansiyonlu hücreleri koruyun.
      2. Şırıngayı sadece intraparankimal enjeksiyon yapmadan hemen önce yükleyin (aşağıda adım 4,5).
        Not: yerçekimi, hücre süspansiyonunun yerleşmesine veya yan tarafına koyulması durumunda şırıngaya yapışmasına neden olabilir. Bu, enjekte edilen hücrelerin sayısında düzensizliklere yol açar.
      3. Allot ~ 5 x 105 hücreler (10 μL süspansiyon) her fare bir günde birden fazla hücre transplantasyon prosedürleri gerçekleştirirken.
  5. Stereotaktik transplantasyon cerrahisi gerçekleştirin
    1. Fareyi, sıkıştırılmış oksijen kaynağı olan bir Isoflurane Buharlaştırıcı 'e bağlı bir anestezi indüksiyon odasına yerleştirin. ~ 0,7 L/min oksijeni ~% 3 Isoflurane ile anesteziye neden olur.
    2. Fareyi, ekli anestezik burun koni ile stereotaktik bir çerçevede yerleştirin.
      1. Kulak çubukları ve bir ısırık çubuğu ile yerinde kafa düzeltmek ve kafatası ön kemik yatay olduğu gibi kafa yönlendirmek. Cerrahi süresi boyunca% 1.5-2% Isoflurane anestezi koruyun.
    3. Preoperatif bakım ve aseptik hazırlama gerçekleştirin
      1. Bir pamuk Swab kullanarak gözleri antibiyotik içeren nemlendirici oftalmik merhem uygulayın.
      2. Site temizlemek ve sütürler gevşetmek için steril tuz ile kesi site lavage. Kesi yerlerini sterilize etmek için% 70 etanol ile pamuk çubukla hafifçe uygulayın.
    4. İnce cımbız ve oftalmik makas kullanarak sütürler çıkarın. İrrigate cerrahi site ve bol steril tuz ile Kraniyektomi.
      1. Eğer korteks aşırı fıtık, renk kesintisi, bozmuş vaskülarizasyon veya kanama dahil olmak üzere kesilme özellikleri görüntüler Eğer dışlama için hayvan düşünün.
    5. Yük hücre nakli şırınga
      1. 37 °c ' den gelen hücre süspansiyonunu bir hücre kültürü Biyogüvenlik Hood 'a taşıyın. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için yavaşça girdap veya tüp dokunun.
      2. Bir mikro pipetör kullanın ~ 7,5 μL hücre süspansiyonu ile Hamilton şırıngaya pistonlu uç üzerinden yükleyin.
        1. Şırıngayı, piston ucunu aşağı bakacak şekilde ~ 120 ° açıyla tutun. Süspansiyon ve piston ucu arasında bir hava kabarcığı tanıtmak için dikkat çekmek, piston takın.
      3. Conta aksamını pipet iğnesine takın, sonra iğneyi şırıngaya takın.
      4. Hücre süspansiyonunu pipet iğnesine taşımak için pistonu itin.  Süspansiyon çıkışı karşı direnç varsa, çapı büyütmek için iğne ucunu kırmak için ince cımbız kullanın.
    6. Şırıngayı stereotaktik şırınga pompasına takın.  Şırınga pompa montajı düzgün çalıştığından emin olmak için piston ilerlemek.
    7. İğne, enjeksiyon için koordinatlara taşıyın.
      1. İğne ucunu bregma 'ya hizalayın. X ve Y koordinatlarını 0 olarak ayarlayın. Sonra iğne ucunu kraniektomi üzerinden 2,0 mm lateral ve-1,0 mm posterior bregma 'a taşıyın.  Dura mater yüzeyi için iğne ucunu dokunun ve Z = 0 stereotaktik koordinatı ayarlayın.
      2. Hücre süspansiyon beyin içine iğne tanıtmadan önce yeterli akan sağlamak için piston itin.
      3. İğneyi beyin içine Z =-1,4 mm derinliğine kadar tanıtın. Bu stereotaktik Koordinatlar, grefti derin korteks20' nin gri madde-beyaz madde sınırında yer.
    8. Hücre süspansiyon infkullanım için şırınga pompası başlatın. Laboratuar tezgah zamanlayıcısını 15 dakikaya ayarlayın ve Zamanlayıcıyı başlatın. Hücre süspansiyon akışını izlemek için uzun çalışma mesafesi mikroskobu kullanın.
      1. Doku hidrasyon korumak için enjeksiyon sırasında steril tuz ile cerrahi site irrigate.
      2. 15 dakikada, transplantasyon iğnesini yavaşça geri çekin.  Cerrahi alanı tuz ile irrigate ve sütürler ile kesi kapatın.
    9. Postoperatif bakım gerçekleştirin
      1. Anestezi durdurma. 10 mg/kg dozda skruff içine Subkutan Enjeksiyon ile CsA sunun. Fareyi temiz ve önceden ısıtılmış postoperatif kafeye yerleştirin.
      2. 1,0 mg/ml 'de içme suyunda asetaminofen analjezik sağlayın.
        Not: uygun ıASUC standart çalışma Protokolü (SOP) ve deneysel sonuç değişkenlerinin dikkate alınarak analjezi sağlayın.
      3. Rehidrasyon ve iyileşme yardımcı olmak için nemlendirilmiş Chow gıda kurtarma kafesi sağlayın.
  6. Mouse 'un hayatta kalma süresi boyunca 10 mg/kg 'da günlük CsA enjeksiyonları devam edin.

3. sensorimotor entegrasyonu yapışkan bant kaldırma testi

  1. Davranış testini yapmadan önce küçük bir tıraş bıçağı kullanarak elektrikli bandı 3 mm x 5 mm şeritlerine kesiniz. Yapışkan şeritleri kesmek için pürüzsüz bir cam yüzey kullanın.
    Not: fareler bu renkler21arasında ayırt zorluk var gibi sarı ve kırmızı bant kullanın.
    1. Temiz plastik kutunun içinde iyi uyan küçük bir ayna seçin.
      1. Aşağıda hayvan davranışlarını görmek için modelleme kil veya yapışkan bant ile kabaca 45 ° açı yerinde ayna düzeltin.
    2. Kutu ve ayna montajı sessiz bir özel davranış test odasında bir bankta yerleştirin.  Ayna üzerindeki plastik kutuda silindir düzenleyin.
    3. İşleme bezi, cımbız ve yapışkan şeritleri davranış test kutusunun yanındaki tezgah üzerinde düzenleyin.
    4. Kutu ve silindir 70% etanol ve kağıt havlu ile temizleyin.  Yüzeylerin iyice kurumasına izin verin.
    5. Fareleri davranış testi odasına getirin. Farelerin, davranış testinden en az 30 dakika önce test odasına girmesine izin verin.
    6. Test sırasında idrara çıkma olaylarını en aza indirmek için kafeslerden su kaynaklarını çıkarın, bu da verimli test performansına engel olabilir.
  2. Yapışkan kaldırma testini gerçekleştirin
    Not: Bu davranış testi en iyi iki ila üç müfettişler tarafından gerçekleştirilir: bir stopwatches çalıştırmak için ve bir veya iki fareler işlemek ve davranışını gözlemlemek için.
    1. Her renk bir yapışkan şerit soyma her cımbız kullanın.
      1. Hangi Şerit rengini hangi forepaw karşılık gelir ve deneme boyunca tutarlı kalır seçin.
    2. Hareket bezi kullanarak bir fareyi boyun ve geri germe tarafından bir fare dizginlemek için fare, vücut ve kafa uzak forepaws tutar.
    3. Her forepaw plantar yüzeyine bir yapışkan şerit yerleştirmek için cımbız kullanın. Şeritler pençeleri güvenli hale getirmek için hassas ve tutarlı parmak basıncı kullanın.
    4. Fareyi hızlı bir şekilde plastik silindire yerleştirin. Fare plastik kutuda tüm dört pençeleri olduğunda iki stopwatches başlatın.
    5. Aşağıdaki dört olayların gecikmeleri kaydetmek için iki stopwatches kullanın: sol Paw uyarısı, sol Paw kaldırma, sağ pençe uyarısı, sağ pençe kaldırma.
      1. Hayvan sallayarak veya pençe titrediğin veya Strip ısırarak yapışkan şerit belirsiz tanınması yaptığında bir bildirim olayı kaydedin.
      2. Hayvan, forepaw plantar yüzeyinden şeridi etkili bir şekilde kaldırdığında bir kaldırma olayını kaydedin.
        Not: kaldırma olayı, şerit okumaları tarafından diskalifiye edilmez veya şerit, forepaw yan yüzeyine yapışırsa.
      3. Karşılık gelen şerit kaldırılmadı 120 s Zamanlayıcı durdurun.
      4. Veri sayfasındaki dört olayın geçen sürelerini kaydedin.
    6. Her fare üzerinde ikinci bir deneme gerçekleştirin
      1. Testte etkili performansı engelleyebilir, stres azaltmak için tek bir fare için denemeler arasında en az 5 dakika geçmesi izin verin.
      2. Tek bir kafesin birden fazla fareler test ederken atık kaldırmak için test fareler arasında kağıt havlu ile cihazı temizleyin.
        1. Çoklu kafeslerden fareler test ederken 70% etanol ve kağıt havlular ile iyice temizleyin.
      3. Rengin herhangi bir etkisini rastgele etmek için oturumun ikinci deneme sürümü için renk Paw yerleştirme sırasını tersine çevirin.
    7. Her bir hayvan için günlük oturum başına iki deneme arasındaki her olayın ortalama gecikme süresini hesaplayın.
  3. Cihazı temizleyin ve bezi suyla iyice kullanın, kafes su kaynaklarını değiştirin ve fareleri tutma tesislerine geri dönün.
  4. Tekrarlanan önlemler deneme tasarımı için ardışık deneysel timepoints üzerinde 3.1-3.2 adımlarını yineleyin.
    Not: tekrar adımları 3.2.1-3.2.5.3 her gün için 5 gün önce herhangi bir veri koleksiyonu için hayvan görev için gelmesini. Ameliyattan önce temel veri edinme önerilir.

4. greft sağkalım ve yaralanma patolojisinin diaminobenzidin (DAB) immunohistokimyasal Analizi

  1. Hayvan ötenize ve bir transcardial perfüzyon gerçekleştirin.
    1. PBS 'de 0,1 M fosfat-tamponlu tuz (PBS) ve% 4 paraformaldehit (PFA) çözümlerini hazırlayın. Denge pH her iki çözüm için 7,4.
    2. Bir duman kaputu buz üzerine iki çözüm yerleştirin. Duman kaputu bir peristaltik pompa yerleştirin ve PBS ile tüp doldurmak için pompa çalıştırın. Pompa akış hızını ~ 7 ml/dak olarak ayarlayın.  Pompanın çıkış tüpüne 25 G iğne bağlayın.
    3. Kaput içinde yumuşak bir substrat ile bir drenaj tepsisi yerleştirin. Tepsinin bir ucunu hafif bir açıyla yükselt, böylece perfüzyon sıvılarının alt ucuna boşaltılma.
    4. Bir anestezi indüksiyon odasına bir fare yerleştirin. Sıkıştırılmış 100% oksijen araç gazını kullanarak odası% 4 Isoflurane ile doldurun.
    5. Anestezi burun koni için odasından anestezize fare taşıyın. Isoflurane% 2 azaltın.
    6. Kalbi açığa çıkarmak için bir torakotomi gerçekleştirin. Anestezi durdurma, torakotomi ötenazi neden olur.
    7. Özenle kalp uzun ekseni boyunca sol ventrikül perfüzyon pompası çıkış iğne yerleştirin. Bu kötü perfüzyon neden olacak gibi, kalp septum delmeyin.
    8. Sağ atriyum kesmek için küçük makas kullanın, sonra hemen peristaltik pompa açın.
    9. Sağ atriyum bırakarak sıvı kan net çalışır kadar PBS akışına devam edin.
      1. Pompası kapat. Pompa emme tüpünü PFA 'nın kabına taşıyın. Pompası yeniden başlatın. Hayvan yeterince katı ya da 20 ml hacmine kadar pompalanan kadar PFA durumu devam edin.
      2. Pompası kapat. Dış akış iğnesini kalbinden çıkarın. PFA gelen emme tüpü PBS taşıyın ve iyice tüp gelen PFA dışarı floş.
  2. Dikkatli diseksiyon tarafından kafatasından beyin çıkarın. Beyin 4% paraformaldehyde ile dolu küçük bir kap içine yerleştirin ve beynin 4 °C ' de bir gecede düzeltme sağlar.
  3. Sonrası fiks sonrası gün, PBS ve 0,1% Sodyum azid ile P değiştirin. Histolojik bölümleme için hazırlık kadar bu çözüme beyin saklayın.
  4. Bir donma mikrotome veya oda sıcaklığı vibratom aracılığıyla formaldehit-sabit beyin dokusu 40-50 μm bölümleri toplayın.
  5. Doku pretreat 0,3% hidrojen peroksit su içinde nonspesifik boyama üretebilir endojen peroksidazlar, devre dışı.
  6. 60 °C ' de 30 dakika boyunca sitrik asit tamponu (10 mM sodyum sitrat, 0,05% polysorbate-20, pH 6,0) kullanarak antijen alımı gerçekleştirin.
  7. Standart yöntemlerle antikor etiketleme gerçekleştirin.  Bakın Lundell et al.' s raporu22 daha fazla ayrıntı için bu laboratuvarda.
    1. Endojen antikorları ile çapraz reaktivite azaltmak için bir fare IgG nötralizasyon kiti ( malzeme tablosunabakın) kullanın. Üreticinin yönlerinin ardından, oda sıcaklığında (RT) en az 1 saat boyunca IgG nötralizasyon tamponunun dokularını inküt.
    2. Bir fare anti-human nükleer antijen primer antikor kullanın (hNA; 1:500 seyreltme) nakledilen hücreleri bulmak için insan iPSC-türeyen hücreleri naklederken. Yumuşak ajitasyon kullanılarak 48-72 h için 4 °C ' de primer antikor ile dokulara inküye yapın.
    3. Primer antikor çözeltisi ile durulama sonrasında, RT 'de 2 h için 1:250 seyreltme sırasında HRP-konjuate Anti-Mouse ikincil antikor ile dokulara inkük.
    4. İmmunolabeling ortaya çıkarmak için standart yöntemlerle DAB Kromojen reaksiyonu gerçekleştirin. DAB reaksiyonunun RT 'de 5 ila 10 dakika geliştirmesine izin verin.
  8. Kaydıraklara lekeli dokular takın ve standart yöntemleri kullanarak kapak makbuzları uygulayın.
  9. Önceden açıklandığı gibi tarafsız stereoloji kullanarak etiketli hücrelerin numaralarını ölçmek23,24. 20 μm optik bölüm ve üç adet kesit aralığı kullanılarak analiz gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kraniyektomi cerrahisi deneysel beyin yaralanması ve terapötik hücre nakli kolaylaştırır: beyin yaralanması ve sonraki hücre transplantasyonu tedavisi kontrollü kortikal darbe modeli üst kafatası dikkatli kaldırılması gerekir. Kraniyektomi, kafatasının herhangi bir dorsal yüzeyinde, manipülasyonlara ilginin beyin bölgesine izin vermek için gerçekleştirilebilir. Şekil 1 ' deki diyagram, primer somatoduyusal ve motor korozları ortaya çıkarmak için 5 mm çap Kraniyektomi şemasın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Deneysel rejeneratif tedaviyi test etmek için bir model sistemi olarak hafif CCı
CCı modeli korteks mekanik yaralanmadan sonra doku disfonksiyon mekanizmaları araştırmak için değerli bir araçtır. Yaralanma parametrelerin ayarlanabilirlik bu modelin çekici bir özelliktir. Etkisi Z derinliği değiştirme, hız, ya da bekleme süresi artırabilir veya araştırmacı tarafından istenen yaralanma şiddeti azaltabilir10,25. Düzgün gerçekleştirildiğinde, müda...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, nörobilim ve rejeneratif tıp merkezi 'nden bir hibe tarafından destekleniyordu (CNRM, Grant numarası G170244014). Yapışkan kaldırma pilot çalışmalarında Mahima Dewan ve Clara Selbrede 'nin yardımını takdir ediyoruz. Kryslaine Radomski ön beyin hasarı ve hücre transplantasyonu ameliyatı gerçekleştirdi. Amanda Fu ve Laura Tucker USU CNRM preklinik çalışmalar çekirdek laboratuar sırasıyla hayvan ameliyatları ve davranış testi, değerli tavsiyeler sağladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 ml şırıngaBecton Dickinson (BD) 
1.7 ml flip top test tüpleriDenvilleC2170
10 mikrolitre şırıngaHamilton7635-01
25G Hassas Kayma şırınga iğneleriBecton Dickinson (BD) 
305122 %70 etanolTercih edilen ürün; bölgeye göre değişir
asetaminofen oral süspansiyonTylenol (Çocuk)Su anestezik buharlaştırıcıda 1 mg / ml'ye seyreltin
Vetland521-11-22
hayvan taşıma beziBüyük mağazadan satın alın
BetadinePurdue ÜrünleriNDC-67618-151-32
basınçlı oksijenTercih edilen ürün; bölgeye göre değişir
siklosporin ASigma-Aldrich30024-100mg
DAB boyama kitiVektör LaboratuvarlarıSK-4100
dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD8418-500ml
DMEMInvitrogen (ThermoFisher)A14430-01
eşek anti-fare IgG antikoru, HRP konjugeJackson ImmunoResearch715-035-151
elektrik bandı3M CorporationMağazadan
ince cımbızGüzel Bilim Araçları11254-20
forsepsGüzel Bilim Araçları91106-12
cam kılcal pipetler, 1 mm Dış Çap, 0,58 mm İç ÇapDünya Hassas Aletler1B100F-3
Yüksek Hızlı Döner Mikromotor KitiForedom Electric Co. K.1070 - K.107018
5 Hücreli Noktalı İdeal Mikro Matkap Çapak SetiScientific 60-1000
Impact CCI için Bir Stereotaksik Çarpma Tertibatı Leica Biosystems39463920
izofluranBaxterNDC-10019-360-60
laboratuvar tezgahı zamanlayıcılarıFisher Scientific14-649-17
Mikropipet çektirmeMicroData Instruments, Inc.PMP-102Herhangi bir çektirme yeterli olacaktır
Mikroskop kapak kızaklarıFisherbrand12-545-E
Mikroskop kayar montaj ortamıTercih edilen
ürün aynaMağazadan satın alın
fare anti-insan nükleer antijen antikoruMillipore MAB1281
Fare üzerinde Fare engelleme kitiVektör LaboratuvarlarBMK-2202
iğne tutucu kanama durdurucuGüzel Bilim Araçları12002-12
oftalmik merhemFalcon İlaçNDC-61314-631-36
oftalmik yaylı makasGüzel Bilim Araçları15018-10
plastik kutuMağazadan satın alın
plastik silindirMağazadan satın alın
QSI motorlu şırınga pompasıStoelting53311
Çıkarılabilir iğne sıkıştırma bağlantısıHamilton55750-01
küçük kemirgen stereotaksik çerçeveStoelting51925
küçük makasGüzel Bilim Araçları14060-09
StemPro AccutaseInvitrogen (ThermoFisher)
Steril alkol hazırlama pedleriFisherbrand06-669-62
steril pamuklu çubuklar/Kendall Q-ipuçlarıTyco Healthcare540500
Steril tuzlu suHospiraNDC-0409-1966-07
Kronometreler (2)Fisher Scientific06-662-56
Superfrost Plus Gold mikroskop slaytlarıFisherbrand15-188-48
sütürler - 5.0 kavisli iğne ile ipekOasisMV-682
309659 satın alın A1110501

Kaynaklar

  1. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
  2. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
  3. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
  4. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
  5. Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
  6. Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781(2014).
  7. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  8. Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280(2014).
  9. Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
  10. Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142(2013).
  11. Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
  12. Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
  13. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
  14. Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
  15. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  17. Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
  18. Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
  19. Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303(2013).
  20. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
  21. Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
  22. Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
  23. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
  24. Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
  25. Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
  26. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
  27. Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
  28. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232(2014).
  29. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
  30. Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
  31. Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
  32. Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
  33. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7, 825-826 (2010).
  34. Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
  35. Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
  36. Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
  37. Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Travmatik Beyin Hasarnsan nd klenmi Pluripotent K k H crelerN ral H cre TransplantasyonuStereotaksik CerrahiYap kan Bant karma Testimm nohistokimyasal AnalizKraniektomi Prosed rH cre K lt r Biyog venli iAmeliyat Sonras Bak m
Insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilen nöral hücrelerin terapötik transplantasyonu ile fare beyin yaralanması kontrollü Kortiik darbe modeli
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.