İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması

İskelet kası insan vücudundaki en büyük organ sistemidir ve tüm vücut kütlesinin%30−40'ını oluşturur. Hareket onun iyi tanınan rolüne ek olarak, iskelet kası vücut ısısını ve duruşunu korur, ve tüm vücut besin homeostaz merkezi bir rol oynar. İnsan katılımcılar, hayvanlar ve hücre kültürü modellerini içeren araştırmalar iskelet kas biyolojisi ve yenilenme ile ilgili soruları ele almak için değerlidir. İzolasyon ve insan birincil kas atası hücrelerinin kültürü (hMPCs) hücre kültürü teknikleri ve manipülasyonlar insan örneklerine uygulanması için izin veren sağlam bir model sağlar. HMPCs kullanmanın bir avantajı, her donör^2,3genetik ve metabolik fenotip korumak olduğunu. Donör fenotipin inbakımı, araştırmacıların miyojenik süreçteki bireysel varyasyonları incelemelerine olanak tanır. Örneğin, hMPC nüfus genişleme kapasitesi⁴yaş ve cinsiyete bağlı farklılıkları belirlemek için hMPC karakterizasyon yöntemimizi çalıştırdık.

Bu protokolün amacı, hMPC'leri iskelet kas biyopsi dokusundan izole etme, kültür, karakterize etme ve ayırt etme tekniklerini detaylandırmaktır. HMPC'leri tanımlayan ve hMPC^yalıtımıiçin potansiyel hücre yüzeyi yapıcıları tanımlayan önceki çalışmalardan oluşan 5^,6, bu protokol, hMPC'lerin karakterizasyonuna izolasyon bağlayarak bilgideki kritik bir boşluğu doldurur. Ayrıca, bu protokolde yer alan ayrıntılı adım adım talimatlar, hMPC'lerle sınırlı deneyimi olanlar da dahil olmak üzere, hMPC yalıtımını ve karakterizasyonu geniş bir bilimsel hedef kitle için erişilebilir hale getirir. Protokolümüz hücre popülasyonlarını izlemek için görüntüleme sitometresi kullanımını ilk tanımlayanlardan biridir. Yeni tasarlanmış görüntüleme sitometreleri, bir kültür damarının her kuyusundaki tüm hücrelerin birkaç dakika içinde canlı hücre görüntüleme, hücre sayma ve çok kanallı floresan analizini sağlayan son teknoloji ürünü, yüksek iş sahibi ve mikroplaka tabanlıdır. Bu sistem, tüm hücre popülasyonunun çoğalması ve yaşanabilirliğindeki dinamik değişikliklerin hızlı bir şekilde ölçülmesine ve kültüre en az düzeyde zarar verebilmeye olanak sağlar. Örneğin, farklı bağışçılardan elde edilen her kültürün büyüme kinetiklerini belirlemek için, birbirini izleyen günlerde in vitro birleştiğinde objektif bir araya gelmek için objektif önlemler alabiliriz. Literatürdeki birçok protokol, özellikle MPC'lerin farklılaşmasını içeren protokoller, hücrelerin farklılaşma veya tedaviyi başlatmadan öncetanımlanmış bir kesişme düzeyine ulaşmasını gerektirir 7. Yöntemimiz, araştırmacıların tarafsız, öznel olmayan bir şekilde tedaviye başlamalarına olanak tanıyan bir kültür gemisinde her kuyunun birleşmesi objektif olarak belirlenmesine olanak sağlar.

Geçmişte, birincil hMPCs kullanarak önemli bir sınırlama deneyler için kullanılabilir hücre sayısını sınırlayan düşük verimleri oldu. Biz ve diğerleri iskelet kas biyopsi salgı dokusundan MCD verimi göstermiştir 1−15 MPCs doku miligram başına (Şekil 1)⁸. Protokolümüz floresan aktif hücre sıralaması (FACS) ile arınma öncesinde hücrelerin dört geçişine izin verdiği için, az miktarda biyopsi dokusundan (50−100 mg) elde edilen kriyopayrılmış hMPC verimlerimiz araştırma amaçlarını ele almak için yeterlidir. birden fazla deney gereklidir. FACS protokolümüz ~%80 saf (Pax7 pozitif) MPC popülasyonu üretir, böylece protokolümüz hem verim hem de saflık için optimize edilsin.

Bu protokol Cornell Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm katılımcılar altta yatan sağlık koşulları için tarandı ve bilgilendirilmiş onay verildi.

1. İskelet Kas Biyopsisi ile İnsan Kas Dokusu Elde

1. Palpasyon yoluyla vastus lateralis kas tanımlayın, anatomik yerler, ve kas aktif kasılması.
2. Palpate vastus lateralis katılımcı onların quadriceps kas sıkın ve kas ın göbek bulmak, yaklaşık 1/3 patella kalça yolu, ve sadece femur için ventrolateral.
3. Kanın göbeğini temsil eden patellanın üst kısmından yaklaşık 4−6 inç uzaklıkta cerrahi belirteç içeren bir bölgeyi işaretlemek için bir kağıt ölçüm bandı kullanın.
4. İşaretli alana yakın herhangi bir saç tıraş ve daha sonra tıbbi işlemlerden önce kullanılan bir cerrahi sınıf antiseptik ile temizlemek (Örneğin: 2% klorheksidin glukonat (CHG)/ 70% isopropil alkol (IPA)) .
5. Biyopsi bölgesini %1 lidokainile anestezi edin.
   NOT: İskelet kası içine lidokain enjekte kaçının.
6. İşaretli bölgede 4−5 mm'lik bir kesi yolu yapın.
7. Alan anestezi edildikten sonra, trocar ile bergstrom iğnesini fasyadan kasın karnına doğru itin (yaklaşık 2−3 cm).
8. Bir asistan bağlı 60 mL şırınga pistonlu çekerek emme uygularken kesme trokar 2−3 cm çekerek Bergstrom iğneiçine kas dokusu çizin.
9. Kesme odasını kapatın.
10. Biyopsi iğnesinin tabanını çeyrek dönüşle döndürün ve iğneyi açma, emme uygulayarak ve iğneyi kapatma sırasını tekrarlayın.
    NOT: İğne her kapanında Bergstrom iğnesinin içinde kas dokusundan bir kesik alınmalıdır. Numune toplama sırasında, iğne her numuneyi elde etmek için 360° boyunca uzunlamasına döndürülürken aynı dikey pozisyonda uylukta kalır. Bu sıra 3−4 kez tekrarlanabilir.
11. Toplanan biyopsi dokusunu iğneden steril yapışmaz pansuman yastığına at.
12. Doku incelemek ve steril neşter bıçakları veya cımbız kullanarak herhangi bir görünür yağ ve fibrotik dokuları kaldırın.
13. Bir kısmını (50−100 mg) CO₂-bağımsız besin ortamı içeren steril bir tüpe yerleştirin (örn. Hazır da Hazır A).
    NOT: Dokunun ağırlığı aşağıdaki gibi belirlenir. İlk bir ölçek ve tare üzerinde besin orta içeren kapaklı tüp yerleştirin. Sonraki tüp içine doku yerleştirin, tüp recap, ve sonra besin orta doku içeren tüp tartmak.
14. Doku ve besin ortamını içeren tüpü işleme konana kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: Biyopsi dokusu toplama 48 saat içinde işlenmelidir.

2. Biyopsi Dokusundan İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzine

1. Mince biyopsi dokusu.
   1. Biyolojik bir güvenlik kabini veya benzer steril bir işyerinde steril petri kabına besin ortamdan kas dokusu aktarın.
   2. Steril neşter bıçakları kullanarak dokuyu ~1 mm³ adet eve doğrama.
2. Artık enkaz kaldırmak için kıyma biyopsi doku yıkayın.
   1. Kas dokusunu 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın ve dokunun yerçekimi yoluyla yerleşmesini bekleyin.
   2. Aspire supernatant kas dokusunu rahatsız etmemek için dikkatli olmak.
   3. Yıkanmış dokuya 10 mL PBS ekleyin ve kas dokusunun yerçekimi ile yeniden yerleşmesine izin verin.
   4. Aspire supernatant kas dokusunu rahatsız etmemek için dikkatli olmak.
   5. Düşük glikoz Dulbecco modifiye Kartal orta (DMEM) 10 mL ekleyin ve doku yerçekimi yoluyla yeniden yerleşmek için izin.
   6. Aspire supernatant kas dokusunu rahatsız etmemek için dikkatli olmak.
3. Sindirimi ortamdaki dokuyu kuluçkaya yatırın.
   1. Sindirimi media 3 mL kas dokusu resuspend (2 mg / mL kollajenaz D düşük glikoz DMEM).
      NOT: Kollajenaz D stok çözeltileri düşük glukozlu DMEM'de 20 mg/mL'de hazırlanabilir ve -80 °C'de saklanabilir, daha sonra kullanım sırasında düşük glukozlu DMEM'de 1:10 seyreltilebilir.
   2. 37 °C'de bir su banyosunda kas dokusuiçeren tüpü 30 dakika kuluçkaya yatırın.
   3. 10 mL serolojik pipet veya geniş delikli pipet kullanarak kas dokusu süspansiyonu her 10 dakikada bir triturate.
   4. 83 μL ek sindirim ortamı ve 24 μL dispase çözeltisi (0.76 mM kalsiyum asetat, 1.39 mM sodyum asetat, 13.91 mg/mL dispase II düşük glukozLu DMEM) ekleyin. Süspansiyonu 37 °C su banyosuna geri döndürün.
   5. Kas dokusu süspansiyonu her 5−10 dakikada bir geniş delikli pipet ucuyla triturate.
   6. Tek tip bir bulamaç elde edilene kadar ve sindirimüzerinde önlemek için en fazla 1,5 saat için trituration devam edin.
      NOT: Doku yeterli mincing ve kollajenaz ve dispase enzimatik aktivitesi örnek sindirim etkileyebilir. Tek tip bir bulamaç 1,5 saat sonra minimum tıkanıklık ile normal bir pipet ucu geçmek gerekir. 1,5 saat sonra tek tip bir bulamaç elde edilmezse, doku kıymasının yeterli olup olmadığını iki kez kontrol edin ve doku uygun boyuta kadar doğrlanır (adım 2.1.2). Ayrıca, enzimlerin aktivitesi enzimaktivitesi oluşur çok çok varyasyon olarak test edilmelidir.
4. Pelet hücreleri ve kurtarma ortamlarında donma.
   1. Kas bulamacına 6 mL büyüme ortamı (GM; %79 Ham F12, %20 fetal sığır serumu, %1 penisilin/streptomisin, 5 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü [bFGF], pH 7.4, 0.22 μm filtreden geçerek kas bulamacına ekleyin.
   2. Pipet 50 mL konik bir tüp içine 70 μm hücreli süzgeç ile süspansiyon. Süzgeci ilave 4 mL GM ile durula.
      NOT: Numune, peletin görüntülemesi için 15 mL konik bir tüpe geri aktarılabilir. Sonraki hücre verimleri düşükse daha büyük bir yıkama hacmi kullanılabilir.
   3. Oda sıcaklığında (RT) 5 dk için 300 x g santrifüj.
   4. Pelleti bozmamaya emin olmak için supernatant aspire. Kalan ortamda pelet iaskıya almak için tüpü titretin. Hücreler kültüre alınmayacaksa, uzun süreli depolama yla ilgili talimatlar için hemen 2.4.5 adımına geçin, aksi takdirde 3.1.6.adıma geçin.
      NOT: Acil kültür isteniyorsa, biyopsi işlemi başlamadan önce hücre kültürü plakalarında GM önceden kuluçkaya yatırılmalıdır (3.1.1 ve 3.1.2 adımları).
   5. Kurtarılan pelete 1,5 mLkurtarma hücresi kültürü dondurma ortamı (Malzeme Tablosu) ekleyin.
   6. Bulamacı bir cryovial'a aktarın. Cryovial'ı bir gecede -80 °C'de bir isopropanol kontrollü soğutucuya yerleştirin. Cryovial'ı -80 °C'de kültüre hazır olana kadar saklayın.
      NOT: Bulamaç içeren cryovials uzun süreli depolama için sıvı nitrojen tutulabilir (1 aydan fazla). İzopropanol kontrollü bir soğutucu kullanarak hücrelerin 1 °C/ dk oranında tekrartekrar dondurulmasını sağlar ve dondurulduktan sonra canlılık ve hücre kültürü damarlarına bağlanma olasılığının artması yla optimum hücre iyileşme hızları ile sonuçlanır⁹. Alternatif olarak, -80 °C'lik dondurucuya yerleştirilen RT isopropanol içeren bir kabı kullanılabilir.

3. Culturing İnsan Kas Atası Hücreleri

1. Kas bulamacını eritin.
   1. HMPC'leri eritme ve tohumlamadan önce, GM'deki hücre kültür plakalarını önceden dengeleyin. Uzun süreli kültür de buharlaşmayı önlemek için kalan kuyuları 500 μL steril baz ortamı (yani F12) ile doldurun.
      NOT: 50 g ile 100 g arasındaki biyopsiler için 24 kuyuluk bir plakanın dört kuyusu uygundur. Biyopsi dokusu 50 g'dan az ise iki kuyu daha uygun olabilir. Artık enkaz ve düşük hücre numarası bu adımda bir hücre sayma tekniğikullanımını engeller; bu nedenle, tam tohumlama yoğunluğu belirlenmez ve biyopsiden biyopsiye kadar biraz farklılık gösterir.
   2. 37 °C'de GM ile tüp hücre kültür kaplarını tohumlamadan önce 1 saat için %5 CO 2'de kuluçkaya yatırın.
   3. -80 °C'lik dondurucudaki cryovialleri çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin; tüpteki sıvı tamamen suya batırılmalıdır.
   4. Erime neredeyse tamamlandığında (~5 dk), cryovial steril laminar akış kaputuna aktarın. Kas bulamacını cryovial tüpün dışına aktarın ve 1 mL/dk'lık bir hızda 6 mL önceden ısıtılmış GM içeren 15 mL konik tüp ekleyin.
   5. RT'de 5 dk için 300 x g kas bulamaç santrifüj.
      NOT: Bir sallanan kova santrifüj daha kolay bu adımda küçük pelet görselleştirmek için yapabilirsiniz ama gerekli değildir.
   6. Pelleti bozmamaya emin olmak için supernatant aspire. Kalan ortamda peleti yeniden askıya almak ve 1 mL GM'de yeniden askıya almak için tüpü hafifçe kaydırın.
   7. Önceden kuluçkaya yatan 24 kuyulu hücre kültürü plakasının 4 kuyunun her birine yeniden askıya alınan peletin (şimdi hMPC süspansiyonu olarak kabul edilir) 250 μL'lik kısmını aktarın.
2. Kültür ve geçiş hMPCs.
   1. GM'deki hMPC kültürlerini %5 CO2'de 37 °C'de koruyun.
      NOT: bFGF olmadan GM stokları (yani, F12, antibiyotikler, FBS) gruplar halinde hazırlanır ve 2 haftaya kadar 4 °C'de tutulur. bFGF kullanım gününde GM'ye eklenir. bFGF içeren ortamlar 4 °C'de 48 saat boyunca saklanabilir.
   2. İzolasyondan 24 saat sonra, GM'i aspire edin, kültür kabını önceden ısıtılmış GM ile 2 kat hafifçe yıkayın ve taze GM ekleyin.
      NOT: 24 saat hMPCs eklemek için yeterli zaman sağlamalıdır; yıkandıktan sonra hMPC'ler çıkarılmamalıdır. Bu adım aynı zamanda hücre hasadı sırasında oluşturulan kalan enkaz kaldıracak, bir görüntüleme sitometresi kullanarak doğru birleşimi için gemi daha uygun hale (bölüm 5 aşağıda). Bu ilk ortam değişikliğinden sonra, GM her 48 saat değiştirilir.
   3. %70'i birleştiğinde veya aynı kültür çanağının üzerinde 10 gün kalırken,hangisi ilk gerçekleşirse, geçiş hMPC'leri.
      NOT: %70'lik birleşim yaklaşık 55.000 hücre/cm 2'dir.
   4. Geçiş için, 24 kuyulu hücre kültür plakasının her kuyusuna önceden ısıtılmış tripsin 250 μL ekleyin ve ~5 dk kuluçkaya yatırın.
   5. HMPC'leri ayırmak için hücre kültür kabına sağlam bir yüzeyüzerinde dokunun. Bir ışık mikroskobu hMPCs ayrılmış olduğunu doğrulamak için kullanılabilir.
   6. Trypsin/hMPC süspansiyonları 15 mL konik tüpte 5 mL GM'ye aktarın.
   7. 300 x g'de hMPC süspansiyonu 5 dk RT'de santrifüj edin.
   8. HMPC süspansiyonları santrifüjden çıkarın ve steril laminar akış kaputundaki buza yerleştirin.
      NOT: Geçerken hMPC'lerin buzüzerinde tutulması daha az hücre agregasyonuyla sonuçlanır.
   9. HMPC'lerden aspire süpernatant ve 1 mL GM'de peleti yavaşça yeniden askıya alın.
   10. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
       NOT: Hücre süspansiyonunun hücre sayma tamponuna 1:5 seyreltilmesi genellikle uygundur.
   11. Cm²başına 3.500 hücre yoğunluğunda önceden ısıtılmış GM içeren kollajen kaplı kültür yemekleri üzerine Tohum hMPCs . 10 cm plaka ve 24 kuyulu plakakombinasyonu idealdir. 24 kuyulu plakalar büyümeyi izlemek için günlük görüntüleme sitometresi üzerinde taranabilir.
   12. Sonraki geçişler için aynı yordamı (adım 3.2.4'ten başlayarak) uygulayın.
       NOT: Hücre sağlığı ve saflığı hücresel senescence (örneğin, β-galaktosidaz) ve Pax7 için immünboyama bir belirteç kullanılarak pasajlar arasında izlenebilir.
3. HMPC'leri kriyokoru.
   1. Kültür hacmini daha yönetilebilir hale getirmek için daha sonra kullanmak üzere fazla hücreleri korumak.
   2. Kriyopreservation için, 3.2.4.-3.2.9 adımlarında açıklanan tripsinizasyon prosedürünü uygulayın.
   3. Hücre süspansiyonu santrifüj edilirken, yeterli karıştırmayı sağlamak için %20 (örneğin, 200 μL) dimetil sülfoksit (DMSO) ve %80 (örn. 800°L) GM. Pipet incirinin 20 kat yukarı ve aşağı bir karışımını hazırlayın. Karışımı buz üzerinde dinlenmeye bırakın.
   4. Hücre sayısına bağlı olarak, hMPC süspansiyonuGM'de 2 x 10 6/mL'ye seyreltin.
   5. hMPC süspansiyon ve% 20 steril DMSO/80% GM karışımı 50/50 birleştirin. Son kriyopreservation medya DMSO (%10) bir kombinasyonudur ve GM (%90) 1 x 10⁶ hMPCs/mL içeren.
   6. Adım 3.3.5'te hazırlanan hMPC süspansiyonunun 1 mL'sini ilk hücre sayısının izin verdiği kadar cryovial'a yerleştirin. Daha sonra bir gecede -80 °C'lik bir dondurucuya isopropanol kontrollü soğutucuya aliquoted hMPC'leri yerleştirin.
      NOT: Bu adımda, genellikle 5 ila 15 milyon arasında hücre elde edilir ve bunların %30−60'ı FACS tarafından hMPC olarak tanımlanır.

4. Akış Sitometri ile Pax7⁺ İnsan Kas Progenitor Hücreleri İzole

1. Canlı kültürlerden hMPC'ler hazırlamak için (adım 3.2.11), 1 x 10⁶−2 x 10⁶ toplam hücre için yeterli kültür kaplarını deneyin. 3.2.4−3.2.9 adımlarında açıklandığı gibi hücre süspansiyonlarını hazırlayın.
2. Cryopreserved kültürlerden hMPC'ler hazırlayın (adım 2.4.6 veya 3.3.6).
   1. Her donör için ~1 x 10⁶ geçit dört hMPC içeren 1−2 tüp seçin.
      NOT: Geçit dört hMPCs kullanarak hala geçit altı kadar proliferatif potansiyelini korurken yeterli hücre verimi sağlar (Şekil2).
   2. -80 °C'lik dondurucudan çıkararak ve tüpteki sıvı tamamen batırılmış bir 37 °C su banyosuna koyarak hücreleri hızla eritin.
   3. Erime neredeyse tamamlandığında (~5 dk), hMPC'leri steril laminar akış kaputuna aktarın ve hücre süspansiyonunun içeriğini 1 mL/dk'lık bir hızda 15 mL konik tüpte 6 mL önceden ısıtılmış GM'ye aktarın.
   4. 3.2.7−3.2.9 adımlarında açıklandığı gibi hücre süspansiyonlarını hazırlayın.
   5. 3 mL FACS tamponundaki her bir peleti yeniden askıya alın (500 mL PBS, 12,5 mL normal keçi serumu, 2 mL 0,5 M EDTA, pH 7,4, 0,22 μm filtreden geçti).
   6. Hücre süspansiyonuna 300 x g'de 5 dakika RT'de santrifüj edin.
   7. HMPC'lerden aspire süpernatant ve 250 μL FACS tamponunda peleti yavaşça yeniden askıya almak; buz üzerinde yerleştirin.
   8. 100 μL'lik hücreleri 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve canlı/ölü kontroller olarak kullanılmak üzere buzüzerinde bırakın (adım 4.5.1).
      NOT: Canlı/ölü kontroller için kullanılacak 100 ul hücre, her donörden yeniden askıya alınan hücrelerin küçük bir hacminin (~20 ul) ayıklanacak veya bankaya yatırılmış hücrelerden alınmasından kaynaklanabilir.
      NOT: Tek bir donörden 20 ul'dan fazla yeniden askıya alınmış hücre almamak önemlidir. < 100 ul hücre varsa FACS tamponu ile hacmi 100 ul'a kadar getirin.
3. Hücre yüzeyi belirteçleri için leke hMPC'leri.
   1. Aşağıdaki antikor kokteylini hazırlayın (gösterilen miktarlar her kültür için, uygun şekilde ölçeklendirilebilir): 5 μL CD56 (nöral hücre yapışma molekülü [NCAM]; PE-Cy7-konjuge) ve 5 μL CD29 (β1-integrin; AlexFluor488-konjuge). Son antikor seyreltme 1:50.
   2. Her hMPC süspansiyonuna 10 μL antikor kokteyli ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın.
   3. Her süspansiyon/antikor kokteyl karışımına 10 mL FACS tampon ekleyin.
   4. RT'de 5 dk için 300 x g'de her tüpe santrifüj.
   5. 300 μL FACS tamponundaki peleti yeniden askıya alın ve 5 mL yuvarlak alt polistiren tüpe aktarın.
   6. Süspansiyonu buzda tutun ve ışıktan koruyun.
4. Tazminat boncuklarını hazırlayın.
   NOT: Her antikor için pozitif kontroller ve negatif kontrol (lekesiz boncuklar) tazminat boncukları kullanılarak hazırlanmalıdır. Telafi boncuk kontrolleri, sıralanacak numunelerden önce akış sitometresi üzerinde çalıştırılmalıdır. Bu kontroller, her bir antikordan florokromun diğerinin kanalında ne kadar tespit edilebildiğini belirlemeyi sağlar, böylece tazminat uygulanabilir.
   1. Girdap tazminat boncukları.
   2. Üç adet 1,7 mL mikrosantrifüj tüpte bir damla (50°L) tazminat boncuk ekleyin.
   3. Her antikordan 1 μL'yi uygun tüpe ekleyin veya negatif kontrole hiçbirini eklemeyin.
   4. 15 dakika karanlıkta kuluçka.
   5. Her tüp ve girdap için 1,5 mL FACS tampon ekleyin.
   6. RT 5 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüj 300 x g her tüp santrifüj.
   7. Aspire süpernatant ve FACS tampon 200 μL pelet resuspend.
      NOT: Pelet görselleştirmek için çok zor olabilir; supernatant aspirating zaman dikkatli olmalıdır.
   8. Süspansiyonu 5 mL yuvarlak alt polistiren tüpe yerleştirin ve tüpü buzda tutun ve ışıktan koruyun.
5. Canlı ve ölü kontrolleri hazırlayın.
   1. HMPC'lerin 100 μL'sini adım 4.2.8'den 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne (biri canlı kontrol, diğeri ölü kontrol için) bölün.
   2. Ölü kontrol tüpünü önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğuna >10 dk için 70 °C'ye ısıtın. Bu süre zarfında, buz üzerinde canlı kontrol tutun.
   3. RT 5 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüj 300 x g her tüp santrifüj.
   4. Aspire süpernatant ve FACS tampon 150 μL pelet resuspend.
   5. Canlı/ölü kontrollerini tek bir 5 mL yuvarlak alt polistiren tüpte birleştirin.
6. Canlılık boyama gerçekleştirin.
   1. Sıralanacak hücreleri içeren tüm tüplere 7-aminoaktinomisin D (7-AAD) 1 μL ekleyin ve canlı/ölü kontrolü.
   2. Kollajen kaplı 24 kuyulu (250 μL/kuyu) ve 10 cm (8 mL/kuyu) plakalara GM ekleyin ve hücre kültürü kuluçka makinesinde %5 CO 2'de 37 °C'de dengede durun.
7. Akış sitometrisi ile hMPC'leri sıralayın.
   1. HMPC'leri 20 psi basınçta 100 μm nozül ile akış sitometresine sıralayın. Yan ve ileri dağılıma ve 7-AAD olumsuzluğuna göre canlı hMPCS'yi belirleyin (sıralama parametreleri ve temsili sıralama Şekil3'te görülebilir).
   2. PE-Cy7 (780/60 nm) ve AlexFluor488 (530/30 nm) pozitif hücreler CD56⁺/CD29⁺ hücreleri temsil eder ve böylece Pax7 pozitif hücrelerdir (hMPC). Çift pozitif hücreleri, 300 μL'lik FACS tamponu yastığı içeren toplama tüpleri halinde sıralayın.
      NOT: Sıralanmış kültürlerin saflığı Pax7 için immünboyama ile belirlenebilir ve ardından aşağıakım sitometri analizi (Şekil 4).
   3. Diğer tüm hücreleri atın.
   4. Sıralanmış hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın.
   5. HMPC süspansiyonu RT'de 5 dk için 300 x g'da döndürün.
   6. Dikkatle supernatant aspire ve GM 1 mL resuspend.
   7. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
      NOT: Hücre sayısı olumlu olarak sıralanan olayların sayısı olarak çıkarılabilirken, bu sayı geleneksel hücre sayma yöntemlerine göre hücre sayısını %10−40 oranında abarttığı bulunmuştur.
   8. 3.2.11 adımda belirtildiği gibi hMPC'leri tohumla.
      NOT: hMPC popülasyonunun saflığının doğrulanması Pax7 için immünboyama ve akış sitometrisi ile analiz ile belirlenebilir.

5. Görüntüleme Sitometresi Kullanarak İnsan Kas Atası Hücresi (hMPC) Kültürleri Karakterize

1. Birleşim taramaları gerçekleştirmek için görüntüleme sitometresini (Malzeme Tablosu) kullanın.
   1. Yeni Tarama Oluştur'u seçin ve ardından Plaka Kategorisi, Plaka Profili ve PlakaKimliği'ni girin/seçin. Görüntüleme sitometresi 96, 24 ve 6 kuyu plakasını barındırabilir.
   2. Uygulamaaltında, Confluence > Confluence1'i seçin.
   3. Ekranın sağındaki navigasyon cihazını kullanarak görüntülemek için bir kuyu seçin.
   4. Hücrelerin arka plana göre beyaz göründüğü bir odak düzlemi bulun ve kayıt kılavuzunu seçin veya otomatik kayıtseçerek görüntüleme sitometresinin odak düzlemini seçmesine izin verin.
      NOT: MalzemeTablosu'nda önerilen 96 kuyu plakası için yaklaşık konum 4,3 birimdir.
   5. Taranması gereken tüm kuyuları vurgulamak için fareyi kullanın. Tüm kuyu alanı otomatik olarak taranır. Başlat Tonu'nun'u seçin.
   6. Plaka ve hücre türü için en uygun analiz ayarlarını seçin.
      NOT: HMPC'ler için aşağıdaki ayarlar en uygundur: yoğunluk = 6, doymuş yoğunluk = 0, çap = 8, minimum kalınlık = 3, min küme boyutu = 500 ve hassasiyet = yüksektir.
   7. Başlangıç Analizi'niseçin.
      NOT: Kullanıcının ve görüntüleme sitometresinin hücrelerin çevresi konusunda anlaştığından emin olmak için görüntüleri görsel olarak inceleyin. Büyük bir tutarsızlık varsa, farklı bir odak lama düzlemi veya farklı analiz ayarları kullanarak plakayı yeniden tizleyebilirsiniz. Birleşim taraması kültürler arasındaki büyümeyi karşılaştırmak, tedavinin uygulanması nın zamanı veya hücreleri izlemek ve ne zaman farklılaşmabaşlatılamaya karar vermek için kullanılabilir. Farklılaşma isteniyorsa, ayrıntılar bölüm 6'da verilmiştir.
2. Hücreleri saymak için görüntüleme sitometresini kullanın.
   1. Ham'ın F12'si 12 mL, 6 μL Hoechst 33342 ve 24 μL propidium iyodür içeren bir boyama çözeltisi hazırlayın.
   2. Aspire ortam ve boyama çözeltisi ile değiştirin, 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
   3. Aspire boyama çözeltisi ve Ham F12 ile değiştirin.
      NOT: Net görüntüler elde etmek için fenol kırmızısı düşük seviyelerde bir ortam kullanmak önemlidir. Alternatif olarak, PBS kullanılabilir.
   4. Plakayı görüntüleme sitometresine yükleyin ve Uygulamanın altında Hücre Canlılığı > Canlı + Ölü +Toplam'ı seçin. Canlı kanal parlak bir alan görüntüsü olacak, ölü kanal propidium Iodide olacak, ve toplam kanal Hoechst 33342 olacak.
   5. Canlı kanalı parlak alana ayarlayın ve Odak Kurulumualtında Otomatik Kaydol'u tıklatın.
   6. Toplam kanalının altında, kanalı maviye ayarlayın. Çekirdekleri odaklamak için odak noktasını bul veya odak noktasını el ile ayarlamak için yukarı ve aşağı okları kullanın. Odak noktasını seçmek için ofset'i ayarla'yı tıklatın.
   7. Ölü kanalının altında, kanalı kırmızıya çevirin. Ölü hücreleri odak haline getirmek için odak bul odak noktasını kullanın veya odak noktasını el ile ayarlamak için yukarı ve aşağı okları kullanın. Odak noktasını seçmek için ofset'i ayarla'yı tıklatın.
   8. Tarama başlatmak için Tsk'i Başlat'ı seçin.
   9. Plaka ve hücre türüne uygun analiz parametrelerini seçin. Analizi başlatmak için Başlat Çözümlemesi'ni seçin. Analiz tamamlandıktan sonra, analizin hücreleri uygun şekilde saydığını görsel olarak doğrulayın (örn. her çekirdeğin çekirdek olarak kabul edildiğini ve görüntüleme sitometresinin arka plandaki herhangi bir noktayı saymadığını kontrol etmek için çekirdekleri). Tarama ve analiz tatmin ediciyse, plakayı kuvöze geri döndürün, aksi takdirde analiz parametrelerini tarayıp değiştirin.

6. Miyotubes İnsan Kas Progenitor Hücreleri (hMPCs) ayırt

1. Bölüm 5.1'deki protokolü kullanarak hMPC birleşimini belirleyin. HMPC'leri miyotüplere ayırmak için, hücrelerin görüntüleme sitometresi üzerindeki birleşim fonksiyonu tarafından belirlenen %80−85 koncaolması idealdir (bkz. bölüm 5). Birden fazla benzersiz donörden hMPC'ler kullanılırsa, biraraya gelen hücreler farklı donörlerden oluşan hücrelerin biraraya geldiklerinde farklılaşmaya başlamalarını sağlar.
   NOT: %80'inde yaklaşık 66.000 hücre/cm 2'dir.
2. Hücreleri 2x farklılaşma media ile yıkayın (%97 Ham's F12, %2 at serumu, %1 penisilin/streptomisin, pH 7.4, 0.22 μm filtreden geçirilir).
3. Günlük olarak ortam değiştirirken denemenin dikte ettiä i kadar fark ortamındaki hücreleri sÃ1/4r
4. Miyotube oluşumunu, 7−10 günlük farklılaşmadan sonra tipik olarak saptanabilen embriyonik miyozin ağır zinciri için immünboyama ile doğrudan değerlendirin.
   NOT: Miyotüpleroluşturmak için gereken süre, farklılaşma başlatıldığında donöre ve hücre sayısına bağlı olarak biraz farklılık gösterebilir; bu nedenle, her donörün kültürlerin ayrı ayrı izlenmesi tavsiye edilir.

HMPC izolasyonunun insan kas dokusundan temsili akış sitometrisi sonuçları Şekil1'de görülebilir. hMPC'ler ölü hücreleri veya döküntüleri ortadan kaldırmak için yan dağılım aveğine ve ileri saçılmaya dayalı ilk gating olayları ile tanımlanabilir, ardından sadece 7-AAD için negatif olan hücreler seçilebilir ve bu nedenle uygulanabilir. Hem hücre yüzeyi belirteçleri CD56 hem de CD29 için pozitif hücrelerin seçimi hMPC popülasyonunu temsil eder. 60 mg'lık bir biyopsi sadece yaklaşık 75−250 hMPC sağlar.

Temsili bir kesişme tonu Şekil 2A'dagösterilmiştir. Şekil 2B'deki yeşil anahatlar görüntüleme sitometresi tarafından oluşturuldu ve seçilen analiz ayarlarına göre görüntüleme sitometresinin nasıl biraraya geldiğini gösterdi. Gösterilen her iki görüntüde de görüntüleme sitometresi tarafından belirlenen biraraya gelen kişi, kullanıcı tarafından görsel olarak belirlenen birleşimi kabul eder. Ancak, bu görüntüler de görüntüleme sitometre mükemmel olmadığını vurgulamak. Örneğin, kırmızı ok, hücre olarak sayılan plakadaki bir kusuru vurgular. Bu kusurların çok sayıda plaka üzerinde varsa, ortaya çıkan birleşimi doğru hücrelerin birleşimini temsil etmez. Şekil 2C, hücreleri (brightfield, mavi ve kırmızı) ve birleştirilmiş görüntüyü saymak için kullanılan üç kanalın bir temsilini gösterir. Şekil 2D donörler arasında heterojenlik gösterir. Bu heterojenliği keşfetmek ve doğru bir şekilde karakterize etmek görüntüleme sitometresinin önemli bir uygulamasıdır. Şekil 2E, benzersiz donörlerin biraraya gelmesi ölçümleri ve çekirdek sayılarının son derece ilişkili olduğunu göstermektedir.

Şekil 3, bu protokolde açıklanan FACS yordamına dayalı hMPC'lerin nasıl tanımlanabilmek için bir kılavuz sağlar. İleri ve yan dağılıma dayalı gating, canlı hücrelerin enkazdan ayrılmasını sağlar (Şekil 3A). Tek hücreleri (Şekil 3B'deki kutulu alan) temsil eden olayları ayırt etmek için, yüksekliğe göre öne doğru dağılım ile yüzarası dağılım karşılaştırması kullanılmıştır. Canlı hücreler, canlılık lekesi 7-AAD (Şekil3C)dahil eksikliği ile işaretlenir. Son olarak, hem CD56 hem de CD29 için pozitif hücreler hMPC (Şekil3D)olarak tanımlanır. Bu protokolde açıklanan FACS prosedürünü doğrulamak için Pax7 pozitif hücrelerinin seçimi, pax7'ye özgü antikor ile hücreleri immünboyama ve akış sitometresi üzerindeki ifadeyi ölçme ile belirlenebilir. Şekil 4, pax7 immünboyama (Şekil4A) ile belirlenen hMPC'lerin sayısını, aynı hücre popülasyonundan bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan FACS prosedürü (Şekil4B)ile karşılaştırır. Şekil 5, FACS'dan sonra toplam popülasyonda pax7 ifade eden hücrelerin zenginleşmesini göstermek için akış sitometrisi yoluyla Pax7 immünboyama ve analizini kullanır (Şekil 5A Şekil 5B'yegöre ) ve Pax7 sayısının bakımını geçtikten sonra hücreleri ifade etme (Şekil 5B, Şekil 5C'yegöre ).

hMPC'ler bölüm 6'yı izleyerek miyotüpler oluşturacak şekilde ayırt edilebilir. İzole hMPC'lerin miyojenik kapasiteyi koruyup korumadığını belirlemek için embriyonik miyozin ağır zincire özgü bir antikor ile immünosentez yapılabilir ve floresan mikroskopi kullanılarak görselleştirilebilir. Embriyonik miyozin ağır zincir pozitif miyotüplerin temsili görüntüleri Şekil6'da görülebilir.

Şekil 1 : Doğrudan kas biyopsi simpy dokusundan alınan hMPC'ler için temsili akış sitometri görüntüleri. (A) Yan dağılım alanı (y ekseni) ve ileri dağılım alanı (x-ekseni) bir donör örneğindeki tüm hücreleri tanımlamak için kullanılan gating stratejisi. (B) canlı hücreleri tanımlamak için 7-AAD canlılık lekesi (y ekseni) ve ileri dağılım (x-ekseni). (C) Negatif seçim ayırma işaretçisi profili (-CD11b, -CD31, -CD45, -GlyA [y-eksen]) ve seçim işaretçisi CD34. (D) Negatif seçim işaretçisi CD34 (y ekseni) ile pozitif seçim işaretçisi CD29'dur. (E) Pozitif seçim işaretçisi CD56 (y ekseni) ile pozitif seçim işaretçisi CD29 (x ekseni). (F) Üç farklı iskelet kası biyopsisinden elde edilen sonuçlar. FSC = ileri dağılım; SSC = yan dağılım; hMPCs, insan kas atası hücreleri.

Şekil 2 : İnsan donörlerinden elde edilen hMPC'lerin proliferatif potansiyeli 6 pasajdan sonra korunur. (A) Temsili birleştirme tetkiki. (B) Görüntüleme sitometresinin birleşimi nasıl belirlediğini gösteren yeşil anahatlarla temsili birleştirme taraması. Kırmızı ok tabakta bir kusur gösterir. (C) Temsilci brightfield, Hoechst 33342 (mavi) ve propidium Iodide (kırmızı) boyama ve bu üç kanalın birleştirilmiş görüntüsü. Ölçek çubukları = 1mm. (D) 6 benzersiz donörden çekirdek sayar hMPC heterojenliğini vurgular. (E) Birleştiğive çekirdek sayısı oldukça ilişkilidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3 : hMPC yalıtımı için temsili akış sitometri sitometrisi ayırma parametreleri. (A) Yan dağılım alanı (y ekseni) ve ileri dağılım alanı (x-ekseni) bir donör örneğindeki tüm hücreleri tanımlamak için kullanılan gating stratejisi. (B) İleri dağılım yüksekliği (y ekseni) ile ileri dağılım alanı (x-ekseni) sıralama popülasyonundan iki katı ları diskalifiye etmek için. (C) İleri dağılım yüksekliği (y-ekseni) ve 7-AAD dahil canlı hücreleri tanımlamak için. (D) PE-Cy7 (CD56) ve AF488 (CD29) çift pozitif hücreleri (hMPCs) temsil eden Q2 ile boyama. Renk olayların yoğunluğunu temsil eder.

Şekil 4 : Cd29/CD56 pozitifliği ile Pax7 pozitifliğinin aynı donörden 4 hMPC'lik geçişte karşılaştırılması. (A) Sayı (y ekseni) ile Pax7 ifadesi (x ekseni). (B) Pozitif seçim işaretçisi CD56 (y ekseni) ile pozitif seçim işaretçisi CD29 (x ekseni). NCAM = nöral hücre adezyon molekülü; hMPC = insan kas atası hücresi.

Şekil 5 : Pax7 pozitifliği, aynı donörden elde edilen hMPC'lerde birden fazla pasajda korunur. (A) FACS sıralamadan önce 4 kez geçiş yapmış hücrelerin Pax7 ifadesi (x-ekseni). (B) CD29 ve CD56 pozitifliği (5 toplam pasaj) için FACS sıralama sonra hMPCs 1 pasajPax7 ifadesi (x-eksen). (C) CD29 ve CD56 pozitifliği (6 toplam pasaj) için FACS sıralama sonra hMPCs 2 pasajlar Pax7 ifadesi (x-ekseni).

Şekil 6 : Embriyonik miyozin ağır zincir için hMPC kaynaklı miyotüplerin boyanışı. DNA lekesi (Hoechst 33342, mavi) ve embriyonik miyozin ağır zincir (yeşil) (n = 3) ile birlikte boyanmış farklılaşmış hMPC'lerin temsili mikroskobik görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.