Yöntem makalesi

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

DOI:

10.3791/59655

⸱

6 Ekim 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials, Radboud University, 3Institute of Bioengineering, School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PdMS tabanlı, çok katmanlı, mikroakışkan bir cihazın in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) reaksiyonlarının uzun süreler boyunca gerçekleştirilmesine olanak sağlayan üretim süreci anlatılmaktadır. Ayrıca, bu reaksiyonları uzun süre ler boyunca otomatikleştirmek ve korumak için gereken donanım ve yazılıma kapsamlı bir genel bakış sağlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırmacılar daha büyük ve daha karmaşık sentetik genetik düzenleyici devreler geliştirmeyi amaçladıkça hücre temelli sentetik biyolojinin sınırlamaları giderek daha belirgin hale geliyor. In vivo sentetik genetik düzenleyici ağların analizi zaman alıcı dır ve çevresel kontrol eksikliğinden muzdariptir, eksojen sentetik bileşenler ev sahibi süreçleri ile etkileşime girerek istenmeyen davranışlara yol açar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, yeni devrelerin hücresiz karakterizasyonu daha yaygın hale gelmektedir. In vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) karışımları deneysel ortamın düzenlenmesine olanak sağlar ve her benzersiz sistem için optimize edilebilir. Burada sunulan protokoller, uzun süre ler için IVTT reaksiyonlarını sürdürmek için kullanılabilen çok katmanlı bir mikroakışkan cihazın imalatını ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Kaynakların zaman içinde tükendiği ve (by-) ürünlerin biriktiği toplu reaksiyonların aksine, mikroakışkan cihazların kullanımı kaynakların yenilenmesine ve reaksiyon ürünlerinin çıkarılmasına olanak sağlar. Bu şekilde hücresel ortam, gen devrelerinin dinamik davranışlarının uzun süre araştırılabildiği denge dışı bir ortam korunarak taklit edilir. Çok katmanlı mikroakışkan cihazdan tam olarak yararlanmak için, IVTT reaksiyonlarını otomatikleştirmek için donanım ve yazılım entegre edilmiştir. IVTT reaksiyonlarını burada sunulan mikroakışkan platformla birleştirerek, karmaşık ağ davranışlarını kapsamlı bir şekilde analiz etmek mümkün olur ve hücresel süreçleri düzenleyen mekanizmalar hakkında anlayışımızı ilerletebilirsiniz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler karmaşık dinamik düzenleyici ağlar1,2kullanarak kendi ortamlarını algılamak ve yanıt edebiliyoruz. Sentetik biyoloji alanında hücrelerin işlevselliğini genişletebilir biyolojik sistemler tasarlamak için bu ağları oluşturan doğal olarak oluşan bileşenlerin bilgimizi kullanır3,4. Buna karşılık, mevcut devrelerin basitleştirilmiş, sentetik analoglarını veya doğal olarak meydana gelen davranışlar sergileyen ileri mühendislik biyolojik sistemleri tasarlayarak yaşamı yöneten doğal ağları daha iyi anlamamızı da mümkündür. Bu tür biyolojik sistemlerin de novo mühendislik yeni genetik devreler veya sinyal yolları rasyonel bir şekilde, iyi tanımlanmış parçalar5,6kullanılarak tasarlanmış bir aşağıdan yukarıya bir şekilde gerçekleştirilir. Ağların rasyonel tasarımının biyolojik olarak ilgili sistemlerin tasarımı ile birleştirilmesi, biyolojik düzenleyici sistemlerin derinlemesine karakterizasyonuve incelenmesini çeşitli soyutlama düzeyleriyle mümkün kılar7.

Elowitz ve Leibler8 ve Gardner ve ark.9'un öncü çalışmaları sentetik genetik ağların hücresel konaklara başarılı bir şekilde girişini gösteren ilk çalışmalardır. Takip eden on yıl içinde, çok sayıda araştırmacı hücrelere sentetik devrelerin giriş ile ilgili çeşitli sınırlamalar ortaya çıkmasına rağmen bu ilk başarıları üzerine inşa etmeye devam etmiş7,10,11 ,12. İdeal olarak, hücresel konaklar içine sentetik devrelerin giriş modüler bir şekilde meydana gelmelidir. Ne yazık ki, hücresel ortamın karmaşıklığı bu özellikle zor hale getirir, birçok parça ve ağların fonksiyonu ile son derece bağlam bağımlı12,13,14. Sonuç olarak, ağlar genellikle sentetik devrenin işlevini etkileyebilecek yerli ana bilgisayar bileşeni ile istenmeyen etkileşimler yaşarlar. Benzer şekilde, eksojen ağın bileşenleri ev sahibi süreçleri inhibe edebilir, ana bilgisayar içinde paylaşılan kaynaklar için rekabet, ve büyüme kinetik etkisi15,16,17. Sonuç olarak, sentetik ağların in vivo bir ortamda ki davranışını rasyonel bir şekilde tasarlamak ve tahmin etmek için, tüm ana bilgisayar ve devreye özgü dinamiklerin kapsamlı bir modeli18gereklidir.

Sentetik ağların karakterizasyonu için hücresel ana bilgisayarların kullanımına uygun bir alternatif in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) teknolojilerinin uygulanmasıdır. Sentetik ağlar için bir test yatağı olarak hareket eden reaksiyonlar, gen ekspresyonunu sağlamak için gerekli tüm bileşenleri içeren çözeltilerde gerçekleştirilir19,20,21. Bu şekilde, bir biyolojik ilgili, yapay da olsa, çevre içinde sentetik ağlar test edilebilir oluşturulur22,23,24,25,26, 27,28. IVTT çözümleri kullanmanın en büyük avantajı, araştırmacıların her reaksiyonun kesin bileşimini ayarlayabilmeleri ile kullanıcı tarafından belirtilen koşullar altında reaksiyon lar gerçekleştirebilme yeteneğidir2. Ayrıca, hücre içermeyen yaklaşım sentetik ağların yüksek iş yapma yoluyla test edilmesini sağlar, çünkü zaman alan hücresel klonlama adımlarını gerçekleştirme ihtiyacını ortadan kaldırır. Sonuç olarak, ardışık tasarım süresi - inşa - test döngüleri önemli ölçüdeazalır 29,30,31,32. Tasarım döngüsü, Gibson montajı gibi hücresiz klonlama tekniklerini kullanarak yeni ağları hızla geliştirerek ve in vivo test için gerekli plazmidlerin aksine doğrusal DNA şablonlarından ağlar oluşturarak daha da hızlandırılabilir. polimeraz zincir reaksiyonları (PCR)33,34ile güçlendirilebilir.

Toplu reaksiyonlar, tüm reaksiyon bileşenlerinin birleştiği tek bir reaksiyon kabı gerektiren, IVTT reaksiyonlarının yapılabildiği en basit yöntemdir35. Bu tür reaksiyonlar protein ekspresyonu için yeterlidir ve temel devre testi bir ağın uzun vadeli dinamik davranışını incelemeye çalışırken yetersiz kalır. Toplu işlem boyunca reaktifler ya tükenir ya da transkripsiyon ve çeviri oranlarında sürekli bir düşüşe neden olur. Ayrıca, reaksiyonlar ilerledikçe yan ürünler, ağın doğru işleyişini engelleyebilecek veya tamamen engelleyebilecek biriktikçe. Sonuçta, toplu reaktörlerin kullanımı gözlemlenebilir dinamik davranışı sınırlar, negatif düzenleme özellikleuygulamakiçin zor olan 5,36.

IVTT sistemlerinin çok yönlülüğü, sürekli akıştan damlacık bazlı yöntemlere ve daha basit diyaliz yaklaşımlarına kadar uzun süreli IVTT reaksiyonlarının uygulanabileceği birden fazla alternatif yöntem e-sataşabilir. 37,38,39,40. Mikroakışkan cihazların uygulanması, kullanıcılara reaksiyonları üzerinde daha fazla kontrol sağlarken, iş bürünme ve maliyetleri en aza indirme35,41,42, her bir yaklaşım la kendi avantajları. Sürekli akış kullanımı kolayca ifade verimleri artırmak için optimize edilebilir ancak, etkili belirli reaksiyon ürünleri kaldırmak için yetersizlik dinamik davranış önemsiz olmayan çalışma yapar39. Damlacık tabanlı mikroakışkan sistemler istihdam ederken yeni ağların yüksek işlem tarama sağlarken, küçük hacimli toplu reaksiyonlar benzeyen damlacıklar reaksiyon sonuçları taze reaktifler tedarik zorluk43. Diyaliz bazlı reaktörler taze reaktiflerin piyasaya sürülmesinin yanı sıra bazı reaksiyon ürünlerinin çıkarılmasına izin verir, Ancak, RNA molekülleri ve daha büyük proteinler reaktör içinde birikir, membran gözenekleri ile yaymak için çok büyük olmak. Ayrıca, reaktifler büyük hacimli uzun süre ler için bu reaksiyonları sürdürmek için gereklidir30,44. 2013 yılında, Maerkl ve ark. uzun süreli IVTT reaksiyonları36,45yürütmek için özel olarak tasarlanmış çok katmanlı bir mikroakışkan cihaz sundu. Çok katmanlı mikroakışkan cihazların kullanımı sıvı akışı üzerinde doğrudan kontrol sağlar, akış yeniden yönlendirilmesi yanı sıra cihazın belirli bölgelerinde sıvı izolasyonu için izin46,47. Bu izole bölgeler, IVTT reaksiyonları yapIlebilen bağımsız nanolitre ölçekli reaksiyon odaları olarak işlev görebilir. Tek bir IVTT reaksiyonu boyunca, reaktöre taze reaktiflerin periyodik enjeksiyonları IVTT bileşenlerini ve DNA şablonlarını doldurmak için kullanılır. Aynı anda, eski reaksiyon çözeltisinin eşit hacimli, reaksiyon ürünleri kaldırarak yerinden edilir. Bu şekilde, bazal transkripsiyon ve çeviri oranlarının sabit durumda kaldığı, IVTT reaksiyonlarının ömrünü uzatarak ve zengin dinamik davranışların oluşmasına izin veren bir denge dışı ortam korunur. Araştırmacılar bu yaklaşımı uygulayarak, yeni genetik ağların ileriye mühendislik yardımcı, belirli bir devre içinde meydana gelen bireysel süreçlerin kinetik oranlarını araştırmak mümkün. Örneğin, Niederholtmeyer ve ark. bir genetik halka osilatör çeşitli unsurları karakterize etmek için bu yaklaşımı uyguladı, bunların kinetik oranlarını belirleyen36. Daha ileri çalışmalarda Yelleswarapu ve ark. toplu koşullar altında belirlenen sigma faktörü 28 'in kinetik oranlarının (σ28)σ28tabanlı osilatörün davranışını tanımlamak için yetersiz olduğunu ve akış tabanlı verilerin eklenmesinin ağ davranışı geliştirilmiş model tahminleri22.

Bu makalenin amacı, uzun süreli IVTT reaksiyonları gerçekleştirebilen çok katmanlı mikroakışkan cihazların imalatı için tam bir protokol sunmaktır. Buna ek olarak, bu el yazması uzun süreli IVTT reaksiyonları gerçekleştirmek için gerekli tüm donanım ve yazılım açıklanacaktır. Mikroakışkan cihazın harekete alınması - orada sıvıların akışını kontrol etmek için gerekli - tüp uzunlukları ile mikroakışkan cihazlara doğrudan bağlanmak pnömatik vanalar bir dizi kullanılarak elde edilir. Buna karşılık, pnömatik vanalar özel olarak üretilmiştir sanal kontrol arayüzü üzerinden kontrol edilir. Mikroakışkan cihazların içindeki sıvı akışı, ticari olarak kullanılabilen basınç düzenleme sistemi tarafından sağlanan sürekli basınç kullanılarak elde edilir. IVTT reaksiyonları genellikle 29 °C ile 37 °C arasında gerçekleştirilir ve reaksiyonlar sırasında sıcaklığı düzenlemek için bir mikroskop kuluçka makinesi kullanılır. Ancak IVTT karışımının işlevselliği 4 °C'nin üzerinde depolandığında yavaş yavaş bozulur. Bu nedenle, bu el yazması mikroakışkan cihaziçine enjeksiyondan önce IVTT karışımı soğutmak için kullanılan off-chip soğutma sistemi genişletecektir. Sonuç olarak, bu el yazması, diğer araştırmacıların bu teknolojiyi göreceli olarak kopyalayabilmeleri için mikroakışkan akış reaktörü kullanarak uzun süreli IVTT reaksiyonlarını başarıyla gerçekleştirmek için gereken prosedürlerin kapsamlı bir özetini sunmaktadır. Kolay -lığı.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Gofret hazırlığı

NOT: Protokollerimiz bu araştırma sırasında kullanılan 40 XT pozitif fotodirenç ve SU8 3050 negatif fotodirenç için özeldir. Alternatif fotodirençler kullanılabilir, ancak belirli spin hızları, pişirme sıcaklıkları ve pişirme süreleri değişir. Niederholtmeyer ve ark.36 tarafından sağlanan mikroakışkan cihaz tasarımı Malzeme Tablosu'nabağlıdır.

  1. Önceden ısıtılmış fırına iki temiz silikon gofret (100 mm çapında, <1-0-0> odaklı, 525 m kalınlığında) yerleştirin ve gofretleri bir gecede susuz bırakmaya bırakın (~16 saat).
    NOT: HmDS buhar birikimini kullanarak gofretlerin astarı da mümkündür; ancak gofretler yeterince susuz ise bu gerekli değildir.
  2. Fırından bir silikon gofret çıkarın ve spin kaplama ile devam etmeden önce oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Gofret merkezine 40 XT fotodirenç 3-4 mL uygulayın.
  3. 25 μm bir özellik yüksekliği elde etmek için aşağıdaki spin protokolü uygulayın: 500 rpm (110 rpm/ s) 20 s spin için spin, 3100 rpm (300 rpm / s) için spin hızını artırmak ve 30 s için burada tutun ve 200 rpm / s bir yavaşlama ile 0 rpm gofret yavaşla. mikrofiber doku dikkatle spin kaplama sırasında meydana gelmiş olabilir herhangi bir kenar boncuk kaldırmak.
  4. 70 °C ve 120 °C'ye ayarlanmış iki ayrı sıcak tabak kullanılarak yumuşak pişirilir: gofretin 70 °C'de 30 s'lik bir şekilde oturmasını bekleyin. Daha sonra gofreti 120 °C ocaktaba aktarın ve gofretin 70 °C ocak tablasına başka bir 30 s. Ocaktan gofretini çıkarmasını ve ani sıcaklık şoklarını önleyerek oda sıcaklığına soğumasını beklemeden önce burada 3,5 dakika dinlenmesine izin verin.
  5. Akış katmanı fotomaskesini (emülsiyon tarafı aşağı) fotodirenç filminin üzerine yerleştirin ve toplam 200 mJ/cm2 pozlama elde edilene kadar UV lambası kullanarak gofreti açığa çıkarın.
  6. Pozlama sonrası iki sıcak tabak (70 °C ve 105 °C) kullanılarak pişirilir: gofretin 105 °C ocaktaba aktarıp 40 s'ye burada bırakmadan önce gofretin 70 °C'de 20 s'ye oturmasını bekleyin. Son olarak gofret 70 ° C hotplate için daha fazla 20 s pozlama fırında tamamlamak için geri dönün.
  7. Mikrofiber dokuların bir yığın üzerinde oda sıcaklığına gofret soğumasını bekleyin. Geliştirme sürecini başlatmak için 726 MIF photoresist geliştiricisi ile dolu bir Petri kabına aktararak gofret geliştirin. Geliştirme bir benchtop shaker üzerinde yapıldığında hızlandırılır ve tüm gofret geliştirici batırılır.
  8. Gofretini demineralize suyla durulayın ve fotobuna dayanıklı kalıntılar için gofret yüzeyini kontrol etmek için stereo mikroskop kullanın. Fotobuna dayanıklı kalıntı görülebiliyorsa, gofretgeliştiriciye iade edin.
  9. Gofret'i 110 °C'de 25 dk.'ya yerleştirerek pozitif fotodirençyeniden akış. Bu işlem, yuvarlatılmış özelliklerin yanı sıra üretim işlemi sırasında ortaya çıkmış olabilecek çatlakları tavlamayla sonuçlanır. Adım 1.17'de açıklandığı gibi gofreti silanize etmeye devam edin.
  10. İkinci silikon gofreti fırından çıkarın ve spin kaplamaya geçmeden önce oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Gofret merkezine 5 mL SU8 3050 fotodirenç uygulayın.
  11. 30 μm bir özellik yüksekliği elde etmek için aşağıdaki spin protokolü uygulayın: 500 rpm (110 rpm/ s) 20 s spin için spin, 4.000 rpm (330 rpm / s) için spin hızını artırmak ve 42 s için burada tutun ve 200 rpm / s bir yavaşlama ile 0 rpm gofret yavaşla. mikrofiber doku dikkatle spin kaplama sırasında meydana gelmiş olabilir herhangi bir kenar boncuk kaldırmak.
  12. Aşağıdaki şekilde iki ayrı sıcak tabak (65 °C ve 95 °C) kullanılarak yumuşak fırında pişirin: gofret 65 °C'de 30 s.'de oturun. Daha sonra gofretin 95 °C'lik ocaktaba aktarın ve gofretin 65 °C'lik ocak tabağına başka bir 30 s. geri dönmeden önce burada 14 dakika dinlenmesine izin verin.
  13. Maruz kalmadan önce UV lambasının yoğunluğunu ölçün ve toplam 260 mJ/cm2pozlama dozajı elde etmek için gereken maruz kalma süresini belirlemek için bunu kullanın. Fotomaskeyi (emülsiyon tarafını aşağıya) fotodirenç filminin üzerine yerleştirin ve gofret'i UV ışık kaynağının altına yerleştirin. Toplam 260 mJ/cm2 pozlama elde edilene kadar bir UV lambası kullanarak gofret açığa.
  14. Pozlama sonrası fırında iki sıcak tabak (65 °C ve 95 °C) kullanılarak aşağıdaki şekilde pişirilir: gofretin 95 °C ocaktaba aktarılması ve 4,5 dakika boyunca burada bırakmadan önce gofretin 65 °C'de 65 °C'de oturmasını bekleyin. pozlama sonrası fırında tamamlamak için.
  15. Mikrofiber dokuların bir yığın üzerinde oda sıcaklığına gofret soğumasını bekleyin. Geliştirme sürecini başlatmak için mrDev-600 photodeveloper ile dolu bir Petri kabına aktararak gofret geliştirin. Geliştirme bir benchtop shaker üzerinde yapıldığında hızlandırılır ve tüm gofret geliştirici batırılır.
  16. Gofret'i isopropanol ile durulayın ve fotobuna dayanıklı kalıntılar için gofret yüzeyini kontrol etmek için stereo mikroskop kullanın. Fotobuna dayanıklı kalıntı görülebiliyorsa, gofretgeliştiriciye iade edin. Tamamen geliştirildikten sonra, 1 50 °C'de 1 saat boyunca gofret koyarak fotodirenç pişirin.
  17. Yumuşak litografi işlemleri sırasında PDMS yapışmasını önlemek için her iki gofret silanize. Silanization gerçekleştirmek için, pipet 2-3 damlacıkları (gofret başına) küçük bir cam şişe içine silane. Bir kurutucu içine gofret ile birlikte bu şişe yerleştirin ve 5-10 dakika vakum çekin.
    DİkKAT: Silane zehirlidir ve solunmamalıdır. Bir duman başlık çalışmak ve silane ele zaman nitril eldiven giymek dikkat edin. Bu desiccator vakum çekerken duman kaputunda vakum pompası yerleştirerek içerir.
  18. Vakumu kurutucudan çıkarın ve silanize gofretleri çıkarın. Su ile durulayın ve gofret kurutmak için N2 buhar kullanın. Bu noktada gofretler gerekli olana kadar depoya yerleştirilebilir.

2. Mikroakışkan cihaz imalatı

NOT: PDMS tabanlı çok katmanlı mikroakışkan cihazların imalatında kullanılan yumuşak litografi işlemi üç ayrı adıma ayrılabilir: 1) Hem akış hem de kontrol katmanlarının PDMS hazırlanması, 2) İki PDMS katmanının hizalanması ve bağlanması, 3) cihazın tamamlanması.

  1. PDMS hazırlama
    1. Taban ve kür ajanlarını plastik bir kabın içinde birleştirerek ve iki bileşeni tamamen karıştırana kadar karıştırmak için bir karıştırma çubuğu kullanarak iki PDMS öncül çözüm hazırlayın. Kontrol katmanı 20 g baz ajan ve 1 g kür leme maddesi (20:1 oranı) gerektirir. Akış tabakası 40 g baz ajan ve 8 g kür leme maddesi (5:1 oranı) gerektirir. Degas bir desiccator çözümleri.
    2. Bir Petri kabına akış tabakası gofret yerleştirin ve gofret üzerine 5:1 oran PDMS karışımı dökün. Hava kabarcıklarını temizlemek için 30 dk için PDMS degas.
    3. Spin kat kontrol katmanı gofret (negatif SU8 3050photoresist kullanılarak hazırlanan) 20:1 oranı PDMS ile. Gofret merkezine PDMS 5-10 mL dökün ve aşağıdaki spin protokolü çalıştırın (daha sonra kullanmak için PDMS üzerinde sol tutun): 15 s (100rpm / s) için 500 rpm spin, 45 s için 1450 rpm (300 rpm / s) spin hızını artırmak , ve sonra 0 rpm (200 rpm / s) gofret yavaşlayın.
    4. Homojen bir PDMS film kalınlığı sağlamak için, PDMS kaplı gofreti kapalı bir Petri kabında düz bir yüzeye yerleştirin (toz kontaminasyonunu önlemek için). Gofret 30 dakika otursın.
    5. Akış tabakasını kurutucudan çıkarın ve hem akış ve kontrol katmanlarını bir fırına (80 °C) yerleştirin. 28-30 dakika için her iki katmanı tedavi edin ve PDMS biraz yapışkan kalırken, işlemek için yeterince şekillendirilebilir olduğunda kaldırın. Hemen hizalama işlemine devam edin.
  2. Hizalama ve yapıştırma
    1. Neşter kullanarak, akış katmanı gofret üzerindeki PDMS'den dört aygıtın her birini çıkarın. PDMS tabakasını silikon gofretten çıkardıktan sonra, toz partiküllerinin kirlenmesini önlemek için özellik tarafını hemen scotch bantla kapatın.
    2. Kontrol katmanındaki akış katmanı bloklarını kabaca göz tarafından hizalayarak cihazın özellik tarafını kontrol katmanı PDMS ile temasa getirin. Daha sonra, akış katmanı bloklarının her birinin konumunda ince ayarlamalar yapın ve akış katmanının kanallarını denetim katmanı kanallarıyla hizalayın ve ayarlamaların görselleştirilmesine yardımcı olacak bir stereo mikroskop kullanarak.
    3. İki PDMS katmanı arasındaki hava ceplerini kaldırmak için basınç uygulayın. Daha önce kaydedilen kalan 20:1 oranı PDMS'yi hizalanmış akış katmanı bloklarının etrafına dökün. Yapıştırma işlemi sırasında yeterli teması sağlamak için cihazların her birine 100 g ağırlık yerleştirin.
    4. Hizalanmış cihazları (ağırlıklar dahil) 80 °C fırına geri verin ve en az 1,5 saat ve en fazla 6 saat boyunca bağda bırakın.
  3. Cihazı Bitirme
    1. Gofret çıkarın ve kontrol katmanı gofret her cihazların her ayıklayın, scotch bant ile her cihazın özelliği yan kapsayan.
    2. Yinelemeli olarak, 9 akış katmanı girişlerinin her biri için tek bir delik, 24 kontrol katmanı kanal girişleri ve her aygıtın tek akış katmanı çıkışı için tek bir delik. Özellik tarafı yukarı bakacak şekilde, özellik sınırları içinde delikler indiğinden emin olmak için bir kamera kullanarak cihazı delin.
    3. Her cihaz için, tek bir mikroskop slaytını isopropanol ve aseton ile temizleyin ve slaytları N2akışı altında kurulayın. Daha sonra, mikroskop slaytlarını 15 dakika boyunca 150 °C'ye ayarlanmış bir sıcak tabağa yerleştirin.
    4. PDMS cihazlarını cam kaydıralara bağlamak için oksijen plazma küllemesini kullanın, 45 s için 50 W'lık bir külleme gücü uygulayın. Tamamlandıktan sonra, cihaz özelliğini cam kaydırağa yerleştirin ve yüzeyler arasında sıkışmış gazı çıkarmak için basınç uygulayın.
    5. 1 saat için 110 °C'ye ayarlanmış bir sıcak tabağa bağlanmış cihazları yerleştirin.

3. Donanım kurulumu

NOT: Mikroakışkan yongalar üzerinde kontrol sağlamak için, çok sayıda donanım parçasının takılması ve birbiriyle bağlanması gerekir. Üç ayrı donanım grubu gereklidir: 1) Kontrol kanalları için pnömatik kontrol sistemi, 2) Cihaz içindeki reaksiyon reaktiflerinin akışını kontrol eden pnömatik basınç regülatörü ve 3) IVTT reaksiyon çözeltisini soğutmak için bir soğutma sistemi mikroakışkan cihaza enjeksiyon. Donanım kurulumuna genel bir bakış Şekil 1'deverilmiştir. Burada sağlanan protokollerin mümkün olduğunca genel olmaya çalıştığı unutulmamalıdır, ancak araştırmamız boyunca kullanılan belirli belirli ekipman parçalarına atıfta bulunulmaktadır. Tüm donanımlar, aynı işlevi gerçekleştirebilecek alternatiflerle değiştirilebilir. Bu gibi durumlarda, buradaki protokoller, sistemi ayarlamak için gereken genel adımları ve bileşenlerin her birinin gereksinimlerini anahat olarak kullanılabilir. Alternatif donanım kurulumları Brower ve ark.48 ve Beyaz ve Sokaklar49tarafından sunulmaktadır.

  1. Pnömatik kontrol sistemi (bkz. Şekil 2)
    1. Üreticilerin protokolünü kullanarak, fieldbus denetleyicisi ile kullanıcı iş istasyonu arasında bir TCP bağlantısı kurun. Kontrol örneÄ ine TCP baÄ lantısı yoluyla gönderileÅ en MODBUS komutlarını oluşturmak ve solenoid valfleri harekete getirmek için kontrol yazılımını (ek dosya olarak saÄ lanmıÅ) kullanım.
    2. Kullanılan her solenoid valf için bir adet olmak üzere sekiz adet 4 kanallı dijital çıkış modülü yle fieldbus denetleyicisini genişletin. Her solenoid valf bir bağlantı pimi üzerinde başkanlık eder. Pozitif kabloyu dijital çıkış modüllerinden birinde dört pozitif çıkıştan birine bağlarken negatif kabloyu dijital çıkış modüllerinin yer bağlantı noktalarından birine bağlayın.
      NOT: Sistemin doğru çalışması için, solenoidler sistematik olarak bağlanmalı, ilk solenoid ilk çıkış portuna, ikinci solenoid ikinci çıkış portuna ve benzeri bağlı olmalıdır. Sistemimizde sırasıyla 8 ve 22 solenoid valf ile iki valf dizisi kullanılmaktadır. Çıkış portları 1-8 8-valf dizisine, çıkış portları 9-30 ise 22-valf dizilisine bağlanır.
    3. 1/4" boru kullanarak her iki valf dizisini de basınçlı hava kaynağına bağlayın. 22 valf dizisinin basıncını 3 bar'a, 8 valf dizisini 1 bar'a ayarlamak için basınç regülatörlerini kullanın.
  2. Akış basıncı düzenlemesi (bkz. Şekil 3)
    NOT: Mikroakışkan cihazın akış tabakasından akış sıvıları akışı için, ticari olarak kullanılabilen 4 portlu basınç regülatörü kullanılır. Her bağlantı noktasının çıkış basıncı, basınç denetleyicisi ile sağlanan yazılım lar aracılığıyla düzenlenir. Sağlanan USB konektörünü kullanarak basınç regülatörünü bilgisayara bağlayın.
    1. Basınç regülatörünü basınçlı hava kaynağına bağlayarak, verilen basıncın regülatör tarafından izin verilen maksimum basıncı aşmamasını sağlar.
    2. Bir erkek Luer'i basınç regülatörünün dört dişi Luer kilidi çıkış bağlantı noktasının her birine 3/32"lik barb konektörüne bağlayın. Yumuşak boru uzunluğunu (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) barb'a bağlayın.
    3. Yumuşak borunun açık ucuna 3/32"lik barb konektörüne ikinci bir erkek Luer bağlayın ve bunu sıvı rezervuar konektör bağlantı noktalarına takın.
    4. Akış regülatörünün her çıkışının istenilen basıncını ayarlamak için sağlanan yazılımı kullanın, reaktiflerin mikroakışkan cihaza akmasına neden olacak şekilde rezervuarlarda depolanan reaktiflere basınç uygulayın. Rezervuarların mikroakışkan cihaza bağlantısı bölüm 4.2'de ele alınacaktır.
  3. Off-Chip soğutma kurulumu (Bkz. Şekil 4)
    1. Su soğutma sistemini sıkıştırma bağlantı parçaları kullanarak soğuk plakalı su bloğuna bağlamak için PVC boru (OD: 10 mm, ID: 6 mm) kullanın. Su soğutma sisteminin akışkan haznesini bir soğutucu ile doldurun ve mahsur kalan havayı yerinden etmek için üniteyi yavaşça yatırın ve dolu kalmasını sağlamak için rezervuara sürekli soğutucu ekleyin. Tüm gaz sistemden çıkarıldığında, rezervuarı maksimum hacminin yaklaşık %90-95'ine doldurun.
    2. Coil PTFE boru (OD: 0.042", ID: 0.022") Peltier elemanının soğuk yüzüne ve bant ile güvenli. PTFE borunun bir ucunun akış katmanı basınç kontrol sisteminin rezervuarlarına bağlı olduğundan emin olun (bölüm 4.3'te açıklandığı gibi). PTFE borunun diğer ucu Peltier yüzeyinden en fazla 1 cm çıkıntı olmamalıdır. PTFE borunun çıkıntılı ucuna 5 -10 cm uzunluğunda PEEK boru (OD: 0,794 mm, ID: 0,127 mm) yerleştirin. Tüpün doldurulması ve mikroakışkan cihaza bağlantısı bölüm 4.3'te açıklanmıştır.
    3. Peltier elementinin sıcak yüzünü su bloğunun soğuk plakasına yerleştirin ve iki yüze yeterli termal bileşiği uygulayın. Boru, Peltier elemanı ve soğutma bloğunun her zaman birbiriyle doğrudan temas halinde olduğundan emin olun.
    4. Peltier elemanını sıcaklık kontrol örüne (seri veri günü konektörü aracılığıyla) bağlayın, peltier'e verilen voltaj düzenlenebilir. Çıkışı sıcaklık kontrol ünitesine bağlayan Peltier yüzeyine güvenli bir şekilde bir termistör yerleştirin. Su soğutucusu açtıktan sonra, peltier'e verilen gerilimi sıcaklık 4 °C'de sabit olana kadar uyarlayın.
      NOT: Bu kurulumla Peltier sıcaklığı verilen gerilimi uyarlayarak manuel olarak kontrol edilirken, termistör sadece sıcaklığı izlemek için hizmet vermektedir.

4. Deney hazırlama

NOT: Bir deneye başlamadan önce mikroakışkan cihaz hazırlanmalı ve reaksiyon reaktifleri cihaza enjeksiyon için doğru boruya yerleştirilmelidir. Bu bölümde: 1) Kontrol kanalı borularının cihaza bağlantısı, 2) Soğutulmamış giriş reaktiflerinin cihaza bağlantısı ve 3) Soğutulmuş giriş reaktiflerinin cihaza bağlantısı.

  1. Kontrol kanalı borusu bağlama
    1. Mikroakışkan cihazın kontrol kanallarının her biri için bir tüp uzunluğu kesin (OD: 0.06", ID: 0.02"). Bir uçta, 23 G, 1/2" Luer saplama nın pimini takın ve diğer ucuna paslanmaz çelik bağlantı pimi (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) takın.
    2. Luer sapı bir erkek Luer için 3/32 "barb naylon konektör bağlayın. Konektörün dikenini poliüretan boru uzunluğuna takın (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Bu poliüretan boruyu doğrudan solenoid kapakçıklardan birine takın.
    3. Bir şırıngaya 23 G, 1/2" Luer saplama takın ve bunu kısa (3-4 cm) bir boru parçasına takın (OD: 0.06", ID: 0.02"). Bu borunun açık ucunu ultra saf su deposuna yerleştirin ve şırıngayı ultra saf suyla doldurun.
    4. Şekil 5'tegösterildiği gibi mikroakışkan cihazın her kontrol kanalını numaralandırma. Her kanal için (su yla doldurulmayan kontrol kanalları 1'den 3'e kadar) ilgili boruyu bulun (solenoid vanalara bağlı) bulun ve şırıngaya bağlı borunun açık ucuna metal bir pim yerleştirin. Uzunluğun yarısı dolana kadar kontrol kanalı borusu içine su enjekte edin.
    5. Boruyu şırıngadan çıkarın ve paslanmaz çelik konektör pimini mikroakışkan cihazın ilgili deliğine takın. Tüm kontrol kanalları için tekrarlayın.
    6. Tüm solenoid vanaları açmak için kontrol arabirimini kullanın. Bu, kontrol kanalı tüpündeki sıvıya basınç uygulayarak mikroakışkan cihaza zorlayacak ve cihaz içindeki tüm membran bazlı vanaları kapatacaktır. Cihaz içindeki açık ve kapalı membranların bir örneği Şekil 6'daverilmiştir.
  2. Soğutulmamış reaktifleri cihaza bağlama
    1. Soğutulmamış reaktiflerin her biri için, rezervuar çıkışını mikroakışkan cihaz girişlerine bağlamak için bir boru uzunluğunu (OD: 0,06", ID: 0,02") kesin.
    2. Tüpün bir ucunu alın ve bunu rezervuara takın, böylece borunun rezervuarın tabanına ulaşmasını sağlayın. Rezervuar boru çıkışı, hava geçirmez bir conta elde edilecek şekilde sıkılmalıdır. Borunun açık ucuna paslanmaz çelik bağlantı pimi (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) takın.
    3. Küçük (1 mL) şırınganın ucuna 23 G, 1/2" Luer saplama takın. Luer sapına kısa bir tüp uzunluğu (OD: 0,06", ID: 0,02") ekleyin. Boruucunu istenilen reaktif çözeltisine yerleştirerek şırıngayı reaktifle doldurun.
    4. Paslanmaz çelik konektör pimini şırıngaya bağlı poliüretan boruya takın ve boruyu reaktifle doldurun. Küçük reaksiyon hacimleri kullanırken, reaktif rezervuara girmez ve borunun kendisi rezervuar görevi göremez. Şırıngayı kesin ve konektör pimini mikroakışkan cihazın akış katmanı giriş deliklerinden birine takın.
    5. Reaktifleri mikroakışkan cihaza zorlamak için basınç düzenleyici yazılımı kullanarak rezervuarların her birine basınç uygulayın.
  3. Soğutulmuş sıvıların mikroakışkan cihaza bağlanması
    1. Peltier'in yüzey sıcaklığı 4 °C'ye ayarlanmış su soğutucusu ve Peltier elemanının açık olduğundan emin olun. Soğutma kurulumuna mümkün olduğunca yakın mikroakışkan cihaza monte edin ve Peltier ile cihaz girişi arasındaki soğutulmamış hacmi en aza yakınlayın.
    2. PTFE borunun açık ucunu, paslanmaz çelik konektör pimi (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) kullanarak sıvı rezervuarlarından birine (bölüm 4.2'de açıklandığı gibi) bağlı boruya bağlayın.
    3. Küçük bir şırınga (1 mL) bir Luer sapı (23 G, 1/2") ile kısa bir boru uzunluğu (OD: 0,06", ID: 0,02") sonuna bağlı bağlayın. Şırıngayı soğutulmuş reaktifle doldurun (burada, IVTT reaksiyon çözeltisi).
    4. Peek boruyu bağ borusu aracılığıyla şırıngaya bağlayın ve şırıngaya sürekli basınç uygulayın, reaktifi PEEK tüpünden ptfe tüpüne zorlayın. PEEK tüpünün şırıngadan bağlantısını kesin ve doğrudan mikroakışkan cihazın akış kanalı girişlerinden birine takın. Basınç regülatör yazılımı ile basınç uygulandığında soğutulmuş reaktif mikroakışkan cihaza zorlanır.

5. Deney

NOT: Denemeler den önce protokolbölüm 3 ve 4'te ayrıntılı olarak belirtilen tüm donanım ve boru bağlantıları tamamlanmalıdır ve tüm reaktifler cihaza bağlanmalıdır. Deneysel prosedür daha sonra dört ayrı bölüme ayrılabilir: 1) Mikroakışkan cihazın yüklenmesi, 2) Mikroskobun hazırlanması, 3) Cihazın kalibrasyonu ve 4) Deneyin yapılması. Bu araştırma boyunca kullanılan özel sanal kontrol arabirimi (bkz. Şekil 7)Malzemeler listesi üzerinden ek kaynak olarak sağlanır)

  1. Mikroakışkan cihazın yüklenmesi
    1. Mikrositenin tüm kontrol ve akış tabakası borularını mikroskop aşamasına bağlayarak mikroakışkan cihazı yerleştirin ve kuvözdeki tüm açıklıkları kapatın. Kuluçka makinesinin ortam sıcaklığını 29 °C'ye ayarlayın. Soğutma sisteminin açık olduğundan ve deneyi başlatmadan önce 4 °C'ye ayarlandığından emin olun.
    2. Tüm akış ve kontrol kanallarının basınçlı olduğundan emin olun. Kontrol kanallarının basıncını 1 bara 1-3'e ayarlayın ve kontrol kanallarını 3 bar'da 9-29'a bastırın. Reaktifler basınç regülatörü yazılımı kullanılarak sıvı rezervuarlarına uygulanabilmek için 20 ila 100 mbar arasında bir basınç gerektirir.
    3. Reaktiflerden birini kullanarak mikroakışkan cihazdan havayı çıkarın. Cihazın çıkışını kapatın (kontrol kanalı 29'a basın) ve aynı anda kontrol kanallarını 1-3 ve 15-28'i basınçdışı bırakın. Ardından seçili reaktifin cihaza akmasına izin vermek için çoklayıcının kontrol kanallarını seçerek basıncı nı hassasbir şekilde bastırın. Havanın uzaklaştırılmasını izlemek için mikroskobu kullanın.
      NOT: Reaktiflerin cihaza doğru yüklenmemesi veya hava kabarcıklarının kaldırılmadıolması durumunda basınç 350 mbar'a kadar artırılabilir.
    4. Kontrol yazılımındaki Flush işlevini kullanarak tüm reaktiflerin hava yıkmadan doğru akmasını sağlayın. Sıvı akışının izlenmesi, ilk olarak bir florofor yüklenmesi ve ayrı reaktifler tarafından yer değiştirmesinin izlenmesi ile basitleştirilmiş olabilir.
  2. Mikroskobun hazırlanması
    1. Mikroskobu kullanarak, mikroakışkan cihazın içindeki ilgi noktalarını (her reaktörün içindeki tek bir nokta yeterlidir) bulun ve bunların koordinatlarını saklayın. Bu noktalar kalibrasyon ve deneysel süreçler sırasında görüntülenecektir.
      NOT: Kontrol yazılımında yer alan kalibrasyon ve deneysel işlemler sırasında, mikroskobun daha önce depolanan koordinatlarda görüntüleri periyodik olarak yakalaması talimatı verilir. Bunu başarmak için, kontrol yazılımı mikroskop yazılımı ile iletişim kurar ve yeni görüntüler kaydetmesi için onu bilgilendirir. Bu iletişim her mikroskop kurulumuna özgüdür ve bu nedenle bu işlevsellik sağlanan yazılım arabirimi içinde değiştirilmiştir. Sağlanan kendi mikroskop sistemi ile uyumluluk için son kullanıcı tarafından değiştirilebilir bir kukla çalıştırılabilir.
  3. Mikroakışkan cihazın kalibrasyonu
    1. Tek bir giriş adımında her reaktörden çıkan sıvı hacmini (15-17 kontrol kanallarını peristolarak çalıştırarak sağlanan pompa sırası, sırayla gerçekleştirilen 6 MODBUS komutunu içeren) kalibrasyon protokolünü uygulayarak belirleyin yazılım paketinde sağlanır.
    2. Kontrol yazılımı içinde aşağıdaki veri alanlarını ayarlama: Elüsyon Arabellek Kanalı, Florofor Kanalı, Seyreltme Döngüsü Sayısı (varsayılan 10 seyreltme), Giriş Adımı Sayısı (varsayılan 15 adımdır), Karıştırma Döngüleri Sayısı (varsayılan 4 döngüdür) ve Karıştırma Döngüleri arasındaki süre (varsayılan değer 0 saniyedir). Kalibrasyon Deneyi Gerçekleştir'e basarak kalibrasyonu başlatın.
      NOT: Kalibrasyon işlemi sırasında tüm reaktörler florofor ile doldurulur ve görüntüler kaydedilir. Daha sonra, bir eluent reaktörler (giriş adımları belirlenen sayısına göre) içine ölçülür ve böylece florofor yerinden seyreltme bir dizi gerçekleştirilir. Iyice karıştırıldıktan sonra, yeni görüntüler alınır. Bu işlem, seyreltme Döngülerikümesi Sayısı için tekrarlar.
    3. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, kalibrasyon deneyinin analizini tamamlayarak kontrol yazılımı tarafından sunulan adımları izleyin.
      NOT: Analiz, kullanıcılara her seyreltme Döngüsüsırasında kaydedilen floresan düşüşe dayalı olarak her reaktör için Yenileme Oranı sağlayacaktır. Bu değer, ayarlanan Giriş Adımları Sayısı ile yer değiştiren reaktör hacminin fraksiyonunu gösterir. Buna karşılık, bu değer denemeler sırasında belirli bir reaktör hacmini yerinden etmek için kaç giriş adımı gerektiğini belirlemek için kullanılacaktır.
  4. Denemeyi Gerçekleştirme
    1. Sanal kontrol arabirimi içinde istenen deneme için gerekli değerleri ayarlayın. Kritik yenileme fraksiyonu [%] hangi reaktör hacmi deneysel döngüsü başına yerinden belirler ve% 15 ve 40 arasında ayarlanmalıdır.
      NOT: Denemenin başlatılmasından önce denetim arabiriminin hangi alanlarının ayarlanması gerektiğini belirli bir deney protokolü belirler. Bazı küçük kodlama yeni deneyler için kontrol arabirimini uyarlamak için gerekli olacaktır.
    2. Denetim arabirimindeki Denemeyap düğmesine basarak deneysel protokolü başlatın.
      NOT: Değiştirilmemiş, sağlanan yazılım basit bir protein ifadesi başlatır. Reaktörler 1 ve 8 kontrol olarak kullanılırken, reaktörler 2-7 ev özdeş deneyler. Burada reaktör hacminin %75'i IVTT çözeltisinden, %25'i ise ultra saf su veya 2,5 nM lineer DNA çözeltisi dir. Seyreltmeler her 15 dakikada bir meydana gelir ve reaktör hacminin %30'u seyreltme başına yerinden edilir. Görüntüler her seyreltme döngüsünün sonunda kaydedilir.

6. Veri analizi

NOT: Görüntülerin analizi için komut dosyaları sağlanmıştır (bkz. ek dosyalar veya Malzeme Tablosu),'.nd2' dosyalarının incelenmesi için gerekli olan 'bfopen' analiz paketinden yararlanarak (bizim mikroskop kurulumu).

  1. Analiz komut dosyası 'calibrationScript.m' çalıştırın ve bir kez istenilen '.nd2' dosyaseçin istenir. Doğru görüntü yoğunluğunun belirlenebileceği tek bir reaktör görüntüsü gösterilecektir. Mikroakışkan kanalın kenarları açıkça görülebilecek şekilde görüntü yoğunluğunu optimize etmek için kaydırıcıyı kullanın.
  2. Reaktörün bir görüntüsü gösterilecektir. Bu görüntüde, floresan yoğunluğunun belirlenmesi gereken reaktör kanalı nın içinde bir alan seçin.
    NOT: Her reaktörün floresan yoğunluğu, kaydedilen her görüntü için basit bir çizimde görüntülenen sonuçlarla belirlenecek ve sonuçların görselleştirilmesine olanak sağlayacaktır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IVTT deneylerinin iletimi için çok katmanlı mikroakışkan platformun etkinliğini göstermek için, deGFP proteinini ifade etmek için tanımlanan kurulum kullanılmıştır. Deney, gerekli tüm transkripsiyon ve çeviri bileşenlerinden oluşan, reaksiyon yüzeyleri ve DNA şablonları ile desteklenen, ticari olarak sunulan30 IVTT reaksiyon karışımında gerçekleştirildi. Deneyler 29 °C sıcaklıkta yapılmıştır; proteinlerin IVTT ekspresyonu için en uygun olduğu tespit edilen sıcaklık.

Mikroakışkan cihaz dokuz benzersiz girişe sahip, bunlardan dördü bu deney sırasında kullanıldı. İlki ticari olarak elde edilen IVTT reaksiyon karışımını içeriyordu. IVTT reaksiyon karışımı proteinleri başarılı bir şekilde ifade etmek için gereken tüm bileşenleri barındırır, ancak saflaştırılmış GamS mikroakışkan cihaza yüklenmeden önce 1,3 μM'lik son konsantrasyonda reaksiyon karışımına eklenir. GamS proteininin eklenmesi, deneyler icra ederken doğrusal DNA türlerinin bozulmasını en aza indirmeye hizmet eder. En önemlisi, IVTT karışımı politetrafloroetilen (PTFE) tüp içine 4 ° C yüzey sıcaklığı ile bir Peltier eleman üzerine kıvrılmış içine enjekte edildi mikroakışkan cihaz içine enjeksiyon önce çözelti soğutmak için; kullanılmadan önce reaksiyon çözeltisinin bozulmasını önler. Mikro delikli polyether eter keton (PEEK) borusu, Peltier element yüzeyini mikroakışkan cihaza bırakarak PTFE borusu ile bağlantı kurmak için kullanıldı ve IVTT reaksiyon karışımının hacmi soğutulmadı. Cihaza yerleştirilen ikinci çözelti, 10 nM konsantrasyonda ultra saf suda çözünmüş deGFP için doğrusal DNA şablonu kodlaması içeriyordu. Üçüncü çözelti, ultra saf su, deneysel prosedürler sırasında birden fazla amaã§a hizmet etti. Öncelikle, seyreltme başına yerinden hacmi tüm reaktörler için eşit olduğundan emin olmak için ultrasaf su kullanılmıştır, kontrol reaksiyonlarında DNA yerine hareket. Ayrıca, ultrasaf su da cihaz kalibrasyonu sırasında florofor seyreltmek ve reaktifler arasında geçiş yaparken cihazın ölü hacmi floş için kullanılmıştır. Cihaza yerleştirilen son çözüm, ilk cihaz kalibrasyonuna göre gerekli saflaştırılmış FITC-dextran çözeltisi (25 μM) idi. DNA, su ve florofor çözeltileri, protokollerin Bölüm 4.2'si uyarınca mikroakışkan cihazın giriş kanallarından birine yerleştirilebilen tüpe (0.02" ID, 0.06" OD) enjekte edildi. Bu nedenle, bu çözeltiler deneylerin tamamı için 29 °C'de saklandı.

Mikroakışkan cihazın kontrol kanallarının harekete alınması, kontrol kanallarının her birinin ayrı ayrı işletilebildiği özel kontrol yazılımı ile sağlanır. Uzun süreli IVTT reaksiyonlarının yürütülmesi bu manuel işlem le elde edilemez ve kontrol yazılımında yer alan otomatik protokollerin kullanılmasını gerektirir. Deneyler için mikroakışkan bir cihaz hazırlanırken, benzer otomatik protokoller bir dizi yararlı işlemi yürütmek için kullanılabilir: cihazın ölü hacminin yeni bir reaktifle temizlenmesi, halka reaktörü içindeki reaktiflerin karıştırılması ve mevcut çözeltinin eşit hacimli yerinden ederken reaktör içine yeni bir reaktif. Buna ek olarak, iki karmaşık süreç mevcuttur: bir cihaz kalibrasyonu iletimi ve uzun süreli hücre içermeyen protein ekspresyonunun yürütülmesi. Yukarıda belirtilen tüm işlemler, giriş kanalı, giriş hacmi ve karıştırma süresi gibi belirli işlem ayarlarını değiştirmek üzere birden çok parametreyi yapılandırma olanağının yanı sıra ana arabirimden kolayca yürütülebilir.

Mikroakışkan cihaz imalatı sırasında basınç dalgalanmaları ve kusurlar nedeniyle, tek bir enjeksiyon döngüsü sırasında yerinden sıvı hacmi cihazlar arasında değişebilir. Bu nedenle, IVTT deneyleri gerçekleştirmeden önce, enjeksiyon döngüsü başına yerinden edilmiş reaktör hacmi(Yenilenme Fraksiyonu)belirlendi. Bu kalibrasyon, sekiz reaktörün tümünün floresan referans çözeltisi ile doldurulması dır. Bu durumda saflaştırılmış FITC-dextran çözeltisi (25 μM) kullanılmıştır. Daha sonra, reaktörler ultra saf su ile 10 kez seyreltilir. Her reaktör için seyreltme döngüsü başına floresan daki azalma ölçülerek, tek bir enjeksiyon döngüsü sırasında yerinden edilen sıvının hacmi belirlendi. Kontrol yazılımı içinde, bu değer (Yenileme Oranı)IVTT deneme sırasında kullanılmak üzere kaydedildi. En önemlisi, cihaz genelinde akış hızındaki değişimlerin yanı sıra bireysel reaktör hacimlerinde tutarsızlıklar hesaba katmak için, Yenileme Oranı her bir reaktör için belirlenir ve saklanır. Reaktörlerin doldurulma ve seyreltme sırası, kontrol yazılımının bir parçasını oluşturan Kalibrasyon Yap programı kullanılarak otomatik olarak gerçekleştirilmiştir. Kalibrasyon deneyinin sonuçları Şekil 8'degösterilmiştir.

Önceden programlanmış en karmaşık işlem, kullanıcıların denemeyi başlatmasına ve daha sonra tamamlanmasına kadar gözetimsiz çalışmasına izin veren uzun süreli bir IVTT denemesini yürütür. Deney boyunca, 1 ve 5 numaralı reaktörler boşluk olarak kullanıldı ve seyreltmeler sırasında reaktörlere sadece su eklendi. Reaktörler 2 ve 6 negatif kontroller olarak kullanılmıştır ve sadece IVTT reaksiyon çözeltisi ve ultra saf su içeriyordu. Geri kalan reaktörler (3, 4, 7 ve 8) deGFP geni için IVTT reaksiyon çözeltileri ve 2,5 nM lineer DNA kodlaması içeriyordu. Reaktörlerin başlatılması, reaktör hacminin %'i ultra saf su ile yerinden edilmeden önce tüm reaktörlerin (1 ve 5 hariç) IVTT reaksiyon çözeltisi ile tamamen doldurulması yla elde edilir. Daha sonra reaktörlere periyodik reaktif enjeksiyonu başlatıldı. Deney, her 14,7 dakikada bir reaktörlere yeni reaktifler enjekte edildi ve reaktör hacminin 0'u her seyreltme döngüsü sırasında yerinden edildi. Her enjeksiyonun bileşimi enjekte edilen sıvının u'inin taze IVTT çözeltisinden, geri kalan %'inin ise DNA veya ultra saf sudan oluştuğunu gösterdi. Yeni reaktiflerin her enjeksiyonundan sonra reaktörler sürekli olarak karıştırıldı ve daha sonra her reaktörün floresan görüntüsü mikroskop kullanılarak kaydedildi. Reaksiyon daha sonra 68 döngü boyunca sürekli çalışmasına izin verildi ve bu da 16,5 saat lik deneysel bir süreyle sonuçlandı. Bu deneyin sonuçları Şekil 9'daverilmiştir.

Uzun süreli IVTT deneyleri yaparken, bir reaksiyonun başarısız olmasının iki ana nedeni vardır; mikroakışkan cihaza hava girişi veya IVTT reaksiyon çözeltisinin bozulması. Mikroakışkan cihaz içinde hava oluşumu genellikle daha sonra mikroakışkan cihaz içine enjekte edilir giriş çözeltileri, mevcut küçük hava kabarcıkları doğrudan sonucudur. Cihaza girdikten sonra, havanın varlığı uygun sıvı akışını engeller, bu nedenle reaksiyonlar artık periyodik olarak yenilenerek reaktör halkaları içinde toplu reaksiyonların oluşmasına yol açar. Bazı durumlarda, hava yavaş yavaş reaktiflerin tekrarlanan kızarma tarafından cihazdan kaldırılır, sonra reaksiyon beklendiği gibi devam eder (Şekil 9'dagösterildiği gibi). Diğer durumlarda hava kapana kısılmış kalır ve yalnızca deneyi iptal ederek ve daha sonra protokollerin Bölüm 5.1'inde açıklanan dolum işlemine benzer şekilde mikroakışkan cihazın akış tabakasına sürekli (yüksek) basınç uygulanarak kaldırılabilir. Deneylerimiz sırasında hücre lisatı PTFE tüpünde 4 °C'ye soğutulmuş peltier elemanı üzerinde depolanır. Her iki önlem de, tüp ve reaksiyon çözeltisi ile fonksiyonel (biyo)moleküler ilerliyi koruyan soğuk sıcaklıklar arasında sınırlı etkileşim sağlayan inert PTFE tüpü ile, zaman içinde IVTT reaksiyon çözeltisinin bozulmasını sınırlamaya yardımcı olur. IVTT gerçekleştirmek için gerekli bileşen. Reaksiyon çözeltisinin bozulması meydana gelirse - reaksiyon çözeltisi ile depolama ortamı arasındaki yetersiz soğutma veya istenmeyen etkileşimler sonucunda - o zaman bu proteinin kademeli olarak azalması olarak deneysel olarak kendini sergileyecek. zaman içinde ifade. Bozulduktan sonra, IVTT reaksiyon çözeltisi geri kazanılamaz ve yeni bir deney hazırlanmalıdır.

figure-results-1
Şekil 1. Sürekli IVTT reaksiyonları gerçekleştirmek için gereken donanım kurulumu. A)Donanım kurulumu şeması. B) Bu el yazması boyunca kullanılan kurulumun fotoğrafı. Sürekli IVTT reaksiyonları için çok katmanlı bir mikroakışkan cihazın uygulanması, akış basıncını düzenlemek, kontrol kanallarını, ısı ve serin reaksiyonları ve reaktifleri harekete geçirmek, sıvıları depolamak ve cihazı görüntülemek için kapsamlı bir donanım kurulumu gerektirir. Deney. Deneyler 30 °C sıcaklıkta yapılır ve mikroskobu bu sıcaklığa göre ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirerek elde edilir. IVTT reaksiyon çözeltisinin bozulmasını önlemek için, Peltier elementinin soğuk yüzü üzerine sarmal PTFE tüpünde depolanır. Peltier elementinin sıcaklığı 4 °C olarak ayarlanır ve bu sıcaklığı korumak için bir su soğutucusu ve su bloğu kullanılır. Soğutma gerektirmeyen reaktifler mikroskop inkübatörünün dışındaki sıvı rezervuarlarında depolanır. Bu rezervuarlara bilgisayar kontrollü basınç regülatörü ile sabit basınç uygulanır. Bu şekilde, sıvılar mikroakışkan cihazın giriş kanallarına doğrudan bağlanan rezervuarların çıkış borusundan geçirilir. Mikroakışkan cihazın kontrol kanallarının her biri pnömatik bir valağa bağlıdır. Tüm vana dizisi sabit basınç altında. Vananın açılması, pnömatik valfin mikroakışkan cihazın kontrol kanalına bağlanmasını sağlayan boru içindeki sıvının basınçlandırılmasına ve mikroakışkan cihazın içinde bulunan PDMS membranlarının açılmasını ve kapatılmasını sağlar. Pnömatik valfler, belirli pnömatik vanaları açıp kapatmaya fieldbus denetleyicisini (gösterilmez) emreden bir kullanıcı arabirimi aracılığıyla açılır ve kapatılır. Şekil Yelleswarapu ve ark.22uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. Pnömatik valf kurulumu ve kontrol kanalı bağlantısına genel bakış. 8-valf dizisi, 1, 2 ve 3 gibi vanalara takılan üç kontrol kanalı bağlantısıyla gösterilir. Basınçlı hava 1/4" boru ile vana dizisine sağlanabilir. Kontrol kanallarının aktüasyonları için iki basınç kullanılır: düşük basınç kontrol kanalları için 1 çubuk (1, 2 ve 3) ve yüksek basınç kontrol kanalları için 3 çubuk (9 ile 30, burada gösterilmez). Boru ultrasaf su ile doldurulabilir ve paslanmaz çelik konektör pimi kullanılarak kontrol kanalı girişlerinden birine takılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. Ticari akış basınç regülatörü ve rezervuar sistemine genel bakış. Çok katmanlı mikroakışkan cihazın akış tabakasına sıvı enjekte etmek için ticari olarak kullanılabilen bir basınç regülatörü kullanılır. Basınç denetleyicisinin bilgisayara bağlanması, sıvı enjeksiyonlarını gerçekleştirmek için kullanılan basıncın modülasyonuna olanak tanır. Reaktifler, basınç regülatörüne doğrudan bağlanan bir sıvı rezervuarında saklanabilir. Rezervuara basınç uygulanması, sıvıyı çıkış borusu aracılığıyla rezervuardan dışarı yaslar. Bu çıkış borusu, paslanmaz çelik konektör pimi kullanılarak mikroakışkan cihazın sıvı girişlerinden birine doğrudan bağlanabilir. Reaktif hacminin sıvı haznesine ulaşamaması durumunda, çıkış borusu reaktif için bir rezervuar görevi görür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Reaksiyon reaktiflerini soğutmak için kullanılan soğutma sistemine genel bakış. (Sol) İzole soğutma kurulumu ve (Sağ) Soğutma kurulumu mikroskop içine yerleştirilir ve mikroakışkan cihaza bağlanır. Bir Peltier eleman mikroakışkan cihaziçine enjeksiyon dan önce IVTT reaksiyon çözeltisi soğutmak için kullanılır. Reaktif, Peltier elementinin soğuk yüzü üzerine sarılmış PTFE tüpünde saklanır. Soğutmasıvısının mikroakışkan cihaza aktarılması için peek boru uzunluğu kullanılır ve küçük iç çapı (0,005") reaktif hacminin artık soğutulmasını en aza indirir. Kıvrılmış PTFE borunun yanı sıra Peltier elementinin yüzeyinde gerçek zamanlı sıcaklık takibine olanak tanıyan bir termistör yerleştirilir. Peltier'e uygulanan gerilim, Peltier'in yüzey sıcaklığının 0 °C ile 4 °C arasında kalması için ayarlanır. Peltier elementi tarafından üretilen fazla ısıyı gidermek için Peltier'in sıcak yüzü, iki yüz arasında optimum ısı transferi sağlayan silikonsuz ısı emici gres ilavesi ile su soğutmalı bir bloğa yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5. Mikroakışkan cihaz tasarımına genel bakış. Sürekli IVTT reaksiyonları için mikroakışkan akış reaktörü, her biri 10,7 nL hacimli sekiz reaktör halkası oluşur. Dokuz giriş, cihaza dokuz benzersiz reaksiyon çözeltisinin girişine olanak tanır. 24 kontrol kanalı cihaz içindeki sıvı akışını düzenler. Kontrol kanalları 9'dan 14'e kadar bir çoklayıcı oluşturur. Bu kontrol kanalları cihaza sıvı akışını engellemek için her zaman basınçlı olmalıdır. İki kontrol kanalının aynı anda basınçtan arındırılması, tek bir reaktifin girişine olanak sağlar. Kontrol kanalları 15, 16, ve 17 peristaltically kontrollü bir şekilde cihaza reaktifleri pompalamak için kullanılır. Kontrol kanalları 18'den 25'e kadar her biri cihazın içinde bulunan sekiz reaktörden birinin girişini kontrol ediyor. Kontrol kanalı 26, floş kanalını kapatarak reaktörlere sıvı sokabilir. Kontrol kanalı 27, reaktörlerin homojen dolumunda yardımcı olur. Kontrol kanalları 28 ve 29 halka reaktör çıkışları ve sırasıyla tek cihaz çıkışı düzenler. Son olarak, kontrol kanalları 1, 2, ve 3 peristal halka reaktörler içinde sıvı pompalamak için kullanılır, reaktiflerin karıştırma ile sonuçlanan. Bu mikroakışkan cihazın tasarımı ve rakam her ikisi de Neiderholtmeyer ve ark.29uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6. Mikroakışkan cihaz içinde membran bazlı vana. A) Mikroakışkan cihaz içinde akış kanalı. Arka planda iki kontrol kanalı görülebilir. Bu kanallar basınçlı değildir ve bu nedenle vanalar açık (sıvı akıtabilir). B) Akış katmanı kanallarını kesişen iki kontrol kanalı basınçlandırıldı ve vanalar kapatıldı (yani sıvı akışı engellenmiştir). Kontrol kanallarının basınçlandırılması üzerine, akış ve kontrol katmanı kanallarını ayıran ince PDMS membran yukarı doğru saptırılır (kontrol katmanı akış katmanının altında dır) ve akış katmanı kanalını kapatır. Akış katmanı kanalının yuvarlaması, saptırılan membranın akış kanalını tam olarak kapatmasını sağlamak açısından önemlidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7. Mikroakışkan cihazı kontrol etmek için kullanılan kullanıcı arabirimi. Bu araştırma boyunca, mikroakışkan cihazlar daki sıvı akışını kontrol etmek için özel bir kontrol arabirimi kullanılmıştır. Arayüz, kullanıcıların kontrol kanallarının her birini ayrı ayrı çalıştırmalarına (1-3 ve 9-29 numaralı) veya reaktiflerin kızarması ve yüklenmesi, mikroakışkan cihazın kalibrasyonu ve Deney. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8. Kalibrasyon deneyinin sonuçları. Kalibrasyon deneyi sırasında, reaktörler florofor (25 μM FITC-Dextran) ile doldurulur ve ardından floresan yoğunluğu kaydedilir. Daha sonra, bir dizi seyreltme, bir dizi giriş adımları (15) reaktörleriçine ultrasaf su enjekte etmek için kullanılır izleyin. Her seyreltmeden sonra reaktifler karıştırılır ve floresan ölçülür. Seyreltme başına floresan yoğunluğundaki azalma, belirlenen sayıda giriş adımı için yerinden edilen reaktör halkasının hacmini ortaya çıkarır; bir değer Yenileme Oranıdenir. A) Sekiz reaktörün ortalama yoğunluğu ve standart sapması kırmızı renkte gösterilir ve gri renkte bireysel yoğunluk izleri gösterilir. B)Ortalama Yenileme Oranı ve standart sapma kırmızı her seyreltme adımı için gösterilir. Her bir reaktörün bireysel Yenileme Oranları gri renkte gösterilir. Sekiz reaktörden yedisinin çok benzer davranışlar gösterdiği görülebilir, ancak bir reaktör yedinci seyreltme döngüsünden sonra Yenileme Oranında dalgalanmalar gösterir. Bu, reaktörlere reaktif enjeksiyonu için ortalama bir Yenileme Oranı kullanmanın aksine, her bir reaktör için benzersiz Yenileme Oranları na duyulan ihtiyacı vurgular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9. DeGFP proteinini ifade eden ivtt deneyinin sonuçları. Reaktör hacminin 0'u her 14.6 dakikada bir yerinden olacak şekilde uzun süreli bir IVTT reaksiyonu başlatıldı. Reaksiyonun sona erdirilmeden önce 16 saatten fazla çalışmasına izin verildi. Mikroakışkan cihazın iki reaktörü boşluk olarak kullanıldı ve deney boyunca reaktörlerden sadece ultra saf su uçuruldu (reaktörler 1 ve 5). Diğer tüm reaktörler u IVTT reaksiyon çözeltisi ve %'ini ultrasaf su (reaktörler 2 ve 6) veya 2,5 nM lineer DNA şablonlarından oluşuyordu (reaktörler 3, 4, 7 ve 8). DNA'nın eklendiği dört reaktörde de GFP ekspresyonu vardır. Dört reaktörden üçü benzer floresan yoğunluğu sağlarken, bir reaktör daha düşük floresan sinyali sergiliyor. Bu, reaktöre daha az DNA girmesini nsonucunda oluşan akış eşitsizliğinden veya reaktör boyutlarındaki farklılıklardan kaynaklanabilir. 14 saat sonra, DNA içeren reaktörlerin sinyalinde ani bir artış görülür. Bu, muhtemelen giriş çözümlerinden birinden kaynaklanan mikroakışkan cihazın akış katmanına giren bir hava kabarcığı ndan kaynaklanır. Mikroakışkan cihazdaki havanın bindirmesi, hava geçene kadar reaktörlere taze reaktif eklenemez veya çıkarılamaz. Akışın yeniden başlamasıyla, deney önceki floresan yoğunluğuna geri döner. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosyalar. Bu dosyaları indirmek için lütfen buraya tıklayınız. 

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PDMS tabanlı çok katmanlı mikroakışkan bir cihaz sunulmuştur ve IVTT reaksiyonlarını uzun süre devam ettirme yeteneği gösterilmiştir. Bu özel örnek için uygun olsa da, bu teknoloji birçok diğer uygulamalar için kullanılabilir. Sıvı akışı üzerindeki ek kontrol - ürünleri çıkarırken reaksiyon reaktiflerini sürekli olarak yenileme yeteneği ile eşleştirilmiştir - sürekli sentez reaksiyonları, çeşitli dinamik davranışların araştırılması ve eşzamanlı tek bir reaksiyonun birden fazla varyasyonunun iletimi.

PDMS tabanlı cihazların nispeten basit üretim sürecine rağmen, bunların kullanımı kapsamlı bir donanım kurulumu gerektirir. Vana dizileri, basınç regülatörleri, basınç pompaları, kuluçka makineleri ve soğutma ünitelerinden oluşan üretimden kullanıma geçiş temel değildir ve önemli bir ilk yatırım gerektirir. Buna ek olarak, bu aygıtlarla sürekli olarak kurulum ve başarılı denemeler yapabilme yeteneği önemli bir zaman yatırımı gerektirir; bu makalenin ele almayı hedeflediği bir nokta. Ancak, bir kez yerine, tüm kurulum çeşitli amaçlar için değiştirilebilir. Ayrıca, donanım kurulumu çok sayıda modüler elemandan oluşur ve bunların her biri daha karmaşık mikroakışkan cihaz tasarımlarının kullanılabilir hale getirilebilmesi için genişletilebilir. Ayrıca, modüler tasarım benzer işleyen alternatifler tarafından donanım bileşenlerinin değiştirilmesine olanak sağlar, kullanıcıların burada açıklanan belirli kurulum ile sınırlı değildir gibi48,49.

Tek tek aygıtlar arasında ve dış koşullardaki değişkenlik (basınç dalgalanmaları gibi) bu aygıtları kullanırken denemeler yaparken yanlışlıklara neden olabilir. Bu sorunu gidermek için, her denemeden önce sistemin kalibrasyonu yapılmalı dır ve bu da reaktörlerin her biri için benzersiz bir Yenileme Oranı sağlamaktadır. Kalibrasyon cihazdan cihaza ve deneyden deneye varyasyonları ele alırken, bu zaman alıcı bir süreçtir ve kusursuz değildir. Farklı viskozitelere sahip sıvılar aynı basınca maruz kaldığında aynı oranda akmaz ve bu nedenle birden fazla reaktifle kalibrasyon un gerçekleştirilmesi aynı Yenileme Oranlarınıvermeyebilir. Bu etki, reaktifleri peristolarak mikroakışkan cihaza pompalamak için üç kontrol kanalı kullanılarak zayıflatılır, ancak verilen basıncı değiştirerek akışı düzenlemenin aksine. Viskozitede eşitsizliğinin çok büyük olduğu durumlarda son çare olarak, birden fazla kalibrasyon deneyi gerçekleştirerek her bir reaktif için benzersiz bir Yenileme Oranı uygulanabilir.

Mikroakışkan cihaza reaktifler enjekte etmek için peristaltik bir pompa kullanımı, farklı viskozitelere sahip çözümler kullanmanın etkilerini zayıflatır, ancak aynı zamanda ikincil bir sorun oluşturur. Mikroakışkan cihaza sıvı pompalamak için ayrı adımlar kullanılması, enjeksiyonların tek bir reaktöre çözündeğin, tek bir pompa çevrimi gerçekleştirirken enjekte edilen hacimle sınırlı olduğu anlamına gelir. Araştırmamızda kalibrasyon sırasında belirlenen bu değer yaklaşık %1'e eşittir ve bu da tek bir pompa döngüsünün reaktör hacminin yaklaşık %1'ini (yaklaşık 0,1 nL) yerinden ettiğini gösterir. Bu nedenle, reaktör hacminin %30'unun yerinden edilmesi için 30 pompa çevriminin uygulanması gerekirken, IVTT reaksiyon çözeltisinin 23 pompa döngüsü ekleniyor ve sadece 7 pompa çevrimi DNA veya ultra saf su ekleniyor. Araştırmamız için yeterli olsa da, alternatif deneysel protokoller daha fazla sayıda benzersiz reaktif eklemeye çalışırken, daha düşük bir Yenileme Fraksiyonukullanmaya veya bir reaktöre tek bir reaktifin daha küçük hacimlerini eklemeye çalışırken sorunlarla karşılaşabilir. Bu gibi durumlarda, mikroakışkan cihaz tasarımı reaktörlere daha büyük hacim sağlamak için uyarlanabilir. Böyle bir örnek Niederholtmeyer ve ark36bildirilir.

En önemlisi, bu makalenin içinde özetlenen cihaz, tepkilerin uzun süre ler boyunca sürdürülmesini ve sabit durum transkripsiyon ve çeviri oranlarıyla sonuçlanmasına olanak tanır. Reaktörlere periyodik olarak yeni reaktifler enjekte edilerek - ve reaksiyonu (by) ürünleri kaldırarak - reaksiyonlar sürdürülür ve karmaşık dinamik davranışlar izlenebilir. Bu şekilde, bir platform oluşturuldu - bir dereceye kadar - hücresel ortamı taklit eder. Ayrıca, bu platform enjeksiyonlar arasındaki dönemi ve enjeksiyonların özel bileşimini uyarlayarak sistem dinamiğinin araştırılmasını sağlar. Sonuç olarak, bu çok katmanlı mikroakışkan cihazlar, karmaşık dinamik davranışlar sergileyen yeni sentetik ağların karakterizasyonu ve optimizasyonu için güçlü bir araçtır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nün (NWO, 723.016.003) NWO-VIDI hibesi olan Avrupa Araştırma Konseyi ERC (proje n. 677313 BioCircuit) tarafından desteklenmiştir. programları, 024.001.035 & 024.003.013), İnsan Sınır Bilim Programı Hibe RGP0032/2015, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı Grant 723106 altında Avrupa Araştırma Konseyi ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibe 200021_182019.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler< / güçlü >
AsetonVWR20063.365
AZ 40 XTMerck KGaA (Darmstadt, Almanya)-Pozitif Fotorezist
AZ 726 MIF GeliştiriciMerck KGaA (Darmstadt, Almanya)-Geliştirici Pozitif Fotorezist
İzopropanolMerck KGaA (Darmstadt, Almanya)109634
Mikroskop slaytlarıVWRECN 631-1550
mr Dev 600Microresist Technology GmbH (Berlin, Almanya)-Geliştirici Negatif Fotorezist
Silikonsuz Isı Emici GresDevresi İşleriCW7270Termal Bileşik
Silikon gofretlerSilikon Malzemeler-< 1-0-0> yönlendirme, 100 mm çap, 525 & m kalınlığı
SU-8 3050Microchem Corp. (Newton, MA)-Negatif Fotorezist
Sylgard 184 Elastomer Kiti (PDMS)Dow Chemical Company01317318
trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silanSigma-Aldrich448931-10G
< güçlü > Adı< / güçlü >< güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü >Katalog SayıComments
Equipment
4 kanal dijital giriş/çıkış modülüWAGO Kontakttechnik GmbH750-5048x
Kamera lensiGörüntülemeKaynağı-Sıkıştırma
bağlantısıKoolance, Inc.FIT-V06X106 mm İç Çap ve 10 mm Dış Çap ile borular için bağlantı parçası. 4x
Denetleyici uç modülüWAGO Kontakttechnik GmbH750-600
Cihaz bağlantı borusuSaint-Gobain Performance PlasticsAAD041030.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Cihaz bağlantı pimleriUnimed SA (Lozan, İsviçre)200.010-AAISI 304 boru, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Kontrol CihazıWAGO Kontakttechnik GmbH750-881
Dişi veri yolu konektörüEncitechDTCK15-DBS-K15 kutuplu dişi veri yolu konektörü
Sıvı rezervuarlarıFluigentFluiwell-4C
Akıcı basınç sistemiFluigentMFCS-EZ0 - 345 mbar
Hg kısa ark lambasıAdvanced Radiation Corporation- 350W
Sıcak plakaTorrey Pines ScientificHP61
Ters mikroskopNikon InstrumentsEclipse Ti-E
LabVIEW Softwarede Greef Lab, Eindhoven Teknoloji Üniversitesihttps://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Sıvı soğutucuKoolance, Inc.LIQ-705CL-B
Luer taslaklarıInstech Laboratories, Inc.LS23
Erkek Luer - dikenli konektörlerCole Parmer45505-323/32 "ID
Matlab Yazılımıde Greef Lab, Eindhoven Teknoloji Üniversitesihttps://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Mikro KameraGörüntüleme KaynağıDMK 42AUC03
Mikroskop kameraHamamatsu FotonikOrcaFlash4.0 V2 ( C11440-22CU)
Orbital çalkalayıcıCole ParmerEW-513000-05
FırınThermo ScientificHeraeus T6P 50045757
Oksijen plazma asherQuorum TechnologiesK1050X
PDMS zımbaSYNEOAccu-Pucnh MP10
PEEK boruTrajan1301005001-5F0.005" ID, 1/32" OD, Kırmızı
Peltier elemanıAvrupa TermodinamiğiAPH-127-10-25-S
Peltier sıcaklık kontrolörüWarner InstrumentsCL-100
Fotoğraf MaskesiCAD/Sanat Hizmetleri A.Ş.-
Fotoğraf maskesi tasarımıMaerkl Lab, EPFLhttps://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pnömatik valf dizisiFESTO-1x22 valf dizisi ve 1x 8 valf dizisi, Normalde kapalı valfler.
Güç adaptörüKoolance, Inc.ADT-EX004S110/220V AC Güç Adaptörü
PTFE boruCole Parmer06417-21# 24 AWG İnce Duvar PTFE
Delme pimiSYNEOCR0320245N21R4OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC BoruKoolance, Inc.HOS-06CL6 mm İç Çap, 10 mm Dış Çap
Tek kenarlı bıçaklarGEMScientific-Soft
boruAkışkan-Sıvırezervuarları ile birlikte verilir. (1 mm İç Çap, 3 mm Dış Çap)
Spin kaplayıcıLaurell Technologies CorporationWS-650MZ-23NPPB
Stereo mikroskopOlympus CorporationSZ61
Termistör kablosuWarner InstrumentsTA-29Boncuk termistörlü
kablo UV maruz kalma sistemiABM, ABD-YakınUV Maruz Kalma Sistemi, 350W
Vakum pompasıVacuumbrand GmbHMD1C
Su soğutmalı soğuk plaka bloğuKoolance, Inc.PLT-UN40F
Su soğutucuKoolance, Inc.EX2-755
Tartı terazileriSartoriusM-kanıtlamak

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Roekel, H. W. H., et al. Programmable chemical reaction networks: emulating regulatory functions in living cells using a bottom-up approach. Chemical Society Reviews. 44, 7465-7483 (2015).
  2. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. , (2017).
  3. Del Vecchio, D., Sontag, E. D. Dynamics and control of synthetic bio-molecular networks. Proceedings of the American Control Conference. , 1577-1588 (2007).
  4. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 410-422 (2009).
  5. Padirac, A., Fujii, T., Rondelez, Y. Bottom-up construction of in vitro switchable memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3212-E3220 (2012).
  6. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. 439, 856-860 (2006).
  7. Genot, A. J., Fujii, T., Rondelez, Y. In vitro regulatory models for systems biology. Biotechnology Advances. 31, 789-796 (2013).
  8. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403, 335-338 (2000).
  9. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  10. Montagne, K., Plasson, R., Sakai, Y., Fujii, T., Rondelez, Y. Programming an in vitro DNA oscillator using a molecular networking strategy. Molecular Systems Biology. 7, 466-466 (2014).
  11. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nature Reviews Genetics. 11, 367-379 (2010).
  12. Hockenberry, A. J., Jewett, M. C. Synthetic in vitro circuits. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 253-259 (2012).
  13. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33, 111-119 (2015).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology - identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnology Journal. 7, 856-866 (2012).
  15. Venturelli, O. S., et al. Programming mRNA decay to modulate synthetic circuit resource allocation. Nature Communications. 8, 1-11 (2017).
  16. Scott, M., Mateescu, E. M., Zhang, Z., Hwa, T. Interdependence of cell growth and gene expression: origins and consequences. Science. 330, 1099-1103 (2010).
  17. Borkowski, O., Ceroni, F., Stan, G. B., Ellis, T. Overloaded and stressed: whole-cell considerations for bacterial synthetic biology. Current Opinion in Microbiology. 33, 123-130 (2016).
  18. Liao, C., Blanchard, A. E., Lu, T. An integrative circuit-host modelling framework for predicting synthetic gene network behaviours. Nature Microbiology. , (2017).
  19. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).
  20. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, 751-755 (2001).
  21. Oberholzer, T., Nierhaus, K. H., Luisi, P. L. Protein expression in liposomes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 261, 238-241 (1999).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synthetic Biology. 7, (2018).
  23. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic Acids Research. 40, 3763-3774 (2012).
  24. Dunlop, M. J., et al. Distinct timescales of RNA regulators enable the construction of a genetic pulse generator. Biotechnology and Bioengineering. , (2019).
  25. Yoshiyama, T., Ichii, T., Yomo, T., Ichihashi, N. Automated in vitro evolution of a translation-coupled RNA replication system in a droplet flow reactor. Scientific Reports. 8, 1-8 (2018).
  26. Iyer, S., Karig, D. K., Norred, S. E., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Multi-input regulation and logic with T7 promoters in cells and cell-free systems. PLoS ONE. 8, 1-12 (2013).
  27. de los Santos, E. L. C., Meyerowitz, J. T., Mayo, S. L., Murray, R. M. Engineering Transcriptional Regulator Effector Specificity Using Computational Design and In vitro Rapid Prototyping: Developing a Vanillin Sensor. ACS Synthetic Biology. 5, 287-295 (2016).
  28. Guo, S., Murray, R. M. Construct functional feedforward loop biological circuits in a cell-free system and in cells. ACS Synthetic Biology. , (2019).
  29. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2017).
  30. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: A platform for cell-free synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5, 344-355 (2016).
  31. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  32. Lee, J. W., et al. Creating single-copy genetic circuits. Molecular Cell. 63, 329-336 (2016).
  33. Gibson, D. G., et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a mycoplasma genitalium genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
  34. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3, 387-397 (2014).
  35. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16, 269-281 (2016).
  36. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15985-15990 (2013).
  37. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242, 1162-1164 (1988).
  38. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  39. Timm, A. C., Shankles, P. G., Foster, C. M., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Toward microfluidic reactors for cell-free protein synthesis at the point-of-care. Small. 12, 810-817 (2016).
  40. Doktycz, M. J., Foster, C. M., Retterer, S. T., Timm, A. C., Shankles, P. G. Characterization of extended channel bioreactors for continuous-flow protein production. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 33, 06FM02(2015).
  41. Khnouf, R., Beebe, D. J., Fan, Z. H. Cell-free protein expression in a microchannel array with passive pumping. Lab on a chip. 9, 56-61 (2009).
  42. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab on a Chip. 11, 3523-3529 (2011).
  43. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16, 2168-2187 (2016).
  44. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synthetic Biology. 1, 29-41 (2012).
  45. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, 1-18 (2015).
  46. Galas, J., Haghiri-Gosnet, A. -M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab on a Chip. 13, 415-423 (2013).
  47. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2004).
  48. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  49. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroak kan Ak Reakt rUzat lm IVTT Reaksiyonlarok Katmanl Mikroak kan CihazSentetik Gen A larIn Vitro Transkripsiyon TranslasyonGFP Ekspresyon AnaliziSo utma Sistemi KurulumuBas n D zenleme KontrolS v Hacmi Kalibrasyonu

İlgili makaleler