Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Bu protokolde, biz 384 içinde tümör küreler nesil için prosedür anahat-iyi bir fizyolojik temsili mikroortamda anti-kanser terapileri yüksek verimlilik taraması için izin damlacıkları asılı. Biz hasta türetilmiş kanser kök hücre kürleri oluşumunu, yanı sıra, ilaç tedavisi sonrasında ayrıntılı analiz için bu kürlerin manipülasyon özetlemektedir. Özellikle, biz küroid morfoloji, proliferasyon, viability, ilaç toksisitesi, hücre fenotipi ve hücre yerelleştirme veri koleksiyonunu tarif. Bu protokol, 384-iyi asılı bırakma platformu kullanılarak kolayca uygulanan analiz tekniklerine odaklanarak yüksek verimlilik sağlayan ilaç taraması için idealdir. Biz yumurtalık kanser çalışmaları ve kanser kök hücre araştırma bu modelin önemini vurgulamak iken, 384-Well platformu diğer kanser türleri ve hastalık modelleri araştırma için, birçok alana platformun yarar uzanan imkan sağlar. Kişisel ilaç taramasının hızını ve kolayca uygulanan fizyolojik temsili 3D kültürlerle tarama sonuçlarının kalitesini geliştirerek, bu platform yeni terapötik ve hasta spesifik gelişimine yardımcı olmak için tahmin edilmektedir tedavi stratejileri ve böylece geniş kapsamlı klinik etkiye sahiptir.
Giriş
Dünya çapındaki kanserle ilgili mortalite, 20181' de 9.800.000 ölümlere ulaştı ve gelişmiş terapinin gelişmesine ihtiyacı vurgulandı. Ne yazık ki, kanser ilaçların geliştirilmesi maliyeti artmaktadır, tek bir ilacın gelişimi ile yaklaşık 650.000.000 USD2 yeni anti-kanser ilaçları geliştirmek için gelişmiş stratejiler ihtiyacını gösteren. Kanser kök hücreleri (CSCs), artan kemoresistans ile karakterize edilir3, kendini yenilemek için kapasite, ve yeni tümörler tohum yeteneği4 tümör nüks sorumlu olduğu düşünülmektedir4, metasür5....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hasta örnekleri, tümör debulking ve asit koleksiyonundan sonra numuneler de tanımlanmakta olan, onaylayan hastalarından onaylanmış bir ıRB Protokolü altında toplanır.
1.384 yılında küçük hücre numaralarından küreler üretimi-iyi asılı damla plakaları
- Asılı damla plakasını steril deiyonize (dı) suyla dolu bir sonicator içine yerleştirin ve 20 dakika boyunca sonikat yapın.
- Eldivenli bir el ile, plakayı sonicator 'dan çıkarın ve dı suyu çalıştıran ile yıkayın.
- Plaka bir banyoda oturmak izin 0,1% Pluronik asit için 24 h için protein adsorpsiyon ve kuyular küroid uyumu önlemek için.
- Plakalı bir el ile p....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hücre hatları veya hasta türevi CSCs ile oluşturulan küreler, asılı damlacıklar içinde bir dizi küçük hücre numarası ile oluşturulabilir (Şekil 2a). Küreler, nadir görülen hasta örneklerinin korunması için izin veren en az 10 hücre ile güvenilir bir şekilde oluşturur. Bu kürlerin içindeki hücreler, fizyolojik hücre hücresi kontakları ve difüzyon oranlarına izin vererek 3 boyutta diğer hücrelerle çevrilidir. Kürlerin içindeki tümör hücreleri, kürlerin zaman içinde boyuttaki genişleymesine ned.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
3D küroid oluşumu için 384-iyi asılı damla plaka platformu herhangi bir hücre biyoloji veya kanser biyoloji Labs için kolayca uygulanan bir araçtır. Bu fizyolojik platform, fiziksel olarak ilgili 3D kültürler içinde hücre hatları, yanı sıra, primer hasta örnekleri çalışma sağlar yüksek verim ilaç taraması için izin verirken. Platform ayrıca kültür koşullarının son derece ayarlanabilir olmasını sağlar, kaplama yoğunlukları üzerinde sıkı kontrol sağlayan, hücre Co-kültür oranları, ekstrsellüler bileşenleri, ve orta kompozi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma öncelikle DOD OCRP erken kariyer araştırmacı Ödülü W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD pilot Ödülü W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD araştırmacı başlattı Ödülü W81XWH-17-OCRP-ıIRA (GM), Rivkin merkezi Ovarian kanser ve Michigan Ovarian kanser için desteklenmektedir Ittifak. Bu yayında rapor edilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından ödül numarası P30CA046592 altında destekleniyordu. CMN, 1256260 No 'lu Grant altında Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu tarafından desteklenmektedir. MEB, Ulusal Ihtiyaç (GAANN) bursu alanlarında eğitim bölümü lisansüstü yardımı tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.25 tripsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serolojik pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10.000 cSt Si yağı | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Histogel gibi doku işleme jellerinin kalıptan çıkarılmasını kolaylaştırmak için sferoid dizi kalıbını kaplamak için kullanılır. |
| 100 mm doku kültürü kabı | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 mL konik tüp | Celltreat | FL4021 | |
| Gibco | 11965-092 | için 1x | |
| DMEM Serumsuz Orta için 1x F12 | Gibco | 11765-054 | |
| 1x fosfat tamponlu salin (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 ve mikro; m filtre | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6 kuyulu plaka | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Yenilikçi Hücre Teknolojileri A.Ş. | 1449 | Proteolitik ve kollajenolitik enzimlerden oluşan nazik bir hücre ayrılma enzimi. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin boyası, resazurini yüksek oranda floresan olan resorufin'e indirgeme yeteneklerine dayalı olarak hücrelerin canlılığını ve çoğalmasını ölçmek için kullanılır. |
| ALDEFLUOR tahlil kiti | Kök Hücre Teknolojisi | 1700 | Kiti, kanser kök hücrelerinin bir göstergesi olan yüksek seviyelerde aldehit dehidrojenaz eksprese eden kök ve progenitör hücreleri tanımlamak için. Kit, ALDEFLUOR Reaktifi, DEAB, Hidroklorik Asit, Dimetilsülfoksit ve ALDEFLUOR Test Tamponundan oluşur. |
| ALDEFLUOR Dietilaminobenzaldehit (DEAB) | Kök Hücre Teknolojisi | 1705 | Dietilaminobenzaldehit (DEAB), spesifik olmayan ALDH boyamasını belirlemek için kullanılan bir ALDH izozim inhibitörüdür. |
| Andor iXon x3 CCD Kamera | Oxford | Instruments-Antibiyotikler | |
| ve Antimikotikler | Gibco | 15240-062 | |
| APC-izotip IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | IgG2b antikorlarının spesifik olmayan boyanmasını ölçmek için izotip kontrolü. |
| B27 Takviyesi | Gibco | 17504044 | |
| temel Fibroblast Büyüme Faktörü | Kök Hücre Teknolojileri | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 İnsülin Şırıngaları | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Mikroplaka Okuyucu | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Bir kanser kök hücre belirteci olan CD133'ü hedefleyen floresan antikor. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | DNA'yı bozan bir alkilleyici ajan olarak işlev gören platin bazlı kemoterapi ajanı. |
| DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür) | İnvitrojen | D1306 | |
| Epidermal Büyüme Faktörü | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Çekirdek Hücre Görüntüleme Sistemi | Yaşam Teknolojileri | AME3300 | |
| Fetal Sığır Serumu - premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Lekelenme üzerine numunenin etrafındaki renk bozulmasını önlerken, numuneye nüfuz edebilen ve jel içinde tutabilen doku işleme jeli. |
| İnsan Yağ Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler | Lonza | PT-5006 | |
| İnsan Mikrovasküler Endotel Hücreleri | Lonza | CC2543 | |
| İnsülin-Transferrin-Selenyum Takviyesi | Gibco | 51500-056 | |
| Canlı / Ölü canlılık kiti | (kalsein-) ve ölü hücrelerin (Ethidium Homodimer-1) floresan bazlı tespiti için | Invitrogen | L3224 |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Yazılımı | Moleküler | Cihazlar-Olympus | |
| IX81 Ters Konfokal Mikroskop | Olympus-Olympus | ||
| IX83 Araştırma Ters Mikroskop | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Gaz değişimine izin verirken asılı damla plakalarında damlacık buharlaşmasını sınırlamaya yarayan termoplastik polimer şeritler. |
| Perfecta 3D 384 Kuyu Asılı Damla Plakaları | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin, sabit hücrelerde F-aktini floresan olarak etiketlemek için kullanılan bir peptittir. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D | Sistemleri-3D | yazıcı |
| Steril DI su | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo boyası, canlı hücrelerin hasarlı zarından geçme kabiliyetine dayanarak canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için kullanılır, ancak canlı hücrelerin sağlam zarından geçmez. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems-3D | baskı için biyouyumlu bir polimer malzeme. | |
| Yokogawa CSU-X1 Konfokal Tarayıcı Ünitesi | yokogawa | - |
Kaynaklar
- All cancers Source: Globocan. , Globocan. http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/39-All-cancers-fact-sheet.pdf (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
