Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

8.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59720

⸱

11 Temmuz 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Bu makalede

Özet

Drosophila melanogaster'da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.

Özet

Nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı ve ilerlemesi hakkında anlaşılması gereken çok şey vardır, temel alınan genler de dahil olmak üzere sorumlu. Kimyasal mutajenler kullanarak ileri genetik tarama Drosophila ve insanlarla uyumlu hücresel yollar paylaşan diğer model organizmalar arasında genler için mutant fenotipleri haritalama için yararlı bir stratejidir. Eğer ilgi mutasyona uğramış gen sineklerin erken gelişimsel aşamalarında ölümcül değilse, bir tırmanma tahlil düşük tırmanma oranları gibi, azalmış beyin işleyişi fenotipik göstergeleri için ekrana yapılabilir. Daha sonra, beyin dokusunun ikincil histolojik analizi, nörodejenerasyon phenoypes skorlayarak genin nörokoruyucu fonksiyonunu doğrulamak için gerçekleştirilebilir. Gen haritalama stratejileri, bu aynı testlere dayanan meiyotik ve eksiklik eşlemesinin, faiz geninde olası nükritit değişikliklerini belirlemek için DNA sıralamasına göre izlenmesini içerir.

Giriş

Nöronlar en çok post-mitotik ve bölünmüş1,2aciz içindir. Çoğu hayvanlarda, nörokoruyucu mekanizmalar bu hücrelerin organizmanın ömrü boyunca korunması için var, özellikle de nöronların hasarlara karşı en savunmasız olduğu yaşlarındadır. Bu mekanizmaların temelindeki genler, nörodejenerasyon gösteren mutantlar, nörokoruma kaybı için fenotipi bir gösterge, ileri genetik protokol kullanılarak tespit edilebilir. İleri genetik ekranlar etil methanesulfonate (EMS) veya n-etil-N-nitrosourea (ENU) gibi kimyasal mutajenler kullanarak, özellikle onlar neden rastgele nokta mutasyonlar nedeniyle yararlıdır, ışık döken bir doğal tarafsız yaklaşım sonuçlanan Ökaryotik model organizmalarda sayısız gen fonksiyonları3,4,5 (aksine, X-Ray Mutagenezi DNA molası yaratır ve can noktası mutasyonları yerine yeniden düzenlemeye neden olabilir6).

Ortak meyve sinek Drosophila melanogaster bu ekranlar için ideal bir konu yüksek kalite, iyi detaylandırılmış genom dizisi nedeniyle, son derece gelişmiş genetik araçları ile bir model organizma olarak uzun geçmişi, ve en önemlisi, onun paylaşılan insanlarla evrimsel Tarih7,8. Bu protokolün uygulanabilirliğini kısıtlayan bir faktör, mutasyona uğramış genlerin neden olduğu erken sakatlık olup,9yaşına kadar test edilmesini önleyecek. Ancak, ölümcül olmayan mutasyonlar için, negatif geoteksen yararlanır bir tırmanma tahlil, basit, ancak kapsamlı, ölçüm özürlü motor işlevi10fonksiyon. Yeterli lokomotor reaktivite sergilemek için, sinekler yönü belirlemek için nöral işlevlere bağlıdır, konumunu duygusu, ve hareketi koordine. Uyaranlara yanıt olarak yeterince tırmanmaya uçar yetersizlik bu nedenle nörolojik kusurları gösterebilir11. Belirli bir arızalı tırmanış fenotipi belirlendikten sonra, beyin dokusunun histolojik analizi gibi ikincil bir ekran kullanarak daha fazla test, tırmanma kusurlu sineklerin nörodejenerasyonu belirlemek için kullanılabilir. Sonraki Gen haritalaması daha sonra, kusurlu nörokoruyucu geni taşıyan kromozom üzerindeki genomik bölgeyi ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Kromozomal bölgeyi daraltmak için, kromozom üzerinde bilinen konumlar ile baskın Marker genler taşıyan mutant sinek hatları kullanarak Mayoz bölünmenin haritalama yapılabilir. Marker genler, iki loci arasındaki yeniden kombinasyon sıklığı olarak mutasyon için bir referans noktası olarak hizmet bir geni yaklaşık konumunu eşlemek için kullanılabilecek bir ölçülebilir mesafe sağlar. Son olarak, mutasyon eşleştirilen kromozomal bölgede dengeli eksiklikleri taşıyan satırlarla mutant hatlarının kesişmesi, bilinen fenotipi5' i ifade ederse, faiz geni doğrulanabilir bir uluslara testi oluşturur. Tanımlanan gen, muhtemelen değiştirilmiş bir amino asit dizileri ile sonuçlanan polimorfik nüklotit dizileri, geni sıralayarak ve Drosophila genom dizisiyle karşılaştırarak değerlendirilebilir. İlgi geni sonraki karakterizasyonu ek mutant alleles test içerebilir, mutasyon kurtarma deneyleri ve ek fenotiplerin incelenmesi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hazırlama ve sineklerin yaşlanma

  1. Elde veya oluşturmak6 genetik ekran Için kullanılacak Drosophila mutantlar koleksiyonu. Burada, trk-mutagenized çizgiler ikinci kromozom eşlenen ve CYO üzerinde dengeli kullanılır.
  2. 25 °C ' de, 12 saat ışık/karanlık döngüsünde Mısır yemeği-pekmez orta olarak ayarlanan bir kuluçte deneysel genotip hatları güçlendirin.
  3. Her deneysel genotipten yetişkin eclosion 0-2 gün arasında 20 homozigot Döl etrafında toplayın. Sürekli ya erkek ya da kadın uçar toplayarak seks önyargı ortadan kaldırın.
  4. Yaş gibi taze gıda üzerinde sinekler korumak için her 2-3 gün şişeleri saygısız, 29 °C ' de istenen olarak Mısır yemeği-pekmez Orta üzerinde sinekler yaş. Burada sunulan ekranda, sinekler 10-12 gün boyunca yaşlanmış.
  5. Daha önce10açıklandığı gibi iki şişe ve bant kullanarak bir tırmanma assay test odası birleştirin. Şişeleri her iki açık uçları bağlı olmalıdır. Odanın bir ucunda 5 cm 'lik bir çizgiyi işaretlemek için cetvel kullanın.

2. protokol 1: tırmanma tahlili (ali ve ark.10' dan uyarlanmış)

  1. Tırmanma tahlil doğrula. Bu çalışmada, ElavC155> UAS-TauR406W (alt tırmanma Pass oranlarının sergilendiği) ve ELAVC155> UAS-Gfp ' i kullanarak daha önce açıklanan metodolojisi ali ve al.10' a göre tırmanma testini test edin ( kontrol) ve ElavC155> UAS-MCherry (kontrol) uçar.
  2. Bir test odasına sinekleri çevirin, bir defada bir satır (CO2 anestezi kullanmayın) ve onları 5 dakika kurtarmak için izin. Test farklı günlerde yapılır, günün aynı zamanda tahlil gerçekleştirin. Bu çalışmada,12. lokomotif üzerindeki sirkadiyen etkileri kontrol etmek için öğleden sonra tüm tırmanma çalışmaları yapıldı.
    Not: Test ederken doğrudan güneş ışığından uçar açığa kaçının; Bu, tırmanmaya yeteneği ile müdahale edecektir.
  3. Zorla Oda (işaretlenmiş yan aşağı) bir fare Pad üzerine bir katı yüzeye yerleştirilen dokunun 3 kez tüm sinekler alt tahlil başlar. Sinek lokomotini 10 s. ' lık bir dönemde gözlemlemek.
  4. Bu süre içinde 5 cm çizgisinin yanı sıra, test edilen sineklerin toplam sayısına ulaşan veya geçilecek sineklerin sayısını kaydedin. Her deneme arasında 1 dakika bekleyen, satır başına en az 3 deneme çoğaltır için protokol yineleyin.
    Not: Bu çalışmada, her şişe arasında bulunan 2 ve 19 ilk tarama için uçar (erkek sinekler) ve arasında 6 ve 21 arasındaki kadın hatları mutant eksikliği analizi için uçar (Bölüm 5,3.).

3. protokol 2: daha fazla analiz için Drosophila suşları seçimi

  1. Microsoft Excel veya benzer yazılım tırmanma tahlil verileri girin ve tüm çoğaltır üzerinde her satır için tırmanma Pass oranı hesaplamak bir yüzde olarak.
  2. R yazılım paketi13' ü kullanarak tüm satırların ortalama tırmanma yüzdesi değerinden önemli ölçüde sapma gösteren mutant çizgilerini algılamak için istatistiksel analiz gerçekleştirin.
    1. R (. csv veya. txt dosyaları her değişken veya faktör için bir sütun ve belirli değerleri temsil eden satırlar) için küratörlü veri dosyalarında okuyun.
      Not: Burada, erkekler için veri (ilk tahlil) ve kadın (hat 867 eksikliği hatları geçti) ayrı. xlsx sayfalara iki sütun olarak girilen, bir burada sütunun satırları mutant çizgi ve kaç kez tahlil çoğaltıldı ve diğer nerede satır tanımlamak sinek her çoğaltmak şişe için Ortalama tırmanma başarı (yüzde olarak) temsil eder.
    2. Aşağıdaki kodu kullanarak R içine verileri okuyun:
      mali <-Read. csv (".. /male_init.csv ")
      femdef <-Read. csv (".. /fem_def_cross.csv ")
      Not: Yol dizinlerindeki "..", kullanıcının bilgisayarının kök dizininden mutlak yollardır ve bilgisayarın dizin yolları için bireysel kullanıcı tarafından belirtilmesi gerekir.
    3. Doğrusal modelleme gerçekleştirin
      1. R içinde LM işlevi ile kukla değişken regresyon gerçekleştirin. Mutant hatlarının ilk analizi için, sıfır ortalama merkezli yanıt değişkeni (yüzde başarı) için büyük ortalama karşı başarı tırmanma yüzdesi faktörü düzeyi etkileri (mutant hatları) önemini değerlendirmek.
        Not: "-1" Bölüm 3.2.3.2 LM işlev çağrısı sonunda. kesişim kaldırır ve bize yüzde tırmanma Pass oranı sıfır ortalama merkezli ortalama karşı tüm faktör düzeylerini test etmek için izin verir.
      2. R Özet işlevini kullanarak sonuçları ekrana yazdırın:
        mali_anova <-lm (ölçek (mali $ P_Success) ~ mali $ Mutant_line-1)
        Özet (mali_anova)
      3. Aşağıdaki R kodunu kullanarak karşı faktör düzeyi efektlerini test etmek için temel olarak denetim çizgilerini (varsa) kullanın: x <-ilgilel (femdef $ Mutant_line, ref = "a867_plus")
        femdef_anova <-lm (femdef $ P_success ~ x)
        Özet (femdef_anova)
        Not: Negatif denetim satırı, tüm diğer faktör düzeylerinin (mutant çizgileri) LM işlevindeki yerleşik ttestleriyle karşı test edildiği temel kesme noktası haline gelmesi için, kodun ilk satırı faktör düzeylerini yeniden sıralar.
  3. Test sırasında yaşına bağlı olarak aday çizgiler için bir eşik seçin. Eşik belirlemek için, vahşi türe kıyasla nörodejenerasyon ve düşük tırmanma geçiş oranlarını gösteren bilinen mutantları kullanarak istenilen yaşta bir ön test gerçekleştirin, kontrol uçar10.
    Not: Daha önce Drosophila hatları sinir sisteminde insan nörodejenerasyon ile Ilgili gen Tau aşırı ifade için bildirilen gibi% 50 altında bir geçen oran 10 gün-eski uçar için uygun olabilir10. Daha büyük sinekler daha yüksek bir geçiş oranı eşik olmalıdır çünkü onlar azalmış lokomotif sergiler bekleniyor, böylece, artmış nörodejenerasyon.

4. protokol 3: Histoloji Analizi

  1. Eldiven giyen, tırmanma tahlil sonrasında bir cerrahi bıçak ile sinek başları sever ve yavaşça onları yerleştirmek için bir fırça kullanın 1 Carnoy 's fiksatif mL (6:3:1 100% EtOH: kloroform: buzul asetik asit) içinde bir 1,5 mL mikro santrifüjli tüp O/N 4 °C. Başlarının fixatif çözelti içinde lavabo emin olun.
  2. Aşağıdaki gün 1 ml 70% EtOH ile fiksatif solüsyonu değiştirin ve örnekleri gelecekteki analizler için 4 °c ' de sürdürün.
    Not: Protokol bu adımda duraklatıldı.
  3. 4,2 adımda kafaları yerleştirin. mikrobiyopsi kaseti başına en fazla beş. Hemen 70% EtOH ile dolu bir kap içine kasetleri yerleştirin. Konteyner işleme ve parafin kafaları gömme için bir Histoloji tesisi göndermeden önce 4 °C ' de saklayın. Doku işleme ve katıştırma için ekipman varsa, adım 4,4 izleyin.
  4. Mikrotome bölümleme için parafin kafaları Embed:
    1. Tablo 1 ' de sunulan sırada otomatik bir doku işleme makinesinin program ayarlarını takip edin, susuz bırakmak, açık ve parafin kafaları ile sızmak.
    2. Numuneleri, parafin tarafından 60 °C ' de ısıtılan parafin gömme istasyonunu kullanarak kasete uygun metal taban kalıplara aktarın.
    3. Baş (Antero-posterior oryantasyon üst karşı karşıya) temel kalıp ince forseps kullanarak beyin dokusu doğru görselleştirme kesmeyi takiben izin vermek için. Bu, 60 °C ' de parafin yeniden ısıtılması ve gerekirse kafaları yeniden konumlandırarak yapılabilir.
      Not: Metal kalıplar tek kullanımlık taban kalıpları ile değiştirilebilir.
    4. Kaseti ilgili taban kalıbının üstüne yerleştirin ve bunları parafin gömme istasyonunun (4 °C) soğutulmuş tarafına hafifçe taşıyın. Blok önce istasyondan çıkarmadan sertleşir kadar bekleyin.
    5. Bloğun kalıbını hafifçe kasetten ayırarak kalıbı çıkarın.
  5. Her parafin bloğunu kesecek yüzeyi en aza indirmek için önce seksiyonlama kesme.
  6. Mikrotom her bloğun 5 μm bölümlerini kesecek şekilde ayarlayın.
  7. En fazla 5 dakika boyunca ısıtılmış su banyosuna (35 °C) doku içeren kesitli parafin şeridini yerleştirin.
  8. Bir poli-lizin kaplı slayt (doku korumak için yardımcı olur) ısıtılmış su banyosunda, şeritli şerit ahşap Aplikatörler kullanarak slayda yerleştirerek bırakın. Slaytlar hava oda sıcaklığında O/N kuru edelim.
  9. Slayt ısıtıcıyı kullanarak 63 °C ' de 15 dakika boyunca slaytları ısıtın.
  10. Slaytları bir slayt boyama rafına yerleştirin ve aşağıdaki adımlara saygı göstererek, bir duman kaputu altında hematoksimetlin ve eozin (H & E) ile lekelenin.
    1. Beş dakika için (numuneden parafin kaldırmak için yardımcı Xylene, toksik olmayan değiştirme) Histochoice içinde raf yerleştirin.
    2. Rafı Histochoice ile dolu bir konteynerin 5 dakika boyunca aktarın.
    3. Raf, 100% EtOH 1 ile dolu bir konteynerin 5 dakika boyunca aktarın.
    4. % 100 EtOH 2 ile dolu bir konteynır içinde rafa transfer 5 dakika.
    5. 3 dakika boyunca% 95 EtOH ile dolu bir konteynır içinde rafa aktarın.
    6. 3 dakika boyunca% 70 EtOH ile dolu bir konteynır içinde rafa aktarın.
    7. Raf, distile H2O ile dolu bir konteynerin 5 dakika boyunca aktarın.
    8. 2-5 dk için Harris hematoxylin ile dolu bir konteynırın içinde rafa aktarın.
    9. Hematoxylin çözeltisi dışarı raf almak ve 10 dakika boyunca musluk suyu çalışan altında yerleştirin.
    10. Kısa dunk yaparak damıtılmış su ile dolu bir konteyner içinde raf aktarın.
    11. 1-2 dk için eozin ile dolu bir konteynır içinde rafa aktarın.
    12. Kısa dunk yaparak% 95 EtOH ile dolu bir konteynerin rafa aktarın.
    13. 5 dakika boyunca% 95 EtOH ile dolu bir konteynır içinde rafa aktarın.
    14. 5 dakika boyunca% 100 EtOH ile dolu bir konteynır içinde rafa aktarın.
    15. 5 dakika boyunca% 100 EtOH ile dolu bir konteynır içinde rafa aktarın.
    16. Tüm slaytlar monte edilinceye kadar 5-10 dk için Histochoice (veya Xylene) ile dolu bir konteynerin rafa aktarın.
    17. Slayt ve lamel magazini (24 mm x 60 mm boyutunda) monte edin. Forseps kullanarak, Histochoice veya ksilon çözeltisinin slaytı çıkarın ve bunun üstüne montaj orta ince bir şerit olun. Hafifçe üst lamel magazini yerleştirin, kabarcıklar oluşumunu önlemek için çalışıyor.
    18. Çözümden önce monte edilmiş Slaytlar üzerindeki montaj ortamını, O/N 'nin altında duman kaputu altında bırakın.
    19. Oda sıcaklığında bir kutuda lekelenmiş slaytlar saklayın.
  11. Işık mikroskobu altında 20 x büyütme sırasında slayttaki tüm seri bölümlere bakarak nörodejenerasyonu ölçün. Tüm beyin inceleyin, boyut ve üç ardışık bölümlerde görünen vakitlerin sayısı niteliksel notu alarak.
  12. Görüntüleme yazılımı ile donatılmış bir ışık mikroskop kullanarak yaklaşık orta beyin temsili beyin bölümleri görüntüleri elde.

5. protokol 4: recessive Mmutant Phenotype gen haritalama

  1. Bir vahşi tip Cantons (BL_ 9517) veya başka bir vahşi tip veya isogenized gerilme (örneğin, oregonr (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) veya YW (BL_ 6599) için aday hattı outcross fenotip baskın olup olmadığını belirlemek için veya Resesif.
    Not:     bu adımın sonuçları, eşlemenin sonraki adımlarına yol gösterecektir. Fenotip resesif ise, eksikliği haritalama gerçekleştirilebilir.
    1. Bir boya fırçası kullanarak, bir gıda içeren şişe CO2-anestezize ilgi mutant hattı (5 erkek) ve cantons hattı (10-15 bakire kadın) sinekler yerleştirerek bir haç yapmak. Şişeyi 25 °C ' de yerleştirin.
    2. Heterozigot F1 Döl toplamak ve tekrar tırmanma ve histoloji deneyler.
    3. Elde edilen sonuçları tek başına ve homozigot mutantlar için kontrol hattına karşılaştırın. Heterozigot mutantlar vahşi tip sinekler olarak benzer fenotürleri sergiler Eğer resessif fenotip iyi bir belirti olacaktır.
  2. WGSP-1 J1 L2 pin1/CYO (BL_3227) veya bilinen ilgili dominant işaretçileri ile eşdeğer bir gerinim kullanarak ikinci kromozom üzerindeki mutasyonun yerini kabaca tahmin etmek için Mayoz bölünmenin haritalama gerçekleştirin sitolojik konum. Bu durumda, mutasyon daha önce ikinci kromozom üzerinde yer olduğu bilinmektedir.
    1. Bir boya fırçası kullanarak, bir gıda içeren şişe CO2-anestezize ilgi mutant hattı (5 erkek) ve WGSP-1 J1 L2 pin1/CYO hattı (10 kadın) sinekler yerleştirerek bir haç olun. Şişeyi 25 °C ' de yerleştirin.
      Not: Bu haç amacı, yeni mutasyon ile kromozom taşıyan heterozigot kadın oluşturmak için ve marker kromozom, hangi mayoz sırasında yeniden birleştirecek6,14. Kadın F1 erkek yerine yeniden kombinasyon erkeklerde oluşmaz beri erkeksi seçilir.
    2. Yeni mutasyon ve marker kromozom ile kromozom taşıyan en az 15 bakire dişi gençleştirin ve onları 5 erkeğe başka bir görünür baskın Marker (örn. CYO/SNASCO (BL_2555) veya eşdeğer).
    3. Adım 5.2.2 ' de, SCO veya CYO ve potansiyel olarak yeniden birleştirilmiş kromozom taşıyan heterozigot erkek Döl toplayın. ve bireysel olarak mutasyona uğramış kromozom taşıyan stok gelen bakire kadın onları Mate.
    4. Adım 5.2.3 açıklanan son haç gelen Döl toplayın. ve 29 °C ' de uçar (Bu çalışmada 10-14 gün boyunca sinekler yaşlanmış).
    5. Başlıklar toplayın, protokol 3 ' te açıklandığı gibi Histoloji analizini gerçekleştirin ve 4,11 adımda açıklandığı gibi nöropati derecesini belirlemek için beyin bölümleri olan slaytlara bakın. Histoloji analizi, kanatları15' te sıvı birikimine neden olan sıkışan (J)gibi tırmanma tahlili etkileyebilecek fenotürleri nedeniyle lokomotif Analizi yerine gerçekleştirilir.
  3. Tırmanma tahlili kullanılarak resessif mutasyonun yerini iyileştirmek için kromozom daralmış bölgede eksikliği haritalama gerçekleştirin. Her eksiklik çizgisi, kromozomların farklı bölgelerinin silinmesine sahiptir ve bunların tamamlayıcı testler için kullanılmasını sağlar.
    1. Daha sonra daha küçük eksiklikleri kullanımı ile daraltılmış olabilir Mayoz bölünmenin haritalama, tanımlanan bölge yayılma büyük eksiklikleri ile başlayın. Eksiklik Analizi birden fazla aday geni ile sonuçlanır, RNA girişim (RNAi) stoklarının kullanımı onları hedef tavsiye edilir.
    2. Drosophila eksikliği kiti16 çapraz çizgiler ikinci kromozom IÇIN (Bu çalışmada DK2L) ve ilgi fenotipi (Bu çalışmada: tırmanma Pass oranı% 8,5 tırmanışı geçiş hızına karşılık gelir pozitif kontrol olarak kullanılan hat 867 homozigot uçar).
    3. Histoloji doğrulamasını kullanarak nörodejenerasyon fenotip Bölüm 4 (protokol 3) açıklandığı gibi onaylayın.

6. protokol 5: DNA sıralaması ve Analizi

Not: ENU Mutagenezi noktası mutasyonları11tanıttı unutmayın.

  1. Tasarım ileri ve ters primer dizileri,, (hat 867 durumda 3.247 BP boyutu bir DNA parçası olarak amplifikasyon için, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tarafından amplifikasyonu için brat geni eXoN kodlama bölgesi çevrelendirme sıralaması17).
  2. Tek bir sinek18 DNA ayıklamak:
    1. 50 μL squishing Buffer (10 mm Tris-CL pH 8,2, 1 mm EDTA, 25 mm NaCl ve 200 μg/ml proteinase K) içeren 0,5 ml 'lik mikro santrifüjli tüpte uçta yavaşça ezmek; bir P100 veya P200 pipet ucu kullanarak enzim dondurulmuş bir stoktan önce taze seyreltilmiş olmalıdır.
    2. 37 °C ' de 30 dakika boyunca inkübe
    3. Tüpünü 95 °C ' ye yerleştirerek proteinaz K 'yi 2 dakika boyunca devre dışı bırakın.
      Not: Çıkarılan DNA, birkaç ay boyunca 4 °C ' de depolanabilir.
  3. PCR reaksiyonu yüksek sadakat DNA 'Sı kullanarak gerçekleştirin polimeraz (Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve Termal Bisiklet koşulları sırasıyla Tablo 2 ve Tablo 3' te gösterilir) üreticinin talimatlarına saygı ve PCR ürününü 1 etidium bromür toksik olmayan bir alternatiftir invitrogen sybr güvenli DNA jel leke içeren% agaroz jel.
  4. Bir neşter ile jel doğru boyutta bant tüketim ve üretici talimatlarına saygı ile, sihirbaz SV jel ve PCR temizleme sistemi (Promega) veya eşdeğer kiti kullanarak PCR ürün arındırmak.
  5. Mümkünse, ilgi tüm bölgeyi kapsayacak şekilde DNA sıralaması için kullanılacak ileri ve ters astar tasarımı. Nokta mutasyonları tanımlamak için önceki adımda jel-saflaştırılmış DNA sırasını. Otomatik floresan Sanger sıralamanın yüksek doğruluğu 700 BP 'ye kadar elde edilebilir.
    Not: EX Taq polimeraz (TaKaRa), 20 KB 'ye kadar genomik DNA şablonlarından PCR ürünlerini yükseltmek için kullanılabilir.
  6. A Plasmid Editor (ApE, M. Wayne Davis tarafından) veya benzer yazılım kullanarak elde edilen DNA dizileri onları hizalayarak ve bir referans gerinim aynı genomik bölgenin sıralamasını takiben elde edilen dizileri karşılaştırarak analiz (örneğin, aslen mutagenized hattı).
    1. ApE ile açık sıralama dosyaları. Referans olarak, Flybase bir FASTA formatında indirilen brat geni genomik görüş sırası Içeren bir ApE dosyası kullanın, ya da genetik arka plan kontrolü dizisi için sonuçlar içeren bir dosya (örneğin, aslen mutagenized Drosophila hattı).
    2. Araçlar'a gidin ve sıraları Hizala. Bilgisayarın fareyi kullanarak karşılaştırmak için tüm dizileri seçin. Bu hizalama için açılan menüde kullanılan başvuru sırasını belirtmek unutmayın.
    3. Sıralı bölgeyi, referans dizisiyle karşılaştırıldığında nükle değişiklikleri için inceleyin. İstenirse, metnitıklayarak. RTF formatında bilgisayara hizalama kaydedin, sonra Kaydet.
      Not: Hiçbir mutasyon tanımlanmamış ise, DNA sıralaması ve analiz protokolü, geni kodlama olmayan bölgeleri içerecek şekilde tasarlanan astar ile tekrarlanacaktır.

7. protokol 6: aday gen fonksiyonunun daha fazla Analizi

  1. Gen brat nörodejenerasyon fenotipinden sorumlu olup olmadığını belirlemek için nöroblastlar kurtarma denemeleri gerçekleştirin.
    1. Çift denge bir UAS-brat19 ve bir neuroblast özgü worniu-Gal4 (WOR-G4) hisse senetleri üçüncü kromozom üzerinde yapıları taşıyan, yanı sıra 867 hattı, hangi gen brat için mutant ikinci bulunan Kromozom.
      1. Üç farklı gıda içeren şişeler 5 erkek UAS-brat, WOR-G4 ve 867 hatları koyarak üç ayrı haçlar olun ve bir satır, ikinci için işaretçileri ve dengeleyiciler taşıyan bir satırda erkek 10-15 bakire kadın her set ekleyin ve üçüncü kromozomlar (SP/CyO; Dr/Tm3, SB; BL_59967).
      2. Aşağıdaki genotypes ile her haç F1 10-15 bakire kadın toplamak: +/CYO; UAS-brat/Tm3, SB, +/CYO; WOR-G4/Tm3, SB ve 867/CYO; +/TM3, SB ve 5 erkek aşağıdaki genotypes her biri: +/SP; UAS-brat/Tm3, SB, +/SP; WOR-G4/Tm3, SB ve 867/CYO; +/Dr.
      3. Çapraz collelcted +/CYO; UAS-brat/Tm3, SB bakire dişi +/SP; UAS-brat/Tm3, SB erkek; ayrı bir şişede +/CYO ile ikinci bir haç yapmak ; WOR-G4/Tm3, SB Virgin kadın +/SP; WOR-G4/Tm3, SB erkek ve sonra üçüncü bir şişe arasında çapraz 867/CYO; +/TM3, SB bakire kadın ve 867/CYO; +/Dr erkek.
      4. Bu haçlar her biri F1 itibaren, aşağıdaki genotypes hem erkek hem de kadın toplamak: SP/CyO; UAS-brat/Tm3, ilk haç dan SB, SP/CYO; WOR-G4/Tm3, ikinci haç ve 867/CYO dan SB; Dr/Tm3, ikinci haç 'dan SB.
      5. Her üç satır için kalıcı çift dengeli stokları kurmak için her F1 Döl toplanan kardeşler arasında son haç gerçekleştirin.
    2. 867 mutasyonu Ile UAS-brat ve WOR-G4 ' i birleştirin.
      1. 867/CyO bakire kadınların yeterli sayıda (~ 20-30 uçar) toplamak ; Dr/Tm3, SB çift dengeli stok iki haç gerçekleştirmek için.
      2. SP/CyO 'dan ~ 5 erkek ile 10-15 bakire kadın yerleştirin ; UAS-brat/Tm3, SB (çapraz #1) ve ikinci bir şişe 10-15 bakire kadın ~ 5 SP/CYO ile; WOR-G4/Tm3, SB erkek.
      3. Aşağıdaki genotypes ile her haç F1 Brothers ve kardeşler toplamak: 867/CyO; UAS-brat/Tm3, çapraz #1 ve 867/CYO gelen SB; WOR-G4/Tm3, sb çapraz #2. Bunların arasında kardeşleri geçerek kalıcı stokları kurmak için her haç toplanan F1 Döl kullanın.
        Not: Bu son adımın ardından, 867/CyO için Stoklar; UAS-brat/Tm3, SB ve 867/CYO; WOR-G4/Tm3, SB oluşturulması gerekir.
    3. Kurtarma deneyi yapın.
      1. 867/CyO dan ~ 15-20 bakire kadın toplamak ; WOR-G4/Tm3, SB stok ve onları çapraz 5-10 erkek stok 867/CYO; UAS-brat/Tm3, SB. Kontrol olarak, çapraz ~ 15-20, 867/CyO bakire kadın ; WOR-G4/Tm3, SB ve ~ 15-20 bakire kadın 867/CYO; UAS-brat/Tm3, tek başına 867/CYO hattına SB hattı.
        Not: 867 sinekler, brat 'ın sıcaklığa duyarlı bir allel taşır ve kurtarma haç 29 °c ' de yapılmalıdır.
      2. Dikkatle işaretlenmiş dengeleyicileri seçerek her haç aşağıdaki F1 Döl toplamak: 867/867; WOR-G4/UAS-brat (kurtarma), 867/867; WOR-G4/+ (kontrol) ve 867/867; UAS-brat/+ (kontrol).
      3. 29 °C ' de istenilen şekilde sinekleri yaşa ve Bölüm 4 ' te açıklanan protokolü kullanarak nörodejenerasyona bakmak için beyin üzerinde Histoloji analizi gerçekleştirin (protokol 3).
  2. 867 mutantlar içinde nörodejenerasyon yaş bağımlı analizi gerçekleştirin.
    1. 867 toplamak; PCNA-Gfp ve YW kontrol sinekler, hangi bir muhabir geni (PCNA-Gfp) taşır ve 25 °c ' de uygulanabilir ve hem yüksek penetrans ve daha yüksek ifade nörodejenerasyon phenoype daha 867 tek başına bu sıcaklık17.
    2. Bölüm 1,4 ' de açıklandığı gibi 5, 15 ve 25 ' e kadar uçar ve Bölüm 4 ' te (protokol 3) protokolü izleyerek sonraki Histoloji analizini gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu aerticle 'da, Yetişkin sinekler17' de nöronal bütünlüğünü (örneğin, nörokoruma) bakım rolü oynarken gen beyin tümörü (brat) tanımlamak için kullanılan adımları sunuyoruz; nörokoruma dahil genler tanımlamak için kullanılabilecek bir metodoloji. Biz ileri genetik bir yaklaşım kullanılan (strateji Şekil 1aözetlenmiştir) bir tırmanma tahlil kullanarak kimyasal mutagenized sinekler bir koleksiyon aracılığıyla ekrana (Bu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Drosophila ileri genetik ekranlar, Yaş bağımlı nörokoruma dahil olmak üzere farklı biyolojik süreçlerde yer genler belirlemek için etkili bir yaklaşım olmuştur5,23,24, 25. bu stratejiyi kullanarak, brat 'ı yeni bir nörokoruyucu gen17olarak tanımlamada başarılı olduk.

Bu protokoldeki önemli bir adım, Histoloji analizi için baş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Teşekkürler

Özellikle Dr. Barry Ganetzky 'ye, genetik ekranın hangi laboratuarında gerçekleştirildiği, velet 'in nörokoruyucu bir gen olarak tanımlanması ve karakterizasyonu için minnettarız. Biz nazik ENU-mutagenized Bu yazıda sunulan genetik ekranda kullanılan uçar koleksiyonu sağlayan Dr Steven Robinow teşekkür ederiz. Ganetzky laboratuarı üyelerine, DRS. Grace Boekhoff-Falk ve David wassarman 'ın bu projenin süresi boyunca yararlı tartışmalar için teşekkür ediyoruz, Ling Ling Ho ve Bob KREBER teknik yardım için, Dr. aki Ikeda onun Mikrotom tesis kullanımı için Wisconsin Üniversitesi ve Dr. kim Lackey ve Alabama Üniversitesi 'nde optik analiz tesisi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
büyük ekipman< / histoloji
davlumbaz Işık Mikroskobu
< güçlü > Sinek itme ve tırmanma tahlili< / güçlü >
VWR > Drosophila Şişesi, DarVWR75813-160
VWR® Genel Amaçlı Laboratuvar Etiketleme BandıVWR89097-912
Standart mouse pad
StereoskopMoticModel SMZ-168
CO2 anestezi istasyonu (Üfleme tabancası, ayak valfi, Ultimate Flypad)Genesee Scientific54-104, 59-121, 59-172Yapmaz t iinclude CO2 tankı
İnce Uçlu FırçalarSOLO HORTON FIRÇALAR, INC.
Drosophila KuluçkaVWR89510-750
gen haritalama
CantonSBloomington Drosophila Stok Merkezi9517
w1118Bloomington Drosophila Stok Merkezi5905
yw Bloomington Drosophila Stok Merkezi6599
Drosophila rekombinasyon haritalaması için kullanılan hatBloomington Drosophila Stok Merkezi3227Genotip: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco] Bloomington Drosophila Stok Merkezi2555Rekombinasyon haritalaması için kullanılan Drosophila dengeleyici hattı
Kromozom 2L için Eksiklik KitiBloomington Drosophila Stok MerkeziDK2LCook ve diğerleri, 2012
Histoloji analizi
Etanol, (%100)Thermo Fischer ScientificA4094
KloroformThermo Fischer ScientificC298-500
Buzul Asetik AsitThermo Fischer ScientificA38-500
Fisherbrand & Trade;   Premium Mikrosantrifüj Tüpleri: 1.5 mLThermo Fischer Scientific05-408-129
Histochoice temizleme maddesi 1xVWR Yaşam Bilimleri97060-934
Harris HematoksilenVWR95057-858
EosinVWR95057-848
Thermo Scientific & Trade;   Richard-Allan Bilim ve Ticaret; Montaj OrtamıThermo Scientific™ 411222-110-610CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysine mikroskop slaytları, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select PlusAzer Scientific Fisherbrand
& trade;   Kapak Camları: DikdörtgenlerFisherbrand12-545MBoyutlar: 24 mm x 60 mm
İzlenebilir zamanlayıcıVWR
Sürgülü IsıtıcıBarnstead Internationalmodel no. 26025
Sürgülü tepsi ve raflarDWK Yaşam BilimleriRafı 20 slaytı tutmak için
Fisherbrand™   Genel Amaçlı Ekstra Uzun ForsepsFisherbrand10-316A
Kimwipes™Kimberly-Clark ve ticaret; Profesyonel 
6 inç Püriten aplikatörleriParke Ürünleri Şirketi, Guilford, Maine807-12
VWR & reg; Tıraş BıçaklarıVWR55411-050
Histoloji sıvıları16 + 1 akan su için
Yüksek Profilli Kaplamalı Mikrotom BıçaklarıVWR95057-834
Corning™   Kapaklı Yuvarlak Buz Kovası, 4 LCorning™
Beherveya buzlu su ve kasetler için başka bir kap
Doku BanyosuHassas Bilimsel Şirket66630
MikrotomLeica Biosystems
Molecular analiz< / strong>
Wizard® SV Jel ve PCR Temizleme SistemiPromegaA9282
Ex Taq DNA polimerazTaKaRa5 U/μ l
Canlandırıcı ve ticaret;   SYBR ve ticaret; Güvenli ve ticaret; DNA Jel Boyası   Canlandırıcı ve ticaret;
UltraPure ve ticaret; Agaroz  Canlandırıcı ve ticaret;
1 Kb Plus DNA Merdiveni  Canlandırıcı ve ticaret;
ApE-A plazmid Düzenleyici yazılımıÜcretsiz indirilebilir
İstatistiksel analiz
Daha fazla analiz
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]Bloomington Drosophila Stok Merkezi59967
için güçlü > Nikon Eclipe E100 Görüntüleme için tercih edilen objektif 20x Görüntüleme yazılımı Nikon Mikroskop Kamerası Nikon Termal döngüleyici Eppendorf makinesi için Tupperware veya cam kaplar R yazılım paketi

Kaynaklar

  1. Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
  2. Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
  3. Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
  4. Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  5. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).
  7. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  8. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  10. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  11. Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
  12. Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
  13. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Foundation for Statistical Computing. (2008).
  14. Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
  15. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
  16. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21(2012).
  17. Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
  18. Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).
  19. Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
  20. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
  21. Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
  24. Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
  25. Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
  26. Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816(2015).
  27. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  28. Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
  29. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tırmanma DeneyiHistolojik AnalizEksiklik HaritalamaDNA DizilemeCarnoy SabitleyicisiParafin GömmeHematoksilen Boyama
In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.