Monomers ve Use In vivo Alfa-Synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi

Özet

Bu makalenin amacı, monomerik Alfa-synuclein, sonraki kalite kontrol ve önceden biçimlendirilmiş liflerinde in vivo kullanımı liflerinde nesil için gerekli adımları özetlemesidir.

Özet

Synucleinopati in vivo Alfa-synuclein önceden biçimlendirilmiş Fibril (α-SYN PFF) modeli kullanımı Parkinson hastalığı synucleinopati ve nigrostriyatal dejenerasyon modeli amaçlayan araştırmacılar arasında popülerlik kazanıyor. Tutarlı ve güçlü α-SYN patolojisini sağlamak için α-SYN PFF Generation ve in vivo uygulamasının standardizasyonu önemlidir. Burada, monomerik α-SYN, fibrilasyon sonrası kalite kontrol adımlarından liflerin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz ve α-SYN PFFs 'larının fare veya fareler içine başarılı Nöroşirürji enjeksiyonu için önerilen parametreler. Monomerik α-SYN ile başlayarak, en iyi tampon koşullarında, konsantrasyon ve sıcaklığa sıkışırken 7 günlük kuluçken döneminde fibrilasyon meydana gelir. Fibrilasyon sonrası kalite kontrolü, sedimentasyon tahlili ile peletlenebilir fibrlerin varlığı, bir Tiyoflavin T tahlil ile fibrlerin amiloid konformasyonunun oluşumu ve liflerin elektron mikroskobik görselleştirmesi ile değerlendirilir. Bu testler kullanarak başarılı doğrulama başarı için gerekli olduğu halde, onlar pffs her pff toplu gibi toplama aktivitesi hücre kültürü veya pilot hayvan kohorts test edilmelidir gibi, nöronlar içinde α-SYN kapanımlar tohum olacağını garanti etmek için yeterli değildir. Kullanmadan önce, PFFs hassas standartlaştırılmış koşullar altında sonicated, elektron mikroskobu veya dinamik ışık saçılma kullanarak muayene tarafından takip fibril uzunlukları en iyi boyut aralığında olduğunu onaylamak için, ortalama uzunluğu ile 50 Nm. PFFs daha sonra hücre kültürü ortamına eklenebilir veya hayvanlarda kullanılabilir. Fosforile α-SYN (psyn; serin 129) için immünostasyon tarafından algılanabilen patoloji sırasıyla hücre kültürü ve kemirgen modellerinde belirgin günler veya haftalar sonra görülür.

Giriş

Parkinson hastalığı (PD), öncelikle iki büyük patolojik özellik ile postmortem karakterizedir: yaygın ve Progressive Alfa-synuclein (α-SYN) patolojisini ve nigrostriyatal dejenerasyonu. Wildtype fareler veya fareler içine enjeksiyon aşağıdaki, α-SYN önceden biçimlendirilmiş liflerinde (pffs) patolojik α-SYN Progressive birikimine neden, hangi kanıtlanmış bir Nigra pars Compacta uzun süren dejenerasyon neden olabilir (snpc) birçok ders üzerinde dopamin nöronlar ay, sensorimotor açıkları^1,2,3,4,5,6yanı sıra. Nöronlar α-SYN fibrine maruz kalmaktadır, ya doğrudan intrakerebral enjeksiyon yoluyla ya da kültürlü nöronların medyasını ekledi. Pffs nöronların içine alındığında, pffs "Seed" templating ile kapanımlar oluşumu, ve fosforilated kapanımlar içine endojen α-SYN birikimi¹,^{7,8, 9}' a kadar. İnclusions Lewy gövdelere benzer özellikleri paylaşır: serin 129 (psyn), Ubiquitin ve P62 'de α-SYN fosforile içeren; pozitif Tiyoflavin boyama ile gösterilen amiloid dörernary yapıları sahip; ve proteinaz K sindirim dirençli^{1,3,5,7,8,9,10,11, 12}' ye kadar. Pff pozlama birincil olarak α-SYN dahil oluşumu ve kültürde bazı ölümsüzleşmiş nöronlar, yanı sıra fareler, fareler, ve insan olmayan primatlar vivo^{1,2,3,4, 5},^6,7,8,9,13. PFFs tüm hücre kültürü modellerinde α-SYN dahil oluşumu yol açmaz ve bazı kültürlü nöronlar diğerlerinden daha iyi tohum olacaktır dikkat etmek önemlidir.

İn vivo α-SYN PFF modelinin bir diğer önemli özelliği de birkaç ay içinde ortaya çıkan farklı sıralı patolojik fazlar. Kemirgenler, intrastriatal enjeksiyon aşağıdaki, α-SYN dahil oluşumu genellikle SNpc içinde doruklarına ve birçok kortikal bölgelerde 1-2 ay içinde. Bu toplama zirvesinde nigrostriyatal dejenerasyonu tarafından izlenen ≈ 2-4 ay sonra^1,3,5. Bu farklı patolojik aşamalar, araştırmacıların, 1) α-SYN toplamasını azaltan, 2) zaten oluşan α-SYN inclusions ve/veya 3) sonraki nörodejenerasyonunu önlemeleri için hangi stratejilerle çalışma ve geliştirme platformunu sağlar. Pff modeli, önceden gözden geçirilmiş olarak nörotoksisant, transgenik ve viral vektör aracılı α-SYN ekspresyonu modelleri ile karşılaştırıldığında farklı avantajlar ve dezavantajları sunar⁶. Hangi model veya yaklaşım almak için seçim hangi model en iyi dedektifler soran soru uygun olarak belirlenmelidir.

PFF modeli birçok laboratuar tarafından başarıyla kullanılsa da, fibrler üreten ve tutarlı α-SYN patolojisi¹⁴üreten tutarsızlıklara sahip olan gruplar hala vardır. Küçük veya hiçbir α-SYN patolojisini üreten PFFs 'dan tutarsızlık örnekleri, toplu tohumlama verimliliği için toplu iş ve hatta fibrlerin bile başarısızlığı şeklinde değişir. Böylece, yeni terapötik müdahalelerin etkisi ile ilgili doğru yorumlara izin vermek için α-SYN PFF Generation ve in vivo uygulamasının standardizasyonu önemlidir. Aşağıdaki protokol α-SYN monomers gelen PFFs üretimi için gerekli adımları özetliyor, PFFs in vitro kalite kontrolü bir kez oluşturulan, sonication ve PFFs ölçüm önce kullanımı, ve öneriler başarılı in vivo enjeksiyon kolaylaştırmak için Rats veya fareler içine PFFs.

Protokol

Hayvanları içeren tüm yöntemler Michigan State Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.

1. monomerlerin α-synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrlerin oluşumu (Şekil 1)

1. Ice üzerinde çözülen α-synuclein monomerleri, tüpü Flicking ile yavaşça pelletini ve 15.000 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika santrifüjle.
   Not: α-SYN monomer özellikle fibrilasyon için formüle edilmelidir. Rekombinant monomerler ticari kaynaklardan satın alınabilir veya site^4,9,14,15üzerinde protokoller tarafından oluşturulabilir. Ticari kaynaklardan satın aldıysanız, ürün α-SYN monomer özellikle fibril nesil için olduğunu belirtmek zorundadır. Monomerlerin satın alınırsa veya sitede oluşturulup üretilmesine bakılmaksızın, fiiller oluşturulduğundan ve deneylerde kullanımından önce verimli bir şekilde tohumların sağlanabilmesi için aşağıda özetlenen kalite kontrol adımları her toplu işlemle yapılmalıdır.
2. Temiz 1,5 ml mikrosantrifüjü tüpüne süpernatant aktarın ve aktarılan tutarı kaydedin.
   Not: Eğer varsa, küçük olacak Pelet, önlemek için dikkatli olun.
3. Standart bicinchoninik asit tahlil (BCA) ya da 280 nm 'de bir mikrohacim spektrofotometresi ile emilme ölçme tarafından aktarılan süpernatant protein konsantrasyonu ölçmek.
   Not: BCA tahlil α-SYN spesifik ölçümü için doğru değildir ve sonuçlar protein konsantrasyonu overestimating verebilir. Sonuç olarak, 280 nm 'de emici ölçümü, protein konsantrasyonunu belirlemek için önerilen yöntemdir.
   1. BCA tahlil ile ölçmek için, standart BCA protokolleri takip ve α-SYN monomer üç farklı seyreltme ile gerçekleştirin. Önerilen dilüsyonlar 1:25, 1:50 ve 1:100.
   2. A280 yöntemi ile ölçmek için, steril 1x ile okuyucu boş Dulbecco fosfat tampon tuzlu (dPBS) kalsiyum ve magnezyum olmadan, yaklaşık 100 mM NaCl tuz konsantrasyonu, ve pH aralığı 7.0-7.3 (malzeme tablosu).
   3. Okuyucuya 2 μL örnek ekleyin ve 280 nm 'de emici okuyun.
   4. Monomerlerin konsantrasyonunu belirlemek için Beer-Lambert yasasını kullanın.
      
      Not: insan α-SYN için ε yok olma katsayısı 5.960 M^-1cm^-1 ve fare α-SYN için 7.450 M¹cm^-1' dir. PathLength cm olarak ölçülür. α-SYN (14 kDa) moleküler ağırlığı 1 da = 1 g/mol varsayılarak tahmin edilmektedir.
4. 5 mg/mL 'Lik son konsantrasyona 1x dPBS ile monomerleri seyreltin. Monomerleri seyreltme için eklenen 1x dPBS miktarını hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın.
   
   Not: tüm konsantrasyonlar mg/mL 'Dir ve μL içinde hacimler vardır. monomer dilüsyonları 1x dPBS ile yapılmalıdır. Tekrarlanabilir fibrilasyon sonuçları elde etmek için fibriller oluşturmak için kullanılan toplam hacim 100 ile 500 μL arasında olmalıdır.
5. Kısaca karışımı, ve santrifüj tüp altındaki tüm sıvı toplamak için Vortex. Ulquot monomerlerin kalite kontrol karşılaştırması için fibril olarak adımları belirtildiği gibi 1.8.1-1.8.4.
6. Mikro Santrifüj tüp kapağını kapatarak sabitlemek için bir tüp kilidi veya balmumu/plastik film (malzeme tablosu) kullanın.
7. 37 °C ' de 7 gün boyunca kapak ile orbital thermomixer içine tüp yerleştirin, 1.000 RPM (malzeme tablosu) sallayarak.
   Not: 7 günün sonunda, tüpün içeriği bulanık görünmelidir. Thermomixer tüp kapakları üzerinde yoğuşma oluşumu önlemek için bir kapak olmalıdır.
8. Α-SYN liflerini yeniden pelletini için tüp hafifçe kaydırın. Aşağıdaki kalite kontrol adımları için aliquot liflerinde gibi adımda belirtildiği 1.8.1-1.8.4.
   Not: kalite kontrol adımları için fibrils bir gecede RT 'de depolanabilir.
   1. Aliquot 6 μL sedimentasyon tahlil için.
   2. Tiyoflavin T bağlayıcı tahlil için 5 μL aliquot.
   3. Fibril görselleştirme için iletim Elektron Mikroskopisi için aliquot 2 μL.
   4. Endotoksin tahlil için en az 10 μL aliquot.
      Not: endotoksin tahlil Için, ticari bir Limulus Aıcyte lysate (LAL), üretici talimatları (malzeme tablosu) aşağıdaki kullanılır. Endotoksin seviyeleri olmalıdır ≤ 0,5 endotoksin üniteleri/mL fibriller için. Bu ölçüt karşılanmamış ise bir endotoksin kaldırma kiti kullanılabilir.
9. Kalan liflerinde ve mağaza aliquot. Uzun süreli depolama (12-18 ay) için, Kuru buzları hızla dondurur ve-80 °C ' de saklayın.
   Not: alquot tutarı istenen aşağı akış uygulamasına bağlıdır. In vivo kullanımı genellikle in vitro kullanımda daha yüksek konsantrasyonlarda daha fazla fibril gerektirir ve kısım hacimleri buna göre planlanmalıdır. Potansiyel donma/çözülme hasarı önlemek için lifleri dondurucu arkasına doğru saklanmalıdır. Protokol burada duraklatılmış olabilir.

2. sedimentasyon tahlil

1. Temiz bir mikrosantrifüjler tüpünde, 54 μL 'den 6 μL pff 'a ekleyin ve serum liflerinde 1:10 ile pipet 'i karıştırın.
   1. Ayrı bir tüpte, ek bir denetim olarak 54 μL dPBS 'ye 6 μL monomer ekleyin.
2. 10.000 x g 'de santrifüj numuneleri RT 'de 30 dakika ve süpernatant 'i temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
3. 60 μL dpbs eklemek için kalan Pelet ve girdap yeniden resuspend için.
4. Her tüp ve girdap için 30 μL 3x örnek tampon (140 μL,% 50 gliserol/% 0.1 bromophenol mavi, 40 μL,% 10 SDS ve 20 μL β-mercaptoetanol) ekleyin.
5. 100 ° c 'de numuneleri 10 dakika boyunca kulyatla ve buzda 5 dakika soğumasını bekleyin.
6. Standart sodyum Dodesil sülfat-Poliakrilamid jel electroforesis (SDS-sayfa) protokol kütle tarafından protein ayırmak için kullanın. 14 kDa (monomerik α-SYN için beklenen boyut bandı) içeren bir Aralık ile bir protein merdiven kullanın.
7. Jel bir boyama çanak içine aktarmak ve Coomassie mavi leke ile jel kapak (0,1% Coomassie parlak mavi,% 20 metanol hacmi, ve% 10 asetik asit ddH₂O hacmine göre). Titreyerek RT 'de 3 saat boyunca inküye yapın.
8. Coomassie mavi lekeyi dökün ve jel kapsayacak şekilde yeterli Solusyon (hacim tarafından% 50 metanol ve DDH₂O hacim tarafından% 10 asetik asit) ekleyin. Titreyerek RT 'de 30 dakika boyunca inküye yapın.
9. Solusyon boşaltın ve jel açık ve bantları görünür olana kadar Solusyon adım tekrarlayın.
10. Jel 3 kez ddH₂O ve görüntü jel sallayarak her biri için 5 dakika yıkayın.

3. fibril görselleştirme için şanzıman Elektron Mikroskopisi

1. Bir mikrosantrifüjlü tüp içinde uranyl asetat 20 mg tartmak ve 2% sulu bir çözüm yapmak için ddH₂O 1 ml ekleyin. Uranyl asetat kadar Vortex çözüm, ve gece oturmak için izin verir.
   Not: Uranyl asetat, iletim elektron mikroskobu için Numune hazırlamadan önceki gün yapılmalıdır. Işık veya ajitasyon maruz uranyl asetat çökelmek için neden olabilir, gibi, uranyl asetat çözeltisi içeren tüp alüminyum folyo kaplı olmalıdır, karanlık bir yerde tutulur, ve uranyl asetat sonra sarsılmamış çözüm.
2. 98 μL dpbs için 2 μL pff ekleyin liflerinde 1:50 seyreltmeli ve sonra karıştırma pipet.
3. Tezgah üst kısmında temiz bir balmumu/plastik film (malzeme tablosu) kaplı yüzey (yaklaşık 50 mm x 50 mm) hazırlayın. Temiz balmumu/plastik film (malzeme tablosu), aşağıdaki ekleyin (Şekil 2).
   1. 4 x 10 μL damla ddH₂O ekleyin.
   2. 1 x 10 μL damla seyreltilmiş fibril veya monomer örnek ekleyin.
   3. 2 x 10 μL damla 2% uranyl asetat ekleyin.
4. İnce uçlu forseps kullanarak bir formvar/karbon kaplı, hasır bakır iletim elektron mikroskobu ızgarası (malzeme tablosu) almak için.
   Not: ızgarayı sadece kenardan alıp, merkezdeki kafes kısmının önlenmesi için emin olun (Şekil 2A). Forseps kafes dokunursanız, formvar/karbon kaplı film, ızgaranın o alanda görüntüleme imkansız hale zarar olacaktır.
5. Izgara formvar/karbon kaplamalı yan (parlak tarafı) aşağı ddH₂o ilk damla aşağı float. ızgarayı tutmak ve tüm kaplamalı yüzeyin DDH₂o ile temas halinde olmasını sağlamak için yavaşça forseps kullanın. 1 dakika için ızgara float edelim.
6. Izgarayı pick up, ve ızgara Mesh kısmına dokunmadan, filtre kağıdı ile ddH₂O uzakta fitil.
7. 1 dakika için ddH₂o ikinci damla üzerinde yukarıdaki gibi ızgara float ve DDH₂o uzakta fitil.
8. 1 dakika seyreltilmiş liflerinde damlası üzerinde ızgara float ve yukarıda olduğu gibi aşırı uzakta fitil.
9. 1 dakika uranyl asetat ilk damla ızgara float ve aşırı uzakta fitil.
10. 1 dakika uranyl asetat ikinci damla ızgara float, aşırı uzakta fitil.
11. Kısaca ddH₂o üçüncü damla üzerinde ızgara float ve DDH₂o uzakta fitil.
12. Kısaca ddH₂o dördüncü damla üzerinde ızgara float ve DDH₂o uzakta fitil, mümkün olduğunca çok DDH₂o kaldırmak için emin olmak.
13. Görüntüleme kadar depolama için bir kılavuz kutusuna aktarın.
    Not: ızgaralar görüntüleme işleminden önce en az 5 dakika kurumalıdır. Izgaralar hazırlandıktan sonra en az bir yıl boyunca görüntülenmiş olabilir ve kuru bir ortamda tutulmalıdır.

4. thioflavin T tahlil

1. Temiz bir mikrosantrifüjler tüpünde, 245 μL 'ye 5 μL PFF ekleyin, 1:50 fibriller ve karışımı için pipet seyreltilme için dPBS.
2. Negatif kontrol olarak hizmet vermek için ayrı bir mikrosantrifüj tüpüne 250 μL dPBS ekleyin.
3. Monomer kontrolü olarak hizmet vermek için 245 μL dPBS 'ye 5 μL monomer ekleyin.
4. 250 ekleme μL Tiyoflavin t içinde glisin Buffer (25 μM Tiyoflavin t, 100 mm gcine, 1% Triton X-100, pH 8,5) her numune ve hafifçe karıştırın.
5. Pipet 2 çoğaltır, 200 μL her, bir siyah 96 iyi plaka içine. Fotoobleaching önlemek için karanlıkta plaka tutun.
6. RT 'de 1 saat boyunca inküye yapın ve 450 nm ve 510 nm emisyonunun bir uyarılması ile plakası okuyun.
   Not: Thioflavin T ölçümleri zamanla dalgalanacak. Numuneler aynı inkübasyon zamanında okunmalıdır. İstenirse, saat kuluçted sırasında birden fazla okuma alınabilir ve zamanla çizilir.

5. α-synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrlerin sonication

DIKKAT: sonicator ve tüm sonication adımlar sonication sırasında aerosolize olabilir lifleri maruz kalmasını önlemek için bir kültür kaputu gerçekleştirilir. Sonication adımlarını gerçekleştiren personel, eldiven, laboratuvar ceket şeklinde giyim koruması ve sonicating sırasında bir yüz kalkanı dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giymelidir. Fibril pozlama riski bir fincan boynuz sonicator ile sonicating tarafından azaltılabilir, lifleri içeren tüp sonication sırasında kapalı kalmasını sağlayan.

Not: fibrlerin optimum sonication parametreleri kullanılan sonicator modeline bağlıdır. Bu nedenle, bazı optimizasyon fiiller doğru boyutta olduğundan emin olmak için gerçekleştirilmesi gerekir. Kullanılan sonicator malzeme tablosunda bulunabilir ve özetlenen parametreler sonicator bu modeli ile önceki sonuçlara dayanmaktadır. Aşağıdaki parametreler 200-400 μL çözeltisi içinde 2-4 μg/μL PFFs için çalışacaktır. Cihaz ile test sonication yapılmalıdır ve liflerinde deneylerde pffs kullanımından önce elde edilir istenen sonuçları sağlamak için analiz.

1. Dönüştürücü 3,2 mm çap prob (malzeme tablosu) takın ve adım 5.1.1-5.1.3 ' de aşağıda belirtildiği gibi sonicator parametrelerini ayarlayın.
   1. Genliği% 30 ' a ayarlayın.
   2. Nabzı 01 01 (1 s açık; 1 s kapalı) olarak ayarlayın.
   3. Saat 0:01:00 olarak ayarlayın.
      Not: 1 dk darbeli 60 darbeleri eşittir ve bu sonicator modeli (malzeme tablosu) otomatik olarak durur. Diğer sonicator modelleri ile, pulsların sayısı sayılması gerekecektir.
2. RT 'de lifleri çözün ve bir kültür kaputu içinde steril dPBS ile seyreltin.
   Not: net bir 0,6 mL mikrosantrifüjlük tüp sonication için en iyi çalışır ve son fibril konsantrasyonu amaçlanan kullanıma bağlıdır. Gösterilen temsili sonuçlar, 4 μg/μL 'nin son fibril konsantrasyonlarından oluşur.
3. Prob temizlemek için% 70 etanol ile nemlendirilmiş bir laboratuar dokusu ile sonicator prob silin. Prob ucu ddH₂O ve darbe 10 kez daha fazla prob temizlemek için, ve sonra bir laboratuvar dokusu ile Kuru silin.
4. Prob ucunu seyreltilmiş liflerin tüpüne yerleştirin ve ucu tüpün alt kısmına konumlandırın.
5. 60 darbeleri için sonikat (1 s açık; 1 s kapalı). Sıvının tüm liflerin sonicated sağlamak için her nabız sırasında prob yukarı ve aşağı taşıyın. ve temiz.
6. 60 darbeli sonra, prob PFFs çıkarın ve 2 μL PFF için 98 μL dPBS için temiz bir mikrosantrifüjlü tüp seyreltmesi için fibriller 1:50 sonicated fibril ölçüm elektron mikroskobu tarafından.
   Not: Ideal olarak, fibrlerin küçük bir alt kümesini önce in vivo enjeksiyon ve daha kapsamlı bir fibril ölçümü zaman izin zaman gerçekleştirilen ölçülmelidir.
7. Sonication sonra, kısaca santrifüjler PFFs için 1 s at 2.000 x g tüp yan kapalı tüm sıvı toplamak için.
   DIKKAT: tüp dokunmadan sıcak hale gelirse, 30 darbeleri sonra sonicating durdurmak, 1 dakika bekleyin ve son 30 Bakliyat için sonikat.
   Not: sonicating Iken, her nabız başlangıcında sıvı altına doğru prob ucu tutmak, çok sıvı örnek kaybına neden olacaktır üstüne yakın.
8. Prob ucunu 1% SDS ve nabız 10 kez temizleyip sondayı temizleyin. Ucu SDS 'den çıkarın, ddH₂O ve nabız 10 kez altbirleştirme.
9. Probe% 70 etanol ile nemlendirilmiş bir laboratuar dokusu ile prob silin ve sonra kuru bir laboratuar dokusu ile prob silin. Prob Dönüştürücüsü ve deposundan ayırın.
10. Kaputun tüm yüzeylerini% 1 SDS ile silin, ardından% 70 etanol.
    Not:% 1 SDS çözeltisi, lifleri ve temiz yüzeyleri ve ekipmanları¹⁶' ya ayırmak için kullanılır.

6. sonicated liflerinde ölçümü için şanzıman Elektron Mikroskopisi

Not: elektron mikroskobu uygulanabilir değilse, bir Tiyoflavin T kinetik tahlil ve dinamik ışık saçılma verimlilik ve fibril boyutu^4,14dolaylı önlemler olarak kullanılabilir.

1. Yukarıdaki "fibril görselleştirme için elektron mikroskobu" bölümündeki protokolü kullanarak örnekleri hazırlayın.
2. 6 ila 10 farklı ızgara açıklıklarından fibrin görüntüsünü almak için bir iletim elektron mikroskobu kullanın.
   Not: görüntüler fibriller ölçmek için yeterince yüksek bir büyütme olmalıdır, ancak aynı anda birden fazla lifleri görselleştirmek için yeterli düşük. Yaklaşık 75, 000x son büyütme yeterli olmalıdır.
3. Bir denemede fibriller kullanmadan önce en az 25 fibrin küçük bir alt kümesinin uzunluğunu ölçün.
   Not: Bu ölçümler genellikle mikroskop ile ilişkili görüntüleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Hızlı doğrulama için, kişi ölçme temsili liflerinde seçin ve ortalama boyutunu hesaplamak gerekir. Fibril uzunluğu yaklaşık 50 nm veya daha az, daha doğru bir ölçüm takip ile ortalama olmalıdır.
4. Daha kapsamlı sonuçlar için 500 + liflerinde uzunlukları ölçmek.
   Not: mikroskopla ilişkili görüntüleme yazılımı fibril ölçümleri için kullanılabilir. Alternatif olarak, resimler açılabilir ve fibril boyları karşılaştırmak için bir boyut referans olarak her görüntü ile ilişkili Ölçek çubuğunu kullanarak, görüntü işleme yazılımı ile ölçülmüştür.

7. stereotaktik enjeksiyonlar için özel cam iğne şırıngalar hazırlanması (Şekil 3)

1. Temiz 50 mL Beaker 'a yaklaşık 10 mL silikonizing reaktif (malzeme tablosu) ekleyin.
2. Cam kapiller tüpleri (uzunluk 54 mm; dış çap: 0,86 mm; iç çapı 0,59 mm) silikonizing reaktif kabı dikey ve kapiller eylem tüp yukarı alt boru açma üzerinden boru yukarı yukarı çizmek için izin silikonizasyon reaktif.
3. Pipet ek silikonizing reaktif tamamen cam kapiller tüp doldurmak için silikonizing reaktif içinde batmaz üst tüp açma içine.
4. Silikonizing reaktif gelen kapiller tüpleri çıkarın ve tüplerin silikonizing reaktif kaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde tüpler açık uçları leke. Kılcal tüplerin en az 8 saat kurumasına izin verin.
5. Cam iğne çektirme (malzeme tablosu) içinde silikonized cam kapiller tüp yerleştirin.
6. Isıtma elemanı açın ve bağlı ağırlıkları ısıtmalı cam kapiller tüp germek için izin verir.
7. Ortadaki en ince noktada makas ile çekilen cam kapiller tüp Cut ve cam iğne çektirme cam iğne çıkarın.
   Not: çekilen iğne iç ve dış çapı sırasıyla yaklaşık 80 ve 100 μm olmalıdır. Birden fazla cam iğneler bir kerede yapılabilir ve bağlı metal iğne (malzeme tablosu) ile bir cam şırınga takmak için hazır kadar saklanır.
8. Küçültmek-Wrap boru uzunluğu (ortalama iç çapı 0,021 "ve ortalama duvar kalınlığı 0,001") yaklaşık 40 mm makas ile keser. Shrink sarma 10 μL eğimli şırınga (malzeme tablosu) metal iğne üzerine kaydırın.
9. Isı ve eşit ısı uygulamak için iğne döndürürken Shrink sarma iğne için açık bir alev kullanın.
10. Çekilen cam iğnesinin daha büyük ucunu, şırıngadaki metal iğne üzerinde dikkatlice kaydırın.
11. Küçültmek-Wrap boru uzunluğu Cut (ortalama iç çapı 0,036 "ve ortalama duvar kalınlığı 0,005") yaklaşık 40 mm makas ile ve dikkatle cam iğne tabanı ve şırınga metal iğne (tablo üzerinde üst üste slayt Malzemeler). Metal iğne cam iğne güvenliğini sağlamak için Shrink-wrap ısıtmak için açık bir alev kullanın.
12. Cam iğnenin güvenliğini sağlamak için ek bir Shrink sarma katmanı ekleyin. Küçültmek-Wrap boru uzunluğu Cut (ortalama iç çapı 0,044 "ve ortalama duvar kalınlığı 0,005") yaklaşık 40 mm makas ile ve dikkatle cam iğne tabanı ve şırınga metal iğne (tablo üzerinde üst üste slayt Malzemeler). Metal iğne cam iğne güvenliğini sağlamak için Shrink-wrap ısıtmak için açık bir alev kullanın.
13. Ucu yaklaşık 8 mm uzunluğunda olduğu için makas ile cam iğne Trim.
    Not: iğne istenen beyin bölgeleri (gerekli uzunluğu dorsal/ventral koordinatları bağlıdır) hedef için yeterince uzun olması gerekir.
14. İğne test etmek için 7.14.1-7.14.3 adımları kullanın hiçbir sızıntı vardır ve cam iğne gelen sıvı dağıtımı hem de yeterli akış vardır.
    1. 1 mL şırıngayı dH₂O ile bağlı 26 Gauge iğne ile doldurun.
    2. Özel cam iğne şırıngadan metal pistonu çıkarın ve dH₂O dolgulu şırınga iğnesini şırınga tabanına takın. DH₂O 'yu cam iğnesinden dağıtmak için basınç uygulayın. Cam iğne ve metal iğne arayüzünü sızıntılar için inceleyin ve sabit bir dH₂O akışını onaylayın.
       Not: gerekirse, cam iğne akış kolaylığı ve Shrink-wrap ek katmanlar cam iğne tabanına herhangi bir sızıntı yama eklendi artırmak için kesilmiş olabilir.
    3. Bir mikrosantrifüj tüpünü dH₂o ile doldurun. DH₂o 'da çizmek için özel cam iğne şırınga kullanın. şırınga içine sıvı alınır ve hiçbir kabarcıklar olduğunu onaylamak için iğne kontrol edin.
       Not: Eğer kabarcıklar veya dH₂O iğne içine çizilmiş değil ise, iğne kesme basıncı hafifletmek yardımcı olabilir.
15. Cerrahi için gerekli olana kadar şırınga kutularına bağlı cam iğneler ile şırıngayı dikkatlice saklayın.
16. Fareler içinde optimize Koordinatlar (bir site: AP + 0,2 mm ve ML + 2,0 mm, dura gelen DV-2,6 mm) ya da fareler (iki site: AP + 1,6 mm ve ML + 2,0 mm bregma gelen PFFs intrastriatal teslimat için standart stereotaktik cerrahi yöntemleri kullanın, DV-4,0 dura; AP + 0,1 mm ve ml + 4,2 mm bregma, DV-5,0 dura)^1,14,17.
    Not: Bu koordinatlar C57BL6/C3H fareler ve Fischer 344 fareler kullanılmıştır. Diğer suşları kullanırken, koordinatlar optimize edilmelidir.

Sonuçlar

Α-SYN monomerlerin fibrerlerin üretimi, monomerlerin konsantrasyonunu belirlemekte başlar. Hem BCA tahlil ve emilme ölçümü 280 Nm (A280) protein içeriği ölçmek için kullanılabilir; BCA tahlil sonuçları, ancak, A280 yöntemi daha yüksek bir konsantrasyon önerdi. Fare α-SYN monomer türetilen PFFs 14,05 ± 0,22 ve A280 bir BCA değeri vardı 8,05 ± 0,03 μg/μL (Şekil 1). Aynı şekilde, insan α-SYN monomer türetilen PFFs da daha yüksek bir konsantrasyon olarak ortaya çıktı, bir BCA değeri 12,95 ± 0,38 ve bir A280 arasında 7,83 ± 0,05 μg/μL (Şekil 1). A280 ölçümleri, yok sayımın katsayısına bağlı olarak α-SYN ' e özeldir ve bu sonuçlar 7 günlük kuluçarı öncesinde monomerleri seyreltmek için kullanılmıştır.

İnkübasyon öncesinde, α-SYN monomerleri içeren sıvı açıktı, ancak fibril oluşumundan sonra bulanık görünmelidir. Şanzıman Elektron Mikroskopisi ile yapılan muayene, 10-20 Nm genişliğinde (Şekil 4) ölçülen uzun liflerin varlığını doğruladı. Karşılaştırıldığında, α-SYN monomerleri belirgin bir şekil görülmez (Şekil 4). Fibriler yapıların görsel onayı ile, fibrlerin amiloid konformasyonu bir Tiyoflavin T tahlil kullanarak teyit edilmelidir pffs bir sonraki özelliğidir. Thioflavin T amiloid bağlarken gelişmiş floresans sergiler; Böylece, örneklerden artan floresan sinyali amiloid varlığını gösterir. Örnek olarak, dpbs 'deki Tiyoflavin, 3.287 ± 580 bağıl floresan ünitelerinin (RFU) bir sinyalini üretti, fare α-SYN monomer bir sinyal üretilen 4.174 ± 158 RFU, ve fare pffs bir sinyal üretilen 59.754 ± 6.224 RFU (Şekil 5). Karşılaştırıldığında, insan α-SYN monomer fare monomer için 4.158 ± 105 RFU benzer bir sinyal üretilen ve insan PFFs, fare PFFs karşılaştırıldığında 1.235.967 ± 113.747 RFU daha yüksek bir sinyal üretilen (Şekil 5). Peletlenebilir fibrlerin varlığını değerlendirmek için bir sedimentasyon tahlil yapıldı. Fibrils santrifüjleme ile Pelet olacaktır. Hem fare hem de insan pff örneklerinde, süpernatant fraksiyonunda süpernatant daha Pelet daha fazla protein olmalıdır (Şekil 6). Buna karşılık, fare ve insan monomerlerin protein çoğunluğu supernatant vardı, Pelet az mevcut (Şekil 6). PFFs, elektron mikroskobu ile gözle görülür bir şekilde mevcut olan amiloid yapıları mevcut ve lifleri pelletlenebilir, PFFs tüm in vitro kalite kontrol adımlarını geçti.

Hem fare hem de insan pffs α-SYN kapanımlar^4,18tohumlama için uygun uzunlukları pffs üretmek için sonicated. PFFs, 4 μg/μL ve sonicated istenilen konsantrasyona seyreltildi. Ameliyattan hemen önce, 25 temsilci lifleri elektron mikroskobu ile görüntülenmiş ve fiil boyutunu kontrol etmek için ölçüldü. Sonicated fare PFFs 48,8 ölçülen ± 3,1 Nm, insan PFFs ölçülen ise 52,1 ± 4,4 Nm uzunluğu; Her iki türün PFFs bu nedenle uygun uzunlukta (50 nm veya daha az) tohumlama aktivitesi neden oldu. Yaklaşık 500 liflerinde daha kapsamlı muayene sonicated fare liflerinde ortalama uzunluğu ve uzunluğu dağılımı ortaya. Ortalama uzunluğu 44,4 ± 0,6 Nm, PFFs% 86,6 ile 60 Nm veya daha az ölçüm (Şekil 4). Karşılaştırıldığında, insan PFFs ortalama 55,9 ± 1,1 Nm ile 69,6% PFFs ölçme 60 Nm veya daha az (Şekil 4).

Daha önce^3,5, doku bölümlerin bir dizi işlenmiş olduğu gibi fareler içine sonicated fare pffs intrastriatal enjeksiyon takip 2 ay sonrası cerrahi, ne zaman dahil nöronlar içeren sayısı zirve bilinmektedir SNpc, fosforilated α-SYN inlüzyonlar onayı için⁵. Ekleme rulman nöronlar, pSyn için immunohistokimyasal boyama tarafından belirtildiği gibi ( malzeme tablosundaantikor) snpc içinde mevcut (Şekil 7), yanı sıra striatum inleme beyin boyunca diğer bölgeler (anterior koku çekirdeği, motor, cingulate, Piriform, prelimbic, somatoduyusal, entorhinal, ve Insular cortices, amygdala, striatum)^1,3,4,5,19. Bu inlüzyonlar ile benzer özellikleri paylaşır Lewy organları, bağlayıcı Tiyoflavin S, ve direnç toplam α-SYN için proteinaz K (Şekil 7), immunhistokimyasal boyama tarafından gösterilen (antikor ve proteinaz k malzeme tablosu) . Beyin içinde tohumlama onayı in vivo kalite kontrol geçti olduğunu gösterir, ve daha önce dondurulmuş ve aynı toplu kaydedilmiş pffs plakaya aynı parametreler altında sonicated olabilir, uzunlukları ile doğrulanmış, büyük deneyler.

Şekil 1 . Α-SYN fibrils üretimi için yöntemler. Α-SYN monomerinden fibril üretmek için gereken adımların anahattı. Monomerler 10 dakika (15.000 x g, 4 °c ' de) santrifüglü. Supernatant temiz bir tüp transfer edilir ve protein konsantrasyonu ya 280 nm de emici tarafından belirlenir, ya da bir BCA tahlil. Grafik, insan ve fare α-SYN monomerlerin konsantrasyonlarını gösterir. Sütunlar Grup anlamına gelir, hata çubukları ortalaması ± 1 standart hata temsil eder. Protein konsantrasyonu belirlendikten sonra, α-SYN monomerlerin seyreltilmiş, kısaca vortekslenir ve 37 °c için inkübe 7 gün, bir orbital Mikser üzerinde titreyerek 1.000 rpm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2 . Şanzıman Elektron Mikroskopisi için boyama yöntemleri. Elektron mikroskobu için negatif boyama şeması. A) Elektron Mikroskopisi numune ızgaralarını tasvir eden görüntüler. Izgarada donuk veya hafif bir tarafı ve parlak ya da karanlık bir tarafı vardır. Parlak/karanlık tarafı bir formvar/karbon destek filmi ile kaplıdır. B) boyama prosedürü Illustration. Grid 1 dakika için ddH₂O ilk damla üzerinde parlak/karanlık tarafı aşağı yüzen ve aşırı filtre kağıdı ile kötü uzakta. Süreç ddH₂o, seyreltilmiş pffs veya monomerlerin ikinci damla ile tekrarlanan, uranyl asetat iki damla, ve DDH₂o Iki ek damla. ızgaralar görüntülenmiş kadar bir kılavuz kutusunda depolanabilir. Ölçek çubuğu = 3 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Şekil 3 . Özel cam iğne şırıngalar montajı. Cam iğne bağlı şırıngalar birleştirmek için gereken adımlar diyagramı. Silikonized cam kapiller tüpler çekti ve cam iğneler üretmek için ortasında kesilmiş. Shrink wrap tüp metal iğne hazırlamak ve cam iğne metal iğne üzerine kaydırılır zaman bir iç mühür oluşturmak için kullanılır. Cam iğne tabanı ve metal iğne üst üste daraltma Wrap boru iki ek katmanlar ardışık eklenir ve ısı cam iğne güvenli ve su geçirmez bir mühür oluşturmak için uygulanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4 . Α-SYN monomerlerin ve α-SYN liflerinde iletim elektron mikroskobu ile görselleştirme. Α-SYN monomerlerin ve liflerin temsili MİKROGRAFİ. Üst paneller: fare ve insan α-SYN monomer. Orta paneller: tam uzunlukta fare ve insan α-SYN PFFs. alt paneller: fare ve insan α-SYN PFFs sonication sonra. Alt grafik: sonicated fare ve insan α-SYN PFF uzunlukları dağılımı. Ölçek çubuğu = 500 Nm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 5 . Tiyoflavin T tahlil tarafından amiloid yapıların onayı. Fare ve insan α-SYN monomer ve PFF örneklerinden floresan sinyal ölçümü. Sol: fare α-SYN monomerlerin ve α-SYN pffs sonuçları. Sağ: insan α-SYN monomerlerin ve α-SYN PFFs sonuçları. Her grafikte bir dPBS negatif denetimi gösterilir. Tüm ölçümler göreceli floresan üniteleri (RFU) olarak ifade edilir. Sütunlar Grup anlamına gelir, hata çubukları ortalaması ± 1 standart hata temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 6 . Coomassie lekeli jellerden pelletable α-SYN. görüntüler için sedimentasyon tahlil. Gösterilen bantlar yaklaşık olarak 14 kDa protein merdiven dayanmaktadır. Sol: fare monomer ve PFFs. Sağ: Insan monomerleri ve PFFs. Tüm monomer ve pff örnekleri için, resuspended Pelet (P) ve süpernatant (S) gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 7 . Α-SYN patolojisi teyit sıçan modelinde kapanımlar özellikleri. 2 ay sonrası enjeksiyonla kanıtlanmış bir Nigra pars Compacta 'dan temsilci MİKROGRAFİ. Sol: pSyn içeren nöronlar ve kreil menekşe ile Counter,. Orta: Thioflavin S pozitif nöronlar. Sağ: α-SYN-proteinaz K. ölçek çubuğuna dayanıklı inlüzyonlar içeren = 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Tartışma

Nöronlar tohumlama ve Lewy vücut gibi kapanımlar lider yeteneğine α-SYN pffs üretimi birden fazla faktör ve adımlara bağlıdır. Kritik bir faktör, fibriller oluşturmak için kullanılan monomerlerin özel olarak fibrilization^4,9,14,15için formüle edilmesi gerekir. Monomerlerin fibrilasyon için formüle edilmesi durumunda, fibrler form olmayabilir veya form yapan fibriller α-SYN patolojisini üretemebilir. Aynı şekilde, monomerlerin de etkisi fibrilization olan tampon. Bu nedenle, en iyi sonuçlar için, tuz konsantrasyonu yaklaşık 100 mM NaCl ve pH 7,0 ile 7,3 arasında olmalıdır. Değişkenlik sunan bir ilk adım, ilk protein içeriğinin belirlendiği yöntemdir, A280 adresinde ölçüm ile daha doğru sonuçlar elde etmek muhtemeldir ve bu nedenle tercih edilen yöntemdir. Protein konsantrasyonunda tutarsızlık fibrilasyon sürecinin etkinliğini azaltabilir, hem de deneyler kullanılan kabul PFF konsantrasyonu değiştirebilirsiniz. Her ikisi de deneyler arasında tohumlama verimliliği ve toplu varyasyon bir azalma neden olabilir.

İlk kalite kontrol adımları pffs kritik özellikleri teyit edecektir, özellikle onlar bir fibriler konformasyon var (elektron mikroskobu), amiloid yapıları içeren (thioflavin T tahlil), ve pelletable (sedimantasyon assay). Bu Tiyoflavin t tahlil sonuçları zaman ile dalgalanma olacak ve amiloid yapıların miktarı doğrudan bir ölçü değildir dikkat etmek önemlidir, yerine, Tiyoflavin t tahlil sadece içinde amiloid yapıları varlığı bir göstergesi olarak kullanılmalıdır örnek. Thioflavin T tipik olarak kullanılan in vitro asder, gibi yukarıda bahsedilen tahlil liflerinde göstermek için amiloid yapıları içerir. Alternatif olarak, Tiyoflavin S, Şekil 7' de gösterildiği gibi amiloid yapıları tespit etmek için dokuda kullanılır. Sedimentasyon tahlil açısından, sonuçlar sadece PFFs ağırlıklı olarak peletlenebilir fraksiyonda bulunan gösterir. Numuneler denatüre koşullarda çalıştırılıyor gibi, yaklaşık 14 kDa, α-SYN monomerlerin boyutu, tek bir önemli Band, jeller üzerinde mevcut. Bu, bir yerli veya non-denaturing jel kullanıldığında PFFs ile beklenecek yüksek moleküler ağırlıkları mevcut birden fazla bant aksine. Son olarak, bu ilk kalite kontrol adımlarının başarılı bir şekilde geçirilmesi α-SYN dahil olmak üzere tohumlama etkinliğini garanti etmemektedir. Bu nedenle, hücre kültürü deneyleri veya cerrahi olarak enjekte edilen hayvanların küçük bir kohort daha büyük deneyler kullanmadan önce PFFs etkinliğini test etmek için kullanılmalıdır.

Sonication sürecinde önemli bir adımdır ve parametreler kullanılan sonicator modeline bağlı olarak farklılık gösterecektir. Sonication parametreleri uygulanan ve kısa PFF parçaları üretilen göstermek için doğrulanmalıdır. Fibril boyutu, daha kısa liflerinde daha verimli tohumlama ile tohumlama üzerinde taşıyan vardır. Daha kısa fibriller tohum daha verimli olmasına rağmen, bu etkisi yaylaları ve optimum pff uzunluğu yaklaşık 50 nm^4,18. Ayrıca, numunelerin aşırı sıcaklığa düşmesine ve PFFs 'ı aşırı ısıya maruz bırakmayın, bu da tohumlama verimliliğini azaltabilir. Bu sonicated PFFs daha büyük ölçekli deneyler kullanmak için önce küçük hücre kültürü veya in vivo deneyler etkinliği için test edilmelidir. Farklı sonication oturumları değişkenlik tanıtmak potansiyeline sahip olarak, deneysel tedavi grupları buna göre planlanmalıdır.

Pffs in vivo teslim ederken, enjeksiyon site (ler) ve kullanılan toplam miktar pffs lokalizasyonu kapanımlar yanı sıra nörodejenerasyon^7,14ölçüde geliştirecek nöronların sayısını etkileyebilir. Protokoldeki koordinatlar başlamak için bir yer sağlar, ancak istenen hedef bölgenin büyük ölçekli deneylerde kullanımından önce α-SYN patolojisini geliştirmesini sağlamak için laboratuar içinde test edilmelidir. İstenirse, PFFs kullanmadan önce bölgesel hedefleme sınamak için bir yol olarak boya veya floresan boncuklar izleme kullanılabilir. İçinde vivo kullanılan pffs miktarı gruplar arasında değişir, çoğu grup ile 5 ila 20 μg pffs arasında bir toplam kullanarak veya iki enjeksiyon siteleri arasında bölünmüş^{1,2,3,4,5 , 6 , 7 , 14}. enjeksiyon siteleri sayısı, enjeksiyon sitelerin konumu, ve pffs miktarı enjekte sonuçları ve synucleinopati ilerlemesini etkisi olabilir, kullanılan parametrelerin aşağı çıkış sonuçları modeli kullanmadan önce karakterize edilmelidir potansiyel müdahaleleri test edin veya modelin geçici özelliklerini inceleyerek.

Terapiyi test etmek veya hastalık ilerlemesini incelemek için kullanılacak bir model seçerken, kullanılan model sorulan soruya en uygun şekilde cevap vermek için seçilmelidir. Tüm modellerde PD 'nin belirli hastalık özelliklerine sahip olmayacaktır veya potansiyel müdahaleleri test etmek için gereken zaman dilimini sunacaksınız. PFF modeli, PD 'nin α-SYN patolojisi ve Nörodejenerasyon gibi temel özelliklerini yeniden oluşturmaktadır ve mütevazı motor bozukluklara yol açabilir. Model, kapanımlar neurodegeneration önce ay formu öngörülebilir ve uzun süren zaman kursu sunar. Bu, araştırmacıların synucleinopati 'nin uzun süren ilerlemesi boyunca farklı aşamaları incelemesine ve yararlanmasına olanak tanır. Modelin geçerli ve gelecekteki kullanımı, hastalığın ilerlemesi ve yeni tedavilerin geliştirilmesi konusunda faydalı olması bekleniyor.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1x Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu	su Thermo Fisher (Gibco)	14190144
Anti-alfa-sinüklein (serin 129'da fosforile edilmiş) antikoru	Abcam	AB184674
Anti-alfa-sinüklein antikoru	Abcam	AB15530
Bikinkonik asit	Thermo Fisher (Pierce)	PI23228
Şeffaf Tıbbi Shrink Makaron (0.036 "iç çap)	Nordson Medikal	103-0143
Şeffaf Medikal Shrink Makaron (0.044" iç çap)	Nordson Medical	103-0296
Bakır sülfat	Thermo Fisher (Pierce)	PI23224
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	2231000574
Eppendorf ThermoTop ısıtmalı kapak	Eppendorf	5308000003
Formvar/Karbon kaplı elektron mikroskobu ızgaraları	Eletron Mikroskopi Bilimleri	FCF300-Cu
Cam kılcal boru (0,53 mm dış çap; 0,09 mm iç çap; 54 mm uzunluk)	Drummond	22-326223
Cam iğne çektirme	Narishige	PC-10
Hamilton şırınga	Hamilton	80000
Önceden oluşturulmuş fibriller oluşturmak için insan alfa-sinüklein monomeri	Proteos	RP-003
Önceden şekillendirilmiş fibriller oluşturmak için fare alfa-sinüklein monomeri	Proteos	RP-009
Turuncu Medikal Shrink Makaron (0.021" iç çap)	Nordson Medical	103-0152
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7543
Proteinaz K	Invitrogen	25530015
Qsonica 3.2 mm uç	Qsonica	4422
Qsonica Q125 sonikatör	Qsonica	Q125
Thioflavin S	Sigma-Aldrich	T1892
Thioflavin T	EMD Millipore	596200
ToksinSensor Kromojenik LAL Endotoksin Test Kiti	Genscript	L00350C
Uranil asetat	Eletron Mikroskopi Bilimleri	22400