Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

14K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59774

⸱

29 Temmuz 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Translational Neuromedicine, University of Rochester Medical Center, 2Center for Translational Neuromedicine, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Transkraniyal optik görüntüleme, canlı fareler korteks içinde sağlam bir kafatası ile beyin omurilik sıvı taşımacılığı geniş alan görüntüleme sağlar.

Özet

Kemirgenlerde beyin omurilik sıvısı (CSF) akışı büyük ölçüde izleyiciler ex vivo ölçülme kullanılarak incelenmiştir. İki foton mikroskopisi ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi teknikler, CSF akışının in vivo ölçümlemesini sağladı, ancak sırasıyla azaltılmış görüntüleme hacimleri ve düşük uzamsal çözünürlük ile sınırlıdır. Son çalışmalar, CSF 'nin, kemirgen korteksinin pial ve penetran arterlerini çevreleyen perivasküler alanların ağ üzerinden beyin parankimesi girdiğini buldu. Bu perivasküler CSF girişi, glikmiyatik sistemin primer bir sürücüsüdür, toksik metabolik solakların (örn. amiloid-β) temizlenmesinden oluşan bir yol. Burada, floresan CSF izleyicilerini canlı farelerin bozulmamış kafatası ile gerçek zamanlı, mezoskopik görüntüleme sağlayan yeni bir makroskopik görüntüleme tekniği göstermektedir. Bu minimal invazif yöntem, çok sayıda deneysel tasarımı kolaylaştırır ve CSF dinamiklerinin tek veya tekrarlanan testlerini sağlar. Makroskoplar yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüğe sahiptir ve büyük Portal ve çalışma mesafesi davranışsal cihazlarda görev yaparken görüntüleme için izin verir. Bu görüntüleme yaklaşımı, bu teknikten elde edilen iki foton görüntüleme ve floresan ölçümleri ile güçlü bir şekilde ex vivo floresans ve radyo etiketli izleyicileri ölçmek ile ilişkilendirilir. Bu protokolde, canlı farelerde glymphatic taşımacılığı değerlendirmek için Transkraniyal makroskopik görüntülemenin nasıl kullanılabilen olduğunu tarif ediyoruz, daha pahalı görüntüleme yöntemleri için erişilebilir bir alternatif sunuyor.

Giriş

Beyin omurilik sıvısı (CSF) beyinleri ve omuriliği yıkanır ve homeostaz bakımını, besin temini ve intrakranial basıncı düzenleyen1. Subaraknoid uzayda CSF perivasküler boşluklar bir ağ ile beyin girer (PVS) kortikal pial arterlerin çevreleyen ve sonra nüfuz arteriyoller boyunca aşağı akar2. Bir kez parankimat, interstisyel sıvı ile CSF değişimleri (ISF), düşük direnç beyaz madde yolları ve perivenöz alanlar ile beynin dışında amiloid β (Aβ) ve Tau protein agrega gibi zararlı metabolitleri taşıyan2,3 . Bu yol astroglial Aquaporin-4 (AQP4) kanallarına bağlıdır ve bu nedenle glial-lenfatik (glymphatic) sistemi4olarak adlandırılır. Nörofobik atık ürünleri sonunda kraniyal sinirlerin yakınındaki lenfatik damarlardan ve servikal lenf nodlarına doğru meninglerin üzerinden CSF-ıSF ' d a k i temizlenir5. Bu sistemin başarısızlığı, Alzheimer hastalığı6,7, travmatik beyin hasarı3, iskemik ve hemorajik inme8gibi çeşitli nörolojik hastalıklarda karışmıştır.

CSF taşımacılığı, (cm)9,10 ve geçmişte glymphatic çalışmalar özellikle iki foton mikroskopisi4,11,12kullanılmış olan Cisterna içinde izleyicileri infaklama tarafından görselleştirilebilir 13, manyetik rezonans görüntüleme (MRG)14,15,16,17, ve ex vivo görüntüleme3,6,11, 18 . Tracer kinetiği değerlendirmek için. İki foton mikroskobu, PVSs 'deki CSF izleyicileri ve yüksek uzamsal çözünürlüğe bağlı olarak parankimat hakkında ayrıntılı görüntüleme için uygun bir yöntemdir, ancak dar bir bakış alanı vardır ve invaziv bir kafatası penceresi veya kafatası inceltme gerektirir. Ex vivo görüntüleme, immünhistokimya ile birlikte, tek hücrelerden tüm beyin19kadar çok düzeyli analizler sağlar. Ancak, post-mortem doku gözlemlemek için gerekli perfüzyon-fiksasyon süreci CSF akış yönünde derin değişiklikler üretir ve PVS daraltır, önemli ölçüde dağılımı ve izleyicinin konumunu değiştiren12. Son olarak, MRI tüm murine ve insan beyni boyunca CSF akışını izleyebilirken, perivasküler akışın uzamsal ve temporal çözünürlüğüne sahip değildir.

Yeni bir teknik, Transkraniyal makroskopik görüntüleme, canlı farelerin tüm dorsal korteks perivasküler CSF taşıma geniş alan görüntüleme sağlayarak bu sınırlamalar bazı çözer. Bu tür görüntüleme, Multiband filtre küpü, ayarlanabilir LED ışık kaynağı ve yüksek verimli CMOS Kamera10kullanarak bir epifloresan makrokapsam ile yapılır. Bu set-up 1-2 kadar PVSs çözmek edebiliyoruz kafatası yüzeyinin altında mm ve kortikal yüzeyin 5-6 mm kadar fluorophores tespit edebilir kafatası tamamen bozulmamış bırakarak10. Çok bantlı filtreler ve hızlı bir şekilde ayarlanabilir LED 'Ler, CSF 'nin aynı denemede farklı moleküler ağırlıklar ve kimyasal özelliklerin izleyicileri ile etiketlenmesine olanak tanıyan birden fazla fluorophorenin kullanımını sağlar.

Bu prosedür, kafatası ortaya çıkarmak için basit ve minimal invazif bir cerrahi gerektirir ve görüntüleme oturumu sırasında başını stabilize etmek için hafif bir baş plaka yerleştirin. İzleyiciler, kafatası delme veya pipetler veya kanüller ile kortikal doku penetran olmadan cm içine teslim edilebilir9,20. Hem CM kanüller hem de baş plakaları birkaç gün boyunca istikrarlı kalır ve klasik son nokta görselleştirmesine kıyasla daha karmaşık Deneysel tasarımlar kolaylaştırır. Bu protokol, floresan CSF izleyicilerin akut veya kronik enjeksiyonunu takiben anestezik/uyku veya uyanık farelerin CM 'ye doğru, glikmiyatik sistem fonksiyonunu incelemek için Transkraniyal makroskopik görüntülemenin nasıl kullanıldığını açıklar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler, Rochester Üniversitesi 'nde hayvan kaynakları (UCAR, protokol No. 2011-023) üniversite Komitesi tarafından onaylandı ve Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NıH Kılavuzu 'na göre gerçekleştirilir.

1. sarnka Magna kanül, baş plaka ve baş tutucu hazırlanması

  1. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri ve kafa plakalarını sterilize edin.
    Not: floresan izleyiciler doğrudan CSF içine bir sarnısı Magna kanülasyon yoluyla teslim edilir. Bu yordamla ilgili ayrıntılı talimatlar için lütfen Xavier ve Al9' a bakın.
  2. Kısaca, bir iğne sürücüsü kullanarak, bir 30G x 12,7 mm (1/2 inç) iğne, aşağı yol 3/4 ucu kırmak ve polietilen 10 (PE10) boru (yaklaşık 45 cm uzunluğunda) bir ucuna iğne künt ucunu yerleştirin. Sadece eğim PE10 boru kenarlığının dışarı çıkıntılı emin olun.
  3. Break off 1/4 başka bir 30G iğne eğimli ucunu ve PE10 tüp diğer ucuna kalan iğne künt ucunu yerleştirin, plastik Luer-Lock hala bağlı.
  4. 100 μL cam şırıngayı steril, suni CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2Po4, 2 mm MgSO4, 2 mM CAcl2, 10 mm glikoz ve 26 mm NaHCO3) ile doldurun.
  5. Şırıngayı çizginin sonuna takın ve eğimli iğne ucuna ulaşıncaya kadar aCSF ile doldurun. Bir hava sütunu değişken infüzyon hacimlere daha eğilimli olduğu için şırınga, hava değil, aCSF ile geri doldurulur önemlidir.
  6. Kronik deneyler için, hattı aCSF ile dolu bırakın ve adım 1,7 atlayın.
  7. Akut deneyler için, şırınga bir infüzyon pompası üzerine yerleştirin ve yaklaşık 5 mm hava çekme, hangi karıştırma önleyecek. Daha sonra, deneme için istenen toplam izleyici hacmini (ölü alan kayıpları nedeniyle% 20 ekstra tavsiye edilir) geri çekin.
    Not: PE10 boru yeterince uzun olmalıdır böylece hava balonu Tracer yüklerken cam şırınga plastik manşet girmez. Tipik bir deney için, protokol Alexa Fluor 647 (BSA-647) ile% 0,5 ' de acsf seyreltilmiş 10 μL Sığır serum albümin kullanır.
  8. Baş plakasının baş tutucuya uyduğunu ve kullanılan fare için doğru boyutta olduğunu onaylayın. Anatomik belirteçler bu sağlamak için: pencerenin üst sınır interoküler hattı ile hizalar ve posterior sınır oksipital arması rostral düşüyor.
    Not: Paslanmaz çelik kafa plakaları sterilize edilmiş ve yeniden kullanılabilir. Çoğu siyanoakrilat karışımı, bir aseton çözeltisi ile çıkarılabilir.

2. cerrahi prosedür

  1. Tartmak ve fare anestezize (örneğin ketamin/xylazine; 100 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazine; ı.g).
  2. Fare artık bir ayak çimdikine yanıt verdikten sonra, boyun ve kafa steril su ile nemlendirin ve Clippers kullanarak tıraş. Bir kez alan traş, herhangi bir kalıntı saç kaldırmak için tekrar bir alkol çubukla ile alanı silin.
    Not: kırpmadan önce kürk nemlendirme, kesi sonrasında görüntüleme penceresindeki saç miktarını önemli ölçüde azaltır.
  3. Fare, sıcaklık kontrollü bir Pad üzerine bir stereotaktik çerçevede yerleştirin ve onlar kuruması sağlamak için fare gözlerine petrol oftalmik merhem uygulayın.
  4. Bir klorheksidin Swab ile maruz cilt temizleyin. 2 dakika sonra, bir alkol silme ile klorhekidin çıkarın. Son olarak, kurumaya bırakılabilen iyot çözeltisi uygulayın.
  5. Kafatası ve boyun üstüne subkutan analjezi (0,25% Bupivacaine HCl) enjekte.
  6. Boynun oksipital arması kapsayan kısmından başlayarak, aşırı deri içinde bir orta çizgi kesim yapmak ve Interorbital hat doğru rostrally devam. Geçici kas kafatasına ekler sınırına yanal incise. Hem frontal hem de parietal kemikleri ortaya çıkarmak için fusiform kesi tüm cilt çıkarın.
    Dikkat: arkasındaki sinüs gözleri ve posterior yüz ven büyük dalları Pinna için rostral göz kaudal yatıyor. Bu yapıları yedek kesi yaparken dikkatli olun. Bu durumda, birkaç dakika boyunca steril bir pamuklu çubukla hemostaz koruyarak kanamayı durdurun ve devam edin.
  7. Steril tuz ile kafatası irrigate ve bu görüntü kalitesi ile müdahale edecektir çünkü enkaz ve saç ücretsiz böylece yüzey pamuk bezlerden kullanarak temizleyin. Kafatası saydamlığı en iyi periost ve aşırı fasya sağlam bırakarak korunur.
    Not: Bu yapılar yanlışlıkla kaldırılırsa, kafatası zaman içinde kuru ve opak olabilir. ACSF ile yeniden nemlendirin veya akut deneylerde kafatası yansımasını azaltmak için parafin yağı ve gliserol karışımı kullanın21.
  8. Bu prosedürün cerrahi detayları için Cisterna Magna kanül eklemeye devam edin, Xavier ve Al9' a bakın.
  9. CM kanül taktıktan sonra, sınır etrafında baş plaka ventral tarafına siyanoacrylate tutkal ile diş çimento karışımı uygulayın ve böylece kafa plakasının anterior sınır burun kemik ve Po posterior ucu ile hizalar kafatası üzerine yerleştirin sterior sınır, interparietal kemik anterior yönü ile hizalanır, sagittal sütür (orta çizgi) pencere göre ortalanmış ve düz emin olmak (Şekil 1B).
  10. Tutkal Hızlandırıcı birkaç damla kullanarak baş plaka konumunu düzeltin. Çimento karışımı ile kalan boşlukları doldurun ve Hızlandırıcı ile tedavi.
    DIKKAT: siyanoakrilatenin fare gözleri ile temas etmediğini veya görüntüleme penceresini engellemesini sağlayın.
  11. Bu taşıma sırasında veya fare uyanırken ayrılmış hale gelmez emin olmak için baş plaka için CM kanül tutkal.
  12. Akut deneyler için adım 2,16 ' e geçin.
  13. Kronik deneyler için, açık kafatasına ince bir tabakalı siyanoakrilat tutkal uygulayın, bu görüntüleme müdahale edecek gibi kabarcıklar oluşturmak için dikkatli olmak. Tutkal kafatası için koruma sağlar ve görüntüleme ile müdahale etmez. Tutkal maruz kafatası kesi sınırında cilt için tüm yol kapsar emin olun.
  14. Acsf dolu PE10 tüpünü cm 'den 2-3 cm 'ye tutmak için hemostat kelepçe kullanın ve yüksek sıcaklıklı koter ucu ile çizgiyi keser. Bir kez ayrılır, kanül mühür erimiş PE10 boru Düzleştir.
    DIKKAT: kanül mühürleninceye kadar kelepçeyi serbest bırakmayın ve bir bos fistül önlemek için boru içinde hiçbir sızıntı olduğunu teyit emin olun.
  15. Karprofen Yönet (her 24 saat 3 gün boyunca 5 mg/kg; ı.y veya s.c.) ve fareyi sıcaklık kontrollü, tek Konaklı bir kafeye döndürmeniz ve görüntülemenin en az 24 saat önce kurtarmasına izin vermenizi sağlar. Sternal recumbency korumak için yeterli bilinç geri gelene kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Bozulmamış kraniyal pencereler birkaç hafta boyunca istikrarlı kalır.
    Not: kronik deney burada duraklatılabilir.
    DIKKAT: bazı postoperatif komplikasyonlar şunlardır: sefohematom/Subgaleal hematomas, bos fistül, ve enfeksiyon.
  16. Akut deneyler için, kafatasının sabit bir pozisyonda olması için fareyi baş plakasını kullanarak baş tutucuya yerleştirin. Anestezi seviyesini kontrol etmek ve fare altında bir Isıtma Pad yerleştirmek için emin olun. Fare artık makrokapsama götürülmeye hazırdır.
    DIKKAT: fareyi dikkatle bir sepetteki infüzyon pompası ile birlikte taşıma. CM kanülasyon kesilirse, İntrakraniyal basınçta bir damla neden olur ve herhangi bir CSF sızıntısı deneysel sonuçları değiştirecek.

3. fareyi görüntüleme için hazırlama

Not: protokol, görüntüleme denemesinde bir anestezize (adım 3,1 ' de başlangıç) veya uyanık (Step 3,2) faresinde gerçekleştirilecek olup olmadığına bağlı olarak değişir.

  1. Anestezize fareler
    1. Baş tutucuyu makrokapsamın aşamasına yerleştirin, şırınga pompasından CM kanuluna kadar herhangi bir bükülme olmadığından ve bu izleyici infüzyonu etkileyebileceği için gergin olmadığından emin olun.
    2. Solunum hızı ve mukoza zarlarının pembe renklenme gözlemlemek, iyi oksijenasyon gösteren. Gerekirse hidrasyon seviyesini güvenli hale getirmek için tuz subkutan enjekte edilir. Hayvan yeterli anestezize ve yeniden doz gerekirse emin olmak için kontrol edin.
    3. Makrokapsam kamerayı ve LED 'i açın ve LıVE moduna başlayın.
    4. Görüntüleme alanının büyümesini onaylamak için alanın üst kısmındaki nazofrontal sütür ve altta bulunan lambdoid sütür açıkça görüntülenebilir, sagittal sütür paralel ve görüntünün ortasına ortalanır (Şekil 1C). Yerine bir kez, bant ile makrokapsam aşamasında baş tutucu güvenli.
    5. Makrokapsama maruz kalan kafatasına odaklan. Nispeten büyük bir alan derinliğine sahip makroskoplara rağmen, fare kafatasının eğriliği sadece belirli bir alanın odaklanmasını sağlar. En iyi sonuçlar, odak uçağı, koronal sütürler posterior parietal kemiklerin lateral taraflarında bulunduğunda elde edilir.
      Not: Bu, çoğu CSF girişi oluştuğu orta serebral arterlerin (MCA) konumdur (Şekil 1D, E)10.
  2. Uyanık fareler
    1. Görüntüleme seansından önce hayvanların baş plaka cerrahisinde en az 24 saat iyileşmesi için izin verin. Daha uzun kurtarma süreleri (5-7 gün) de önerilir. Bu süre boyunca, kurtarma dönemi süresince günde 0,5-1 h için koruma tüpünde sahnede sabit kafa olmak için fareyi eğitmek.
      Not: habituation fare anestezi olmadan baş tutucuya iliştirilmesi ve gerçek deney sırasında stres ve anksiyete azaltır sağlar. Bu uygulanabilir değilse ve anestezi denemeye müdahale etmez, bir indüksiyon dozu inhale anestezik (örneğin, Isoflurane 2% at 1-2 L/min O2 debi) hızlı bir şekilde baş aşamasına fareyi eklemek için kullanılabilir.
    2. Fare baş tutucuya sabitlendikten sonra ve koruma tüpünün içinde olan Steps 3.1.1-3.1.5.

4. floresan CSF izleyiciler infüzyon

  1. Akut CM kanülasyon
    1. Adım 1,6 içinde Sarnıcı Magna yerleştirilmeden önce izleyici zaten kanül yüklendi beri, istenen oran ve hacim için infüzyon pompası ayarlayın. Rutin olarak kullanılan infüzyon paradigmaları 1-2 μL/dak 'da 5-10 μL 'dir, ancak bu parametreler belirli denemeye veya hayvanın boyutuna ve yaşına bağlı olarak ayarlanabilir.
  2. Kronik CM kanülasyon
    1. Görüntüleme oturumuna başlamadan önce, infüzyon hattını izleyicileri teslim etmek için hazırlamak üzere akut deneyler için 1.2-1.7 adımlarına uyun.
    2. Hat hazırlandıktan sonra, hemostat kelepçe kullanarak kronik CM kanülün mühürlü ucunu kesti. Adım 4.2.1 ' de hazırlanan çizginden iğne alın ve yavaşça kanül içine yerleştirin. Kelepçeyi serbest bırakın ve şırınga pompasını kullanarak, izleme elemanı CM 'de implante edilen iğneye ulaşana kadar, deney için istenen infüzyon oranıyla (örn. 2 μL/dak) CSF izleyici 'yi ilerlet.
      DIKKAT: Eğer iğne, hattı bağlarken boru üzerinden Sapırsa, iğneyi çıkarın, deldi segmenti kesip bu adımı tekrarlayın. PE10 tüpteki herhangi bir gözyaşı bir sızıntı neden olur ve deney sonuçlarını etkiler.

5. Imaging Session kurulumu

  1. İnfaşlık edilen floresan İzleyicine dayanarak, her kanal için uyarma dalga boyu ve pozlama süresini belirleyin. Zaman atlamalı görüntüleme temporal çözünürlüğünü maksimize etmek için izleyici görselleştirmek için gereken en kısa pozlama süresini seçin. Bu pozlama süresi, farklı hayvanlar arasında CSF taşımacılığı karşılaştırmak amaçlayan tüm sonraki deneyler için kullanılacaktır.
    Not: bir ipucu pozlama süresini ayarlamak için CM satırında izleyici kullanmaktır. Bu yararlı bir ilk yaklaşım olsa da, bu zaman içinde optimize edilmelidir.
  2. Denemenin süresini ve görüntülerin elde edilecek aralıklarını seçin. Deney normal olarak son 30-60 arasında en az hangi faz glymphatic taşıma ilgi olduğunu bağlı olarak. 1 kare/dak ve daha hızlı kare hızları çoğu deney için yeterlidir.
  3. Dosya adını ve kaydetme dizinini ayarlayın.
  4. Diğer değişkenlerin eşzamanlı olarak edinilmesi (örn. Elektrokardiyogram, arter kan basıncı, Elektrofizyoloji) yanı sıra görüntüleme toplanacak ise, makrokapsam ve pompa veri edinme yazılımı ile tetiklenecek şekilde programlanabilmektedir. Bir sonraki adıma geçmeden önce makrokapsamdaki tetikleyici fonksiyonunun doğru olup olmadığını kontrol edin.

6. Transkraniyal optik görüntüleme deneyi

  1. İzleyici infüzyon ve görüntüleme aynı anda başlatın.
  2. Herhangi bir sızıntı belirtisi için CM kanülünü ve PE10 tüpünü rutin olarak kontrol edin. CM 'de herhangi bir izleyici sızıntısı varsa, bu denemenin sonuçları hariç tutulmalıdır.
    Not: Tracer serebellum birikmeye başlar ve MCA glymphatic yol seyahat etmez, bu CM kanül beyine enjekte edilmiştir muhtemeldir. Bu veriler eklenmemelidir.
  3. Akut deneyler için, denemenin tamamlandıktan sonra, fareyi mikroskop 'dan çıkarın ve hala yeterli anestezinin olduğunu kontrol edin. Hızlı bir şekilde fareyi dökür ve beyin dokusunu hasat edin. 4 °c ' de bir gecede% 4 civarında formaldehite (PFA) içinde beyni onarın.
    1. Kronik deneyler için, görüntüleme tamamlandıktan sonra, cm çizgisini kanüden çıkarın, steril acsf ile yıkayın ve cm kanülünü yüksek sıcaklıklı koter ucu ile yeniden mühürleyin. Fare baş standı çıkarın ve kafesine geri dönün. Daha fazla görüntüleme gerekli değildir ve sonra adım 6,3 takip kadar bu işlemi yineleyin.

7. veri analizi

Not: CSF ön izleme gibi MATLAB tabanlı analizler, bu görüntüleme veri kümeleri10,22' de Tracer cephede büyük miktarlarda nicel veri ayıklayabilir. Ancak, bu dosya türleri de kolayca ithal ve Fiji23gibi açık kaynak görüntü analiz yazılımı analiz edilebilir.

  1. Bio-formatları içe aktarma aracını kullanarak resim yığınlarını Fiji 'ye aktarın. Bu işlev, zaman ve piksel çözünürlüğünü içeren dosya meta verilerini korur. Görüntü yığını bir. tiff dosyası olarak kaydedin.
  2. Çokgen seçim aracını kullanarak kafatası veya ilgi alanı etrafında bir ilgi bölgesi (YG) el ile çizin. Örneğin, Şekil 1G 'de, travmalı bir beyin yaralanması sonrasında ipsilateral ve kontralateral Yarımküre için ayrı bir YG çekildi. YG 'yi YG yöneticisine (Analiz > Araçları > YG Manager) eklediğinizden emin olun ve kaydedin.
    Not: CSF taşıma iki ana şekilde nicelik olabilir: 1) bir eşik uygulanmadan sonra YG veya Toplam alan (mm2) yüzdesi olarak ifade edilen zaman veya 2) aküle alanı ortalama floresan yoğunluğu. İkinci Yöntem (Şekil 1s) bir sonraki adımda açıklanmıştır.
  3. Eşik seviyesini maksimum floresan ile ayarlayın (görüntü ≫ Adjust ≫ Threshold...). Otsu gibi otomatik eşik yöntemleri normalde CSF Tracer tespit iyi. Eşik uygulayın.
  4. İleriye gitmeden önce, çözümleme ≫ ayarlama ölçümlerinde Seçenekler alanı ve alan kesiri seçili olduğundan emin olun. Sonra YG Yöneticisi'nde, daha fazla > Çoklu ölçüseçin.
  5. % Alan değerini, çıktıda YG 'nin alan değerini kullanarak mm2 olarak dönüştürün. % Alan değerleri, dorsal kortikal yüzeyin yüzde 'ini CSF Tracer ile yansıtır.
  6. Zaman fonksiyonu olarak mm2 ' de CSF Tracer akını arsa.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CSF akım bir epifloresan makrokapsam üzerinde görüntülenmiş (Şekil 1a), murine korteks içinde CSF Tracer taşıma mezoskopik görüntüleme için izin verir. Tüm kafatası kafa plakası, rostral burun kemiklerinin, hem ön hem de parietal kemiklerinin merkezinde ve interparietal kemiğin rostral kısmının (Şekil 1B) görselleştirilmesine izin verir. Görüntüleme sırasında, nasofrontal, sagittal, koronal ve lambdoid sütürler kolayca tespit edilebilir (Şek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ticari olarak mevcut floresan makroskopları ve izleyiciler kullanarak canlı farelerde Transkraniyal CSF görüntüleme yapmak için ayrıntılı bir protokol tarif ettik. Bu teknik basit ve minimal-invaziv, henüz nicel. In vivo görüntüleme, CM tesliminden sonra 3H-dextran ve 14C-inulin ve ex vivo koronal kesit ölçümü10' da dahil olmak üzere radyo etiketli izleyicileri sıvı scintbrilasyon sayımı gibi hassas yöntemlerle de ilişkilendirir. 18 yaşınak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü nörolojik hastalıklar ve Inme ve Ulusal Enstitüsü yaşlanma (ABD Ulusal sağlığı Enstitüleri tarafından finanse edildi; R01NS100366 ve RF1AG057575-MN), Fondation Leducq transatlantik mükemmellik ağları programı ve AB Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı (Grant No. 666881; SVDs @ Target). Biz de grafik çizimler ile uzman yardım için dan Xue teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Bupivakain HCl, Rochester Üniversitesi, Vivarium
100 ve mikro; L Gaz Geçirmez Şırınga Modeli 1710 TLL, PTFE Luer KilidiHamilton Şirketi81020
Sistemleri Dental Çimento TozuFisher ScientificNC9991371
CarprofenRochester Üniversitesi Vivarium
KlorheksidinPrevanticsB10800
CMOS KameraHammamatsuORCA Flash 4.0
Kafa PlakasıRochester ÜniversitesiKatalog yok #Rochester Üniversitesi'ndeki makine atölyesinde özel olarak üretilmiştir
Yüksek Sıcaklık KoteryBovie Medical CorporationAA01
Insta-set HızlandırıcıBob Smith IndustriesBSI-151
İzofluran - FlurisoVet One 502017Rochester Üniversitesi Vivarium
KetaminGüçlü Memorial Hastanesi Eczanesi
Krazy GlueElmer's Products, IncKatalog yok #, yorumlarda bağlantıya bakın
https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG Mikro gözenekli Cerrahi bantFisher Scientific19-027-761
ParaformaldehitSigma-aldrichP6148
PE10 - Polietilen ft başına .011" x .024", 100 ft. sürekliBraintree ScientificPE10 100 FT
Pompa 11 Yalnızca Elit İnfüzyon Çift ŞırıngaHarvard Cihazı70-4501
PURALUBE VET MERHEMDechra
Puritan PurSwab Pamuk Uçlu Temizleme ÇubuklarıFisher Scientific22-029-553
Araştırma Makro Zoom MikroskobuOlympusMVX10
Basit Kafa Tutucu Plaka (fareler için)Narishige International USA IncMAG-1
Tek Kullanımlık İğneler, BD MedicalVWRBD305106
Steril Alkol Hazırlama PedleriFisher Scientific22-363-750
Ayarlanabilir LEDÖNCEKİ Lümen 1600-LED
KsilazinRochester Vivarium Üniversitesi

Kaynaklar

  1. Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
  2. Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
  3. Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
  4. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
  5. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  6. Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
  7. Da Mesquita,, S,, et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  8. Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
  9. Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
  10. Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
  11. Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
  12. Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878(2018).
  13. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  14. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  15. Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
  16. Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
  17. Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
  18. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
  19. Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
  20. Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
  21. Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100(2016).
  22. Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Ren, Z., et al. Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
  25. Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
  26. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434(2017).
  27. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  28. Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
  29. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
  30. Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Glimfatik SistemBOS İzleyici İnfüzyonuPerivasküler AlanlarCisterna Magna KanülüBaş Plakası SabitlemeMakroskobik Görüntüleme
İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.