CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
CRISPR-Cas sistemini kullanarak genom düzenleme, çeşitli organizmaların genomlarını tam olarak düzenleme yeteneğini büyük ölçüde ilerletmiştir. Memeli hücreleri bağlamında, bu teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç temsil eder. Tüm açık okuma çerçevelerini hedefleyen kılavuz RNA'ların (sgRNA) kütüphaneleri, gen fonksiyonunu ve hücresel süreçleri bir tarafsız ve sistematik bir şekilde. CRISPR-Cas ekranlar, araştırmacılara hücresel fenotiplerin genetik planlarını ortaya çıkarmak için basit, verimli ve ucuz bir yöntem sunar. Ayrıca, çeşitli hücre hatları ve farklı kanser türlerinde gerçekleştirilen ekranların diferansiyel analizi tümör hücrelerinde bağlamsal olarak gerekli olan genleri belirleyebilir, belirli antikanser tedavileri için potansiyel hedefleri ortaya koymaktadır. İnsan hücrelerinde genom genişliğinde ekranlar yapmak göz korkutucu olabilir, çünkü bu on milyonlarca hücrenin işlenmesini gerektirir ve büyük veri kümelerinin analizini gerektirir. Hücre satırı karakterizasyonu, CRISPR kitaplık konuları ve analiz sırasında CRISPR teknolojisinin sınırlamalarını ve yeteneklerini anlama gibi bu ekranların ayrıntıları genellikle göz ardı edilir. Burada havuzlu genom çapında CRISPR-Cas9 tabanlı ekranların başarılı performans için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.
Giriş
CRISPR-Cas, kümelenmiş düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar ve CRISPR ilişkili nükleaz ın kısaltması, sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) ile kompleks halinde tek bir nükleaz proteininden (örn. Cas9) oluşur. Bu ribonükleoprotein kompleksi Cas9 enzimini hedef alarak belirli bir genomik lokus1'deçift iplikçikli DNA kırıklarına neden olur. Çift iplikli molalar homoloji yönelimli onarım (HDR) veya daha yaygın olarak, homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yoluyla onarılabilir, sık sık gen fonksiyonunu bozan ekleme ve/veya silme (INDELS) ile sonuçlanan hataya açık bir onarım mekanizması 1. CRISPR'ın etkinliği ve ba....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıda özetlenen deneyler, enstitünün Çevre Sağlığı ve Güvenliği Ofisi yönergelerine uymalıdır.
1. Havuzlu CRISPR sgRNA lentiviral kütüphane plazmid amplifikasyon
- Hazır CRISPR sgRNA plazmid DNA kitaplığını TE'de 50 ng/μL'ye seyreltin (örn. TKOv3).
- Elektro-yetersiz hücreleri kullanarak kütüphaneyi elektroporate. Aşağıda açıklandığı gibi toplam dört elektroporasyon reaksiyonu ayarlayın.
- 2 μL 50 ng/μL TKO kitaplığına 25 μL çözülmüş elektroyit hücrelerini önceden soğutulmuş cuvettelere (1,0 mm) buz üzerinde ekleyin.
- Üreticiprotokolü tarafından önerilen optimum ayarları kullanarak elektroporate. Darbenin 1....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Genom ölçeğinde CRISPR tarama iş akışına genel bakış
Şekil 1, tek entegrasyon olayları ve yeterli kütüphane gösterimi (genellikle 200- 1000) sağlamak için düşük bir MOI CRISPR kütüphane lentivirus ile hedef hücrelerin enfeksiyonu ile başlayan, havuzlu CRISPR tarama iş akışı genel bir bakış göstermektedir -katlayın). Enfeksiyon dan sonra, hücreler transduced hücreler için seçmek için.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kullanım kolaylığı ve yüksek esnekliği sayesinde CRISPR teknolojisi hassas genom düzenleme için tercih edilen bir araç olarak yaygın olarak benimsenmiştir. Havuzlu CRISPR taraması, tek bir deneyde binlerce genetik tedirginliği sorgulamak için bir yöntem sağlar. Havuzlu ekranlarda, sgRNA kitaplıkları moleküler barkod görevi görehizmet eder, çünkü her dizi benzersizdir ve hedeflenen genle eşlenir. Genomik DNA'nın hücre popülasyonundan izole edilmesiyle, ilgi fenotipine neden olan genler, sgRNA bolluğunun yeni nesil dizilem.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Teşekkürler
Bu çalışma Genom Kanada, Ontario Araştırma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (MOP-142375, PJT-148802) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 mikron filtre | |||
| 30 derece; C plaka inkübatörü | |||
| 37 & derece; C çalkalama inkübatörü | |||
| 37° C, %5 CO2 inkübatörü | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE tamponu | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hidroklorik asit çözeltisi | BioShop | HCL666.500 | |
| %95 Etanol | |||
| Alamar mavisi | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Mavi ışık transilluminatörü | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Sığır Serumu Albümini, Isı Şoku İzolasyonu, Fraksiyon V. Min. %98, Biyoteknoloji sınıfı | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco'nun Eagles Orta Yaşam Teknolojilerinin Modifikasyonu | 11995-065 | Cel kültür ortamı | |
| Elektroporasyon küvetleri | BTX | 45-0134 | |
| Elektroporatör | BTX | 45-0651 | |
| Endura elektroyetkin hücreler | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Sığır Serumu | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T paketleme hücreleri | ATCC | CRL-3216 | tavsiye edilen geçiş numarası < 15 |
| Heksadimetrin Bromür (Polibren) | Sigma | H9268 | İletim verimliliğini artırmak için katyonik polimer |
| Heksadimetrin Bromür (Polibren) | |||
| Karbenisilinli | |||
| Karbenisilinli | |||
| Düşük moleküler ağırlıklı DNA merdiveni | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spektrofotometre | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | İndirgenmiş serum ortamı |
| Plazmid maksi saflaştırma kiti | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (zarf plazmidi) | Addgene | Plazmid #12259 | lentiviral sistem |
| psPAX2 (paketleme plazmidi) | Addgene | Plazmid #12260 | lentiviral sistem |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick jel ekstraksiyon kiti | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR testi | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit florometre | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C geri kazanım ortamı | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Güvenli DNA jel lekesi | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR kitaplığı (TKOv3) - Cas9 dahil | Addgene | Addgene ID # 90203 | Genom çapında CRISPR kütüphanesi, Cas9, 71,090 sgRNA içerir |
| Toronto KnockOut CRIPSR kütüphanesi (TKOv3) - cas9 olmayan | Addgene | Addgene ID #125517 | Genom çapında CRISPR kütüphanesi, Cas9 olmayan, 71.090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) çözeltisi, pH8.0 | |||
| UltraPure agaroz | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomik DNA saflaştırma kiti | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfeksiyon reaktifi | Roche | 06 365 809 001 | Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi |
Kaynaklar
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
