CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
CRISPR-Cas sistemini kullanarak genom düzenleme, çeşitli organizmaların genomlarını tam olarak düzenleme yeteneğini büyük ölçüde ilerletmiştir. Memeli hücreleri bağlamında, bu teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç temsil eder. Tüm açık okuma çerçevelerini hedefleyen kılavuz RNA'ların (sgRNA) kütüphaneleri, gen fonksiyonunu ve hücresel süreçleri bir tarafsız ve sistematik bir şekilde. CRISPR-Cas ekranlar, araştırmacılara hücresel fenotiplerin genetik planlarını ortaya çıkarmak için basit, verimli ve ucuz bir yöntem sunar. Ayrıca, çeşitli hücre hatları ve farklı kanser türlerinde gerçekleştirilen ekranların diferansiyel analizi tümör hücrelerinde bağlamsal olarak gerekli olan genleri belirleyebilir, belirli antikanser tedavileri için potansiyel hedefleri ortaya koymaktadır. İnsan hücrelerinde genom genişliğinde ekranlar yapmak göz korkutucu olabilir, çünkü bu on milyonlarca hücrenin işlenmesini gerektirir ve büyük veri kümelerinin analizini gerektirir. Hücre satırı karakterizasyonu, CRISPR kitaplık konuları ve analiz sırasında CRISPR teknolojisinin sınırlamalarını ve yeteneklerini anlama gibi bu ekranların ayrıntıları genellikle göz ardı edilir. Burada havuzlu genom çapında CRISPR-Cas9 tabanlı ekranların başarılı performans için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.
Giriş
CRISPR-Cas, kümelenmiş düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar ve CRISPR ilişkili nükleaz ın kısaltması, sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) ile kompleks halinde tek bir nükleaz proteininden (örn. Cas9) oluşur. Bu ribonükleoprotein kompleksi Cas9 enzimini hedef alarak belirli bir genomik lokus1'deçift iplikçikli DNA kırıklarına neden olur. Çift iplikli molalar homoloji yönelimli onarım (HDR) veya daha yaygın olarak, homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yoluyla onarılabilir, sık sık gen fonksiyonunu bozan ekleme ve/veya silme (INDELS) ile sonuçlanan hataya açık bir onarım mekanizması 1. CRISPR'ın etkinliği ve basitliği, önceki genom düzenleme teknolojilerini (örneğin, çinko parmak çekirdekleri (ZNF) veya transkripsiyon aktivatör benzeri efektör çekirdekleri aşan daha önce ulaşılmaz bir genomik hedefleme düzeyisağlar ( TALENS), her ikisi de artan tasarım karmaşıklığı muzdarip, düşük transfection verimliliği, ve multipleks gen düzenleme sınırlamaları2].
CRISPR tek kılavuzLu RNA tabanlı genom düzenleme temel araştırma uygulaması bilim adamları verimli ve ucuza bireysel genlerin işlevlerini ve genetik etkileşim ağlarının topoloji sorgulamak için izin verdi. Özellikle RNA paraziti (RNAi) ve gen kapanı mutagenezi gibi daha önceki genetik pertürbasyon teknolojileri ile karşılaştırıldığında, crispr-Cas sisteminin kullanımı yla fonksiyonel genom çapındaki ekranlar gerçekleştirebilme yeteneği büyük ölçüde artırılmıştır. Özellikle, RNAi yüksek off-hedef etkileri ve eksik nakavt muzdarip, CRISPR göre daha düşük duyarlılık ve özgüllük sonuçlanan3,4,5, gen tuzak yöntemleri haploid sadece uygulanabilir iken fonksiyon kaybı ekranlar için hücreler, sorgulanabilir hücre modellerinin kapsamını sınırlayan6. CRISPR'ın tam gen nakavtı üretme yeteneği, mutant fenotipleri sorgulamak için daha biyolojik olarak sağlam bir sistem sağlar, düşük gürültü, minimum hedef dışı etkiler ve reaktifler arasında tutarlı aktivite5. Tüm insan genomunu hedefleyen CRISPR-Cas9 sgRNA kütüphaneleri artık yaygın olarak mevcuttur, tek bir deneyde binlerce gen nakavtının aynı anda üretilmesine izinverir 3,7,8,9 .
Toronto Knock-out (TKO) kütüphaneleri (Addgene aracılığıyla temin edilebilir) adı verilen ve yüksek çözünürlüklü genomik ekranları kolaylaştırmak için kompakt ve dizi optimize edilmiş benzersiz CRISPR-Cas9 genom çapındaki sgRNA lentiviral kütüphaneler geliştirdik. En son kütüphane, TKOv3, hedef ~ 18,000 insan protein kodlama genleri ile 71.090 kılavuzları ampirik veri10kullanarak düzenleme verimliliği için optimize edilmiştir. Buna ek olarak, TKOv3 tek bileşenli bir kütüphane olarak kullanılabilir (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) tek bir vektör üzerinde Cas9 ve sgRNA'ları ifade ederek, geniş bir yelpazede genom çapında nakavt sağlayan, kararlı Cas9 ifade eden hücreler üretme ihtiyacını hafifleterek memeli hücre tipleri. TKOv3 cas9 olmadan bir vektör de mevcuttur (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID # 125517) ve Cas911ifade hücrelerde kullanılabilir.
Genom çapında crispr-Cas9 düzenlenmiş hücre popülasyonu farklı büyüme koşullarına maruz kalabilir, zaman içinde sgRNA bolluğu yeni nesil sıralama ile ölçülür, izlenebilir genetik hücrelerin terk veya zenginleşmesi değerlendirmek için bir okuma sağlayan tedirginlikler. CRISPR nakavt kütüphaneleri, tedirginlik üzerine hücresel fitness bozukluklarına, orta derecede ilaç duyarlılığına (örneğin, hassas veya dirençli genler) neden olan, protein ekspresyonunu (örn. muhabir) düzenleyen veya belirli bir yol fonksiyonu ve hücresel durum12,13,14. Örneğin, bir kanser hücresi hattında diferansiyel fitness ekranları hem tükenmesi veya onkogenlerin azaltılması ve zenginleştirme veya tümör bastırıcıgenler genlerin bir artış tespit edebilirsiniz3,14,15. Benzer şekilde, terapötik ilaçların ara dozlarda kullanarak hem ilaç direnci ve duyarlılık genleri ortaya çıkarabilir16,17.
Burada verilen genom ölçekli CRISPR-Cas9 fonksiyon kaybı tarama için ayrıntılı bir tarama protokolü Toronto Knock-out kütüphaneleri kullanarak (TKOv1 veya v3) kütüphane nesil memeli hücrelerde, veri analizi için tarama performansı. Bu protokol Toronto Knock-out kitaplıkları kullanılarak tarama için optimize edilmiş olsa da, uygulanabilir ve tüm CRISPR sgRNA havuzlu kütüphaneler için ölçeklenebilir hale.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıda özetlenen deneyler, enstitünün Çevre Sağlığı ve Güvenliği Ofisi yönergelerine uymalıdır.
1. Havuzlu CRISPR sgRNA lentiviral kütüphane plazmid amplifikasyon
- Hazır CRISPR sgRNA plazmid DNA kitaplığını TE'de 50 ng/μL'ye seyreltin (örn. TKOv3).
- Elektro-yetersiz hücreleri kullanarak kütüphaneyi elektroporate. Aşağıda açıklandığı gibi toplam dört elektroporasyon reaksiyonu ayarlayın.
- 2 μL 50 ng/μL TKO kitaplığına 25 μL çözülmüş elektroyit hücrelerini önceden soğutulmuş cuvettelere (1,0 mm) buz üzerinde ekleyin.
- Üreticiprotokolü tarafından önerilen optimum ayarları kullanarak elektroporate. Darbenin 10 s içinde, cuvette için Kurtarma Orta (veya SOC orta) 975 μL ekleyin.
- Elektrohaplı hücreleri bir kültür tüpüne aktarın ve 1 mL Kurtarma Ortamı ekleyin. 37 °C'de 1 saat için 250 rpm bir sallayarak inkübatör tüpleri.
- Kitaplığı titretlemek ve dönüşüm verimliliğini tahmin etmek için bir seyreltme plakası ayarlayın.
- 8 mL'lik tüm hücreleri birleştirin ve iyice karıştırın. Havuzlanmış hücrelerin 10 μL'sini 800 kat seyreltme için 990 μL'lik Kurtarma Ortamı'na aktarın ve iyice karıştırın.
- Önceden ısıtılmış 10 cm LB + carbenicillin (100 μg/L) agar plaka üzerine seyreltmenin 20 μL'si. Bu dönüşüm verimliliğini hesaplamak için kullanılacak dönüştürücülerin 40.000 kat seyreltilmesi ile sonuçlanır.
- Toplam 20 önceden ısıtılmış 15 cm LB + carbenicillin agar plakası boyunca her plakaüzerinde kurtarılan hücrelerin plaka400 μL' si. Plakaları 30 °C'de 14-16 h'ye inkübedin.
NOT: Bu düşük sıcaklıktaki büyüme, uzun terminal tekrarları (LTR)18arasındaki rekombinasyon en aza indirir. - Dönüşüm verimliliğini hesaplamak için, 40.000 kat seyreltme plakası üzerindeki koloni lerin sayısını sayın (adım 1.3.2). Tüm plakalarda toplam koloni sayısını elde etmek için 40.000 ile sayılan kolonilerin sayısını çarpın. Toplam koloni sayısı sgRNA başına en az 200x koloniye eşdeğer bir kitaplık kapsamını temsil ediyorsa devam edin (en uygun u500-1000x).
- Örneğin, TKOv3 kütüphanesi (71.090 sgRNA) için en az koloni numarası 1.4 x 107'dirve bu sayı sgRNA başına 200x koloniye eşittir. Koloni temsili yetersizse, minimum kütüphane kapsamını elde etmek için seyreltme plakasındaki kolonilerin sayısına bağlı olarak 1.2.
- Aşağıda açıklandığı gibi kolonileri hasat
- Her 15 cm plaka için, 7 mL LB + carbenicillin (100 μg/L) orta ekleyin, sonra bir hücre yayıcı ile kolonileri kazıyın. 10 mL'lik pipetle, kazınmış hücreleri steril 1 L konik şişeye veya şişeye aktarın.
- Bir kez daha 5 mL LB + carbenicillin orta ile plakayı durulayın ve çözeltiyi şişeye aktarın.
- Tüm tabaklar için 20 tabaktan steril bir şişeye hücreleri bir araya getirin.
- Toplanan hücreleri oda sıcaklığında 1 saat (RT) boyunca bir karıştırma çubuğuyla karıştırarak hücre kümelerini ayırın. Hücreleri önceden tartılmış santrifüj şişelerine ve 7.000 x g'de pelet bakterisine aktarın, sonra da ortamı atın.
- Isliç hücre peletini tartın ve ıslak peletin son ağırlığını belirlemek için santrifüj şişesinin ağırlığını çıkarın. Her sütunun işleyebileceği bakteriyel pelet miktarına bağlı olarak bir maxi veya mega ölçekli plazmid arıtma kiti kullanarak plazmid DNA arındırın.
2. Büyük ölçekli CRISPR sgRNA kütüphane lentivirus üretimi
NOT: Protokolün bu bölümündeki tüm adımlar Sınıf II, Tip A2 biyogüvenlik kabininde bir BSL2+ tesisinde gerçekleştirilir.
- Virüs üretimi için gereken 15 cm plaka sayısını, genellikle 15 cm'lik bir plakadan 18 mL virüs hasat edildiği tahminine göre hesaplayın.
- Hek-293T ambalaj hücrelerini düşük antibiyotikli büyüme ortamlarında (DMEM + FBS + isteğe bağlı: 0,1x kalem/strep) 15 cm'lik plaka başına 8 x 106 hücrede 20 mL'lik ortama tohumlayarak hücreleri transfeksiyona hazırlayın. 37 °C, %5 CO2'de
<
- <
- <
- <
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Genom ölçeğinde CRISPR tarama iş akışına genel bakış
Şekil 1, tek entegrasyon olayları ve yeterli kütüphane gösterimi (genellikle 200- 1000) sağlamak için düşük bir MOI CRISPR kütüphane lentivirus ile hedef hücrelerin enfeksiyonu ile başlayan, havuzlu CRISPR tarama iş akışı genel bir bakış göstermektedir -katlayın). Enfeksiyon dan sonra, hücreler transduced hücreler için seçmek için...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kullanım kolaylığı ve yüksek esnekliği sayesinde CRISPR teknolojisi hassas genom düzenleme için tercih edilen bir araç olarak yaygın olarak benimsenmiştir. Havuzlu CRISPR taraması, tek bir deneyde binlerce genetik tedirginliği sorgulamak için bir yöntem sağlar. Havuzlu ekranlarda, sgRNA kitaplıkları moleküler barkod görevi görehizmet eder, çünkü her dizi benzersizdir ve hedeflenen genle eşlenir. Genomik DNA'nın hücre popülasyonundan izole edilmesiyle, ilgi fenotipine neden olan genler, sgRNA bolluğunun yeni nesil dizilem...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Teşekkürler
Bu çalışma Genom Kanada, Ontario Araştırma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (MOP-142375, PJT-148802) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 mikron filtre | |||
| 30 derece; C plaka inkübatörü | |||
| 37 & derece; C çalkalama inkübatörü | |||
| 37° C, %5 CO2 inkübatörü | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE tamponu | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hidroklorik asit çözeltisi | BioShop | HCL666.500 | |
| %95 Etanol | |||
| Alamar mavisi | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Mavi ışık transilluminatörü | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Sığır Serumu Albümini, Isı Şoku İzolasyonu, Fraksiyon V. Min. %98, Biyoteknoloji sınıfı | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco'nun Eagles Orta Yaşam Teknolojilerinin Modifikasyonu | 11995-065 | Cel kültür ortamı | |
| Elektroporasyon küvetleri | BTX | 45-0134 | |
| Elektroporatör | BTX | 45-0651 | |
| Endura elektroyetkin hücreler | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Sığır Serumu | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T paketleme hücreleri | ATCC | CRL-3216 | tavsiye edilen geçiş numarası < 15 |
| Heksadimetrin Bromür (Polibren) | Sigma | H9268 | İletim verimliliğini artırmak için katyonik polimer |
| Heksadimetrin Bromür (Polibren) | |||
| Karbenisilinli | |||
| Karbenisilinli | |||
| Düşük moleküler ağırlıklı DNA merdiveni | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spektrofotometre | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | İndirgenmiş serum ortamı |
| Plazmid maksi saflaştırma kiti | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (zarf plazmidi) | Addgene | Plazmid #12259 | lentiviral sistem |
| psPAX2 (paketleme plazmidi) | Addgene | Plazmid #12260 | lentiviral sistem |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick jel ekstraksiyon kiti | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR testi | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit florometre | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C geri kazanım ortamı | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Güvenli DNA jel lekesi | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR kitaplığı (TKOv3) - Cas9 dahil | Addgene | Addgene ID # 90203 | Genom çapında CRISPR kütüphanesi, Cas9, 71,090 sgRNA içerir |
| Toronto KnockOut CRIPSR kütüphanesi (TKOv3) - cas9 olmayan | Addgene | Addgene ID #125517 | Genom çapında CRISPR kütüphanesi, Cas9 olmayan, 71.090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) çözeltisi, pH8.0 | |||
| UltraPure agaroz | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomik DNA saflaştırma kiti | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfeksiyon reaktifi | Roche | 06 365 809 001 | Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi |
Kaynaklar
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164(2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
- Pedregosa, F. V., G,, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213(2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554(2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
