Geçerli protokol, hasta tarafından türetilen xenograft (PDX) modelleri ve cerrahi mide kanseri örneklerinden primer kanser hücresi hatları oluşturmak için yöntemleri açıklar. Yöntemleri ilaç geliştirme ve kanser Biyoloji araştırma için yararlı bir araç sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Tümör biyolojisi anlayışımızı ilerletmek ve terapötik ajanların etkinliğini araştırmak için preklinik modellerin kullanımı kanser araştırmalarının anahtarıdır. Birçok kurulan mide kanseri hücre hatları ve preklinik araştırma için birçok konvansiyonel transgenik fare modelleri olmasına rağmen, bu in vitro ve in vivo modellerin dezavantajları uygulamalarını sınırlandırmak. Bu modellerin özellikleri kültürde değiştiği için, artık tümör heterojenliğini modellemez ve cevapları insanlarda yanıt tahmin edememiştir. Böylece, tümör heterojenliğini daha iyi temsil eden alternatif modeller geliştirilmektedir. Hasta tarafından türetilen xenograft (PDX) modelleri kanser hücrelerinin histolojik görünümünü korur, intratümöral heterojenliği korur ve tümör mikroortamının ilgili insan bileşenlerini daha iyi yansıtır. Ancak, genellikle birçok mide hastalarının beklenen hayatta kalmasının daha uzun bir PDX modeli geliştirmek için 4-8 ay sürer. Bu nedenle, primer kanser hücresi hatları kurulması ilaç tepkisi çalışmaları için etkili bir tamamlayıcı yöntem olabilir. Geçerli protokol, cerrahi mide kanseri örneklerinden PDX modelleri ve primer kanser hücresi hatları oluşturmak için yöntemleri açıklar. Bu yöntemler ilaç gelişimi ve kanser biyoloji araştırmaları için yararlı bir araç sağlar.
Giriş
Mide kanseri dünya çapında beşinci en yaygın kanser ve kanser ölümü üçüncü önde gelen nedenidir. 2018 yılında, 1.000.000 üzerinde yeni mide kanseri vakaları küresel olarak teşhis edildi ve bu hastalık1' de tahmini bir 783.000 kişi öldürüldü. Gastrik kanserinin insidansı ve mortalite kuzeydoğu Asya ülkelerinde çok yüksek kalır2,3. Kanser terapileri alanında önemli ilerlemelere rağmen, gelişmiş mide kanseri olan hastaların prognoz yoksul kalır, beş yıllık hayatta kalma oranı yaklaşık 25%4,5,6, 7'ye kadar. Böylece, mide kanseri için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi için acil bir ihtiyaç vardır
Mide kanserinin tedavisi, yüksek heterojenlik8,9nedeniyle zordur. Böylece, hassas tıp gerçekleştirmek için tümör heterojenlik zorlukları nasıl ele almak için soru kanser araştırma merkezidir. İn vitro ve in vivo modellerde, mide kanserinin heterojen mekanizmaları ve Biyolojisi ile ilgili önemli roller oynatılıyor. Ancak, çok sayıda mide kanseri hücre hatları ve preklinik araştırma için birçok konvansiyonel transgenik fare modelleri olmasına rağmen, bu modellerin dezavantajları uygulamalarını sınırlamak10. Çünkü bu modellerin özellikleri kültür değişti, onlar artık model tümör heterojenlik, ve onların cevapları insanlarda yanıt tahmin etmek mümkün olmamıştır11. Bu sorunlar, hedeflenen ilaçlara yanıt verecek kanser hastalarının alt gruplarını tanımlama olasılığını ciddi olarak sınırlandırır. Primer tümörlerin kısa vadeli kültürü, antikanser farmakolojik özelliklerini araştırmak için nispeten hızlı ve kişiselleştirilmiş bir yol sağlar ve bu da kişiselleştirilmiş kanser tedavisinin damgasını olacak.
Hasta türevi ksenogreft (pdxs), uyuşturucu tepkisi için alternatif bir preklinik model olarak tercih edilir12. Buna ek olarak, PDX modelleri kanserin başlatılması ve ilerlemesini incelemek için güçlü bir araç sunuyor13,14. PDX modelleri kanserli hücrelerin histolojik görünümünü korur, intratümöral heterojenliği korur ve tümör mikroortamının ilgili insan bileşenlerini daha iyi yansıtır15,16. Ancak, yaygın olarak kullanılan PDX modellerinin sınırlandırılması, insan katı tümörlerinin kurulması ve seri olarak yayılması için düşük başarı oranıdır. Bu çalışmada, PDX modelleri ve primer hücre hatları kurmak için terbiyeli başarılı yöntemler açıklanmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu insan çalışması, Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi (SYSUCC, Guangzhou, Çin) kurumsal etik Inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Hayvan çalışması Sun Yat-sen Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Not: tüm deneyler, kan kaynaklı patojenlere karşı mesleki maruz kalma koruması için kılavuz dahil olmak üzere ilgili yasalar ve kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.
1. numune hazırlama
- Mide kanseri dokularına (P0 = Passage 0) doğrudan operasyondan elde edilir. Tümör numunesi 0,5 cm3' ten büyük olmalıdır.
- Hazırlamak 3-4 mL stok çözüm: Örneğin, RPMI-1640 Orta (1x) ile tamamlayıcı 10% fetal Sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin ve 0,1 mg/mL streptomisin.
- Taze tümör numunesi 4 saat boyunca 4 °C ' de stok-solüsyona koyun.
2. PDX modelinin kurulması (Şekil 1)
- Steril bir cerrahi alan sağlamak için, hayvan laboratuvarına transferden önce 30 dakikadan fazla ultraviyole ışığı olan tüm materyalleri dezenfekte edin.
Not: operasyon odasının, 30 dakika boyunca ultraviyole ışık ile dezenfekte edilmesi gerekir, biz Dikloro isocyanurik asit sodyum suppositoria dezenfektan ile masa temizlemek önce. Sonra povidone-iyot cildi dezenfekte etmek için kullanılır. - Forseps ve makas kullanarak, dikkatle tümör dokularını incelemek ve birkaç küçük parçalar halinde onları kırpmak (yaklaşık 1 mm3 küpler) steril koşullarda.
- Anestezi makinesi ile 1-1,5% Isoflurane maruz tarafından kadın 5-7 hafta-eski NOD-SCID-IL2rg (NSG) fareler anestezize.
- O mücadele durur ama hatta nefes tutar kadar fare anestezize.
Not: 50 mL tüp bir anestezi makinesine benzer fonksiyonlar basit bir ekipmandir. Kısa çalışma süresi nedeniyle kuruluğu önlemek için veteriner göz merhem kullanımı gereksiz.
- O mücadele durur ama hatta nefes tutar kadar fare anestezize.
- Steril makas kullanarak hem dorsal kanatlarda 1 cm kesi yapın ve fare her kanadında bir tümör parçası implanta.
- Tümör parçası dışarı kayma değil emin olmak için, subkutan doku bozmak için steril forseps kullanın. Sonra, tümör dokusu bir parça klip ve derin siteye yerleştirin.
- İmplant alanını Cerrahi dikiş iğneleri ile subkutan sütür ile kapatın ve fare kulaklarını etiketli kulak etiketleriyle işaretleyin
- Yarayı iyot ile sterilize edin.
- Yavaşça ameliyat sonrası boş bir kafeste fareler yerleştirin sternal recumbency korurken. Fareler durumuna yakın dikkat; uyanıp yaklaşık 3-4 dakika sonra yürümeye başlar. Ameliyata tabi olmayan başka bir yeni kafeste ameliyat edilen fareler yerleştirin.
- İmplantasyon sitesinin palpasyonu ile tümör boyutunu değerlendir. Haftada iki kez bir Vernier Kaliper ile tümörleri ölçün.
- Tümör çapı 10 mm ulaştığında, hayvan durumu kötüleşir, ya da tümör ülserler, bir ıRB onaylı yöntemi ile fare ötenize. Taze tümör parçalarını, geçiş için 2 yeni fareye yerleştirin veya birincil hücre hatlarının izolasyonu için PBS 'de numuneleri geçici olarak depolayın.
3. doku ağoprezervasyon
Not: Bu bölüm öncelikle canlı doku kiti Cryo Kit yöntemleri başvuruyor. Ana Kit ve ekipmanlar malzeme tablosundalistelenmiştir.
- Tümörün çapı 10 mm 'den büyük olduğunda, ıRB onaylı bir yöntem ile fareler ötenize.
- Steril forseps ve makas kullanarak, yavaşça farelerden tümör izole.
- 10 cm 'lik bir tabak içinde DPBS ile tümör dokularına yıkayın. Nekrotik alanları, yağ dokusu, kan pıhtıları ve forseps ve makas ile bağ dokusu sökme ve kaldırma.
- Tümör dokularını bir kalıp ile maksimum 1 mm kalınlığına keser.
- 10 cm 'lik bir tabak içinde DPBS ile dilimleri yıkayın.
Not: vitrifikasyon işlemi 3.6-3.8 adımda v1/v2/v3 etiketli tüplerin kullanımını içerir. Ana maddeler DMSO ve sakaroz vardır. - Dilimleri forseps ile tüp v1 'e aktarın ve tüpü 4 °C için 4 ° c 'ye Inkümerleyin. tüpün kısa bir süreliğine yuvarlayın ve tersine çevirin ve 4 dakika daha 4 °C ' ye yerleştirin.
- 10 cm çanak içine v1 çözüm ve dilimleri dökün. Dilimleri forseps ile tüp v2 içine aktarın ve 4 ° c için 4 °C ' de tüp v2 'yi Inküye. tüp kısa bir süreliğine yuvarlayın ve ters çevirin ve 4 dk. 4 °C ' ye yerleştirin.
- 10 cm tabak içine v2 çözüm ve dilimleri dökün. Dilimleri forseps ile tüp v3 içine aktarın ve 5 dakika boyunca 4 °C ' de tüpün kulbatın. tüpün kısa bir süre içinde yuvarlayın ve ters çevirin ve en az 5 dakika boyunca 4 °C ' ye yerleştirin. dilimlerin tüm tüpün altına batırılmasını sağlayın.
- Birkaç dilim yüzen kalırsa, tüpü kısa bir süreliğine yuvarlayın ve ters çevirin ve tüm dilimler tamamen batırılana kadar tüpü 4 °C ' ye tekrar yerleştirin; gerekirse, yüzen dilimleri atın.
- V3 solüsyonu ve dilimleri 10 cm 'lik bir çanak içine dökün.
- Uygun uzunlukta doku tutucular kes ve steril gazlı bez üzerine yerleştirin. Dilimleri tutucular üzerine aktarın. Tutucular gazlı bez ile sarın ve onları forseps kullanarak sıvı azot içine yerleştirin, ardından 5 dakika boyunca kuluçç.
- Kriyojenik şişeleri doku bilgileri ile etiketleyin.
- Doku dilimleri ile tutucular, sıvı nitrojen içinde saklanan kriyojenik şişeleri içine aktarın.
4. Primer hücrelerin yalıtımı (Şekil 2)
- 121 °C ' de 30 dakika yüksek basınçlı buharla forseps ve makas sterilize edin.
- Mide kanseri örneklerini rezeke edilen örneklerden veya hasat edilen PDX dokularından reect. Dokuları buzun üzerine yerleştirin ve dokuları 10 cm steril kültür yemeğine aktarın.
- Nekrotik alanları, yağ dokusu, kan pıhtıları ve forseps ve makas ile bağ dokusu sökme ve kaldırma.
- 10 cm 'lik bir çanak içinde 100 U/mL penisilin ve 0,1 mg/mL streptomisin içeren DPBS ile tümör dokularına bir kez yıkayın.
- Tümör dokusunu 1 mm3 adet çanak kapağında keser; Her parçanın maksimum kalınlığı 1 mm olmalıdır.
- Yaklaşık 7 ml tip 1 kolajenaz ve tripsin (1:14) çözeltisi ile dokuları 50 ml santrifüjle tüpüne aktarın. Karışımı kısa bir süre Vortex.
- Tüp bir su banyosunda 37 °C ' de 30-40 dk. her 5 dakikada bir karışımı Vortex.
- Tüp için% 10 FBS ile tamamlayıcı RPMI-1640 Orta (1x) eşit hacim ekleyin. Karışımı iyice Vortex.
- Bir 40 μm filtre ile yavaş filtrasyon ile yeni bir 50 mL santrifüj tüpü içine karışımı aktarın.
Not: kanser hücrelerinin daha yüksek bir oranı sağlamak için 40 μm filtreler kullanın. Gerekirse, 100 μm filtreler immunolojik hücreler gibi daha fazla hücre türünü korumak için kullanılabilir. - Süzgecler 113-163 x g 'de 5-7 dk için RT 'de santrifüjler. dikkatle supernatant çıkarın.
- PBS 5 ml ile Pelet yıkayın ve dikkatle supernatant çıkarın.
- Pelet kırmızı ise, birçok eritrositler içerir. 500 μL kırmızı kan hücresi liziz tampon ile Pelet yavaşça yeniden pelletini. 5 dk inkübasyon sonra, 5 mL PBS ekleyin ve dikkatle supernatant kaldırın.
- Kültür orta ile Pelet resuspend ve steril 10 cm çanak karışımı aktarın.
- Orta her 2-3 gün serum içeren orta ile değiştirin.
- Eğer% 50 Confluence ulaştığında Trypsin/EDTA kullanarak birincil hücreler Passage.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada, bir operasyondan tümör dokularında bir sonraki adıma kadar stok çözümde korunmuş. 4 saat içinde, tümör dokularında küçük parçalar halinde kesilmiş ve Isoflurane-ıslatılmış pamuk kullanılarak anestezize edilmiş NSG fareler dorsal kenar içine implante edildi. 1 cm 'den büyük tümörler, yeni farelere implantasyon için (Şekil 1) veya dikkatle dilimlenmiş ve protokol sonrasında sıvı nitrojen içinde korunmuş olabilir. Bu çalışmada, ilk nesil tümörler daha sonra nesiller boyunca d...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mide kanseri, sınırlı terapötik seçeneklere sahip agresif bir hastalıktır; Böylece, mide kanseri modelleri klinik4,8,17doğrudan çeviri ile işlevsel araştırma çalışmaları sağlamak için kritik bir kaynak haline gelmiştir. Burada, mide kanseri PDX modelleri ve primer hücre hatları kurma yöntemlerini ve protokolünü tarif ettik. Daha da önemlisi, gastrik kanser örneklerinin hem morfolojik hem de biyolojik özellikleri çoğunlukla PDX m...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81572392) tarafından desteklenmektedir; Çin Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı (2016YFC1201704); En iyi bilimsel ve teknik yenilikçi gençlik yetenekleri Guangdong özel destek programı (2016TQ03R614).
Biz özellikle rakamlar hazırlanması yardım için Guangzhou Sagene Biotech Co, Ltd teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 40 μ m Hücre Süzgeci | Biologix, Shandong, Çin | 15-1040 | |
| Biyolojik Mikroskop | OLYMPUS, Tokyo, Japonya | OLYMPUS CKX41 | |
| Santrifüj | Eppendorf, Mittelsachsen, Almanya. | 5427R | |
| CO2 İnkübatörü | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kaliforniya, ABD | HERACELL 150i | |
| DPBS | Basalmedia Technology, Şangay, Çin | L40601 | |
| Elektro-Termostatik Su Dolabı | Yiheng, Şangay, Çin | DK-8AXX | |
| Fetal sığır serumu | Wisent Biotechnology, Vancouver, Kanada | 86150040 | |
| Isofluran | Baxter, Çin | CN2L9100 | |
| Canlı Doku Kiti Cryo Kiti | Celliver Biyoteknoloji, Şangay, Çin | LT2601 | |
| Canlı Doku Çözme Kiti | Celliver Biotechnology, Şangay, Çin | LT2602 | |
| NSG | Biyositojen, Pekin, Çin | B-CM-002-4-5W | |
| Penisilin ve streptomisin | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, ABD | 15140122 | |
| Kırmızı kan hücresi lizis tamponu | Solarbio, Pekin, Çin | R1010 | |
| RPMI-1640 orta | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, ABD | 8118367 | |
| İplikli Cerrahi Sütür İğneleri | LingQiao, Ningbo, Çin | 3/8 ark 4 kez; 10 | |
| Doku ile işlenmiş kalıplar ve yardımcı bıçaklar | Celliver Biotechnology, Şangay, Çin | LT2603 | |
| Tripsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, ABD | 2003779 | |
| Tip 1 kollajenaz | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, ABD | 17100017 |
Kaynaklar
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. Ca-a Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Sugano, K. Screening of gastric cancer in Asia. Best Practive & Research in Clinical Gastroenterology. 29 (6), 895-905 (2015).
- Nikfarjam, Z., et al. Demographic survey of four thousand patients with 10 common cancers in North Eastern Iran over the past three decades. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (23), 10193-10198 (2014).
- Coccolini, F., et al. Advanced gastric cancer: What we know and what we still have to learn. World Journal of Gastroenterology. 22 (3), 1139-1159 (2016).
- Goetze, O. T., et al. Multimodal treatment in locally advanced gastric cancer. Updates in Surgery. 70 (2), 173-179 (2018).
- Graziosi, L., Marino, E., Donini, A. Multimodal Treatment of Locally Advanced Gastric Cancer: Will the West Meet the East? Annals of Surgical Oncology. 26 (3), 918(2019).
- Choi, Y. Y., Noh, S. H., Cheong, J. H. Evolution of Gastric Cancer Treatment: From the Golden Age of Surgery to an Era of Precision Medicine. Yonsei Medical Journal. 56 (5), 1177-1185 (2015).
- Zhang, W. TCGA divides gastric cancer into four molecular subtypes: implications for individualized therapeutics. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (10), 469-470 (2014).
- Tirino, G., et al. What's New in Gastric Cancer: The Therapeutic Implications of Molecular Classifications and Future Perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
- Roschke, A. V., et al. Karyotypic complexity of the NCI-60 drug-screening panel. Cancer Research. 63 (24), 8634-8647 (2003).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Xu, C., et al. Patient-derived xenograft mouse models: A high fidelity tool for individualized medicine. Oncology Letters. 17 (1), 3-10 (2019).
- Lai, Y., et al. Current status and perspectives of patient-derived xenograft models in cancer research. Journal OF Hematology & Oncology. 10 (1), 106(2017).
- Kawaguchi, T., et al. Current Update of Patient-Derived Xenograft Model for Translational Breast Cancer Research. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 131-139 (2017).
- Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Research. 75 (15), 2963-2968 (2015).
- Liu, X., Meltzer, S. J. Gastric Cancer in the Era of Precision Medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (3), 348-358 (2017).
- Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. (7), Cold Spring Harbor. 694-708 (2014).
- McDermott, S. P., et al. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma (c) (null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Wege, A. K., et al. Co-transplantation of human hematopoietic stem cells and human breast cancer cells in NSG mice: a novel approach to generate tumor cell specific human antibodies. MAbs. 6 (4), 968-977 (2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
