Yöntem makalesi

Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması

11.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59876

⸱

12 Eylül 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Virology, School of Systems Biology, George Mason University, 2American Type Culture Collection (ATCC), 3ATCC Cell Systems, 4Ceres Nanosciences, Inc, 5Department of Immunology and Nano-medicine, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, ev çökeltme, yoğunluk gradyan ultracentrifugation ve parçacık yakalama birleştirerek yüksek verimlilik ve verim ile virions uzak hücre dışı veziküller (EVs) izole aerodinamik bir iş akışı ve başlangıç bir azalma sağlamak için tüm EV araştırmalarında kullanılmak üzere tekrarlanabilir preparatlar ile sonuçlanan hacim gereksinimleri.

Özet

Bir ekstrasellüler vezikül alanında önemli engellerden biri (EV) araştırma bugün viral bir enfeksiyon ortamında saflaştırılmış EV preparatları elde etmek için yeteneğidir. Sunulan yöntem, evleri virions'lardan (yani HIV-1) izole etmek ve geleneksel ultrasantrifüj yöntemlerine göre daha yüksek verimlilik ve verim sağlamak için tasarlanmıştır. Protokolümüz üç adımdan oluşur: EV çökeltme, yoğunluk gradyan ayırma ve parçacık yakalama. Downstream tahlilleri (yani, Western blot ve PCR) parçacık yakalama dan sonra doğrudan çalıştırılabilir. Bu yöntem, minimum başlangıç hacimlerinin kullanımına izin verdiği için diğer yalıtım yöntemlerine (örn. ultracentrifugation) göre avantajlıdır. Ayrıca, birden fazla ultrasantrifüj adımı gerektiren alternatif EV yalıtım yöntemlerinden daha kullanıcı dostudur. Ancak, sunulan yöntem bizim parçacıklardan bozulmamış EVs eute zor olduğu gibi fonksiyonel EV tahlilleri kapsamında sınırlıdır. Ayrıca, bu yöntem kesinlikle araştırma tabanlı bir ortama göre uyarlanmıştır ve ticari açıdan uygun olmayacaktır.

Giriş

Araştırma ekstrasellüler veziküller etrafında merkezli (EVs), özellikle ekzozomlar, 30-120 nm arasında değişen ve üç tetraspanin belirteçleri CD81, CD9 ve CD63 varlığı ile karakterize EV türü, büyük ölçüde izole etmek ve yöntemlerinin geliştirilmesi ile şekillenmiştir ilgi vezikülleri arındırmak. Çok yönlü mekanizmaları inceleme yeteneği, çok çeşitli içeriklere, boyutlara ve farklı yollardan üretilen heterojen vezikül popülasyonundan oluşan örnekler üreten karmaşık ve zaman alıcı teknikler nedeniyle engellenmiştir. Yoğun -luğunu. Bu hemen hemen tüm EV araştırma için bir sorun olmakla birlikte, virions ve virüs benzeri parçacıklar (VLPs) ilgi vezikülleri çapı benzer olabilir gibi, viral enfeksiyon bağlamında EVs incelerken özellikle önemlidir. Örneğin, İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) yaklaşık 100 nm çapında, kabaca evs birçok türde aynı boyuttadır. Bu nedenle, bu sorunları gidermek için yeni bir EV yalıtım iş akışı tasarladık.

EV izolasyonunun mevcut altın standardı ultrasantrifüjdür. Bu teknik çeşitli vezikül yoğunlukları kullanır, hangi veziküller her aşamada daha düşük yoğunluklu parçacıklar karşı yüksek yoğunluklu parçacıkların diferansiyel sedimantasyon ile santrifüj ile ayrılmasını sağlar 1,2. Bozulmamış hücreleri (10 dk için 300-400 x g), hücre enkazı (10 dk için~2.000 x g) ve apoptotik cisimler/büyük vezikülleri (10 dk için~10.000 x g) kaldırmak için birkaç düşük hızlı santrifüj adımı gereklidir. Bu ilk arıtmalar yüksek hızlı ultracentrifugation (100.000-200.000 x g 1.5-2 h) tortu EVs tarafından takip edilir. Yıkama adımları daha fazla EV saflık sağlamak için yapılır, ancak, izole EVs sayısının azaltılması bu sonuç, böylece toplam verim düşürücü 3,4. Bu yöntemin yardımcı programı, yeterli sonuçlar elde etmek için çok sayıda hücre (yaklaşık 1 x 108)ve büyük bir numune hacmi (> 100 mL) gereksinimi ile daha da sınırlıdır.

Artan endişeleri gidermek için, hidrofilik polimerler ile veziküllerin yağış son yıllarda yararlı bir teknik haline gelmiştir. Polietilen glikol (PEG) veya diğer ilgili çökeltme reaktifleri, kullanıcının numune içindeki vezikülleri, virüsleri ve protein-RNA agregalarını sadece tercih edilen reaktifle kuluçkaya yatırarak ve ardından tek bir düşük hız agregasını aşağı çekmesine olanak tanır. santrifüj1,2,5. Daha önce peg veya ilgili yöntemlerin kullanımı nın geleneksel ultrasantrifüj sonuçlarına kıyasla EV'leri çökertmek için önemli ölçüde daha yüksekverim6 olduğunu bildirmiştik. Bu strateji hızlı, kolay, ek pahalı ekipman gerektirmez, kolayca ölçeklenebilir ve EV yapısını korur. Ancak, bu yöntemin promiscuous doğası nedeniyle, ortaya çıkan örnekler serbest proteinler, protein kompleksleri, EV'ler bir dizi ve böylece istenilen popülasyon elde etmek için daha fazla saflaştırma gerektiren virions dahil olmak üzere çeşitli ürünler içerir1 ,2,7,8.

Çeşitli yağış yöntemlerinden elde edilen EVs heterojenliği aşmak için, yoğunluk gradyan ultracentrifugation (DG) yoğunluğuna göre parçacıkları daha iyi ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, iodixanol veya sakaroz gibi, eVs'lerin proteinlerden, protein komplekslerinden ve virüs veya virüs benzeri parçacıklardan (VLP) ayrılmasına olanak tanıyan bir yoğunluk gradyan ortamı kullanılarak adım adım gradyan kullanılarak gerçekleştirilir. Bir zamanlar DG'nin EV alt popülasyonlarının daha kesin ayrılmasına izin verdiği düşünülse de, çeşitli veziküllerin boyutlarının ve yoğunluklarının örtüştüğü bilinmektedir. Örneğin, ekzozomların yüzdürme yoğunlukları 1.08-1.22 g/mL9olarak bilinirken, Golgi'den izole edilen veziküllerinyoğunluğu 1.05-1.1.12 g/mL ve endoplazmik retikulum (COPII+ ) 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9de tortu . Ayrıca, eğer bir viral parçacıklar içeren fraksiyonları karşı ekzozomal kesirler karşılaştırmak için arzu, bu ilgi virüsün yoğunluğuna bağlı olarak daha zor olabilir-hiv-1 dışında virüsler var ki büyük olasılıkla aynı dengelemek ekzozomal pozitif kesirler2 olarak yoğunlukları .

Son olarak, downstream görselleştirme ve fonksiyonel tahliller için EV preps zenginleştirme EV araştırma için hayati önem taşımaktadır. EV zenginleştirici nano tanecikleri kullanımı, özellikle, çapı 700-800 nm aralığında çok fonksiyonlu hidrojel parçacıkları, konsantre EV preps ulaşmada kritik bir adımdır. Onlar seçicilik teşvik etmek için gözenekli bir dış sieving kabuk tarafından kapsüllenmiş yüksek bir affinity aromatik yem sahip. Bu çalışmada kullanılan nano partiküller farklı çekirdek yemleri (Reaktif Kırmızı 120 NT80; ve Cibacron Mavi F3GA NT82) çeşitli reaktifler ve biyoakışçılar DAN EVs yakalama artırmak için göstermiştir iki farklı preparatlar içerir (Malzemeler Tablosu bakınız )6,10,11,12,13,14,15. Parçacıklar iodixanol fraksiyonları, hücre kültürü supernatant yanı sıra plazma, serum, serebral spinal sıvılar (BOS) veidrar6 gibi hasta biyosıvıları da dahil olmak üzere çok sayıda başlangıç malzemelerinden EVs kolay zenginleştirme sunuyoruz,13 .

Burada sunulan yöntem çeşitli teknolojileri birleştirerek mevcut EV arıtma tekniklerinin verimliliğini artırır; EV yağış, yoğunluk gradyan ultracentrifugation, ve parçacık yakalama, iş akışını kolaylaştırmak için, örnek gereksinimlerini azaltmak, ve tüm EV araştırmalarında kullanılmak üzere daha homojen bir EV örnek elde etmek için verimi artırmak. Bu yöntem, büyük, istenmeyen vezikülleri ve VLP'leri dışlamak için 0,22 μm filtrasyon adımı içerdiğinden ve toplam EV popülasyonunun yoğunluğuna göre etkin bir şekilde ayrılmasını içerdiğinden, bu yöntem viral enfeksiyon sırasında evlerin ve içeriğinin araştırılmasında özellikle yararlıdır. EVs'leri virions'tan izole edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Ekstrasellüler Veziküllerin Filtrasyonu ve Çökeltisi (EVs)

  1. Enfekte veya transfekte hücrelerden (örn. hücre hatları ve/veya birincil hücreler) kültür supernatant hazırlamak için, kültür yaklaşık 10 mL geç günlük hücreleri 5 gün boyunca 37 °C ve 5% CO2 uygun kültür ortamı (yani, RPMI veya DMEM ile% 10 fetal sığır serum [FBS]).
    NOT: Tüm kültür orta reaktifleri EVs'siz olmalı ve 90 dk için 100.000 x g'da serumun önceden ultrasantrifüjasyonu ile satın alınabilir (Bkz. Malzeme Tablosu)veya şirket içinde hazırlanabilir. Bu protokol, CEM, Jurkat, 293T, U937 (enfekte olmayan hatlar), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 ve HTLV-1 enfekte hatları), birden fazla transfected hücre ve primer miyeloid ve T hücreleri (her ikisi de dahil olmak üzere birçok yaygın olarak kullanılan hücre hatları için başarılı olmuştur enfekte ve enfekte olmayan); ancak, bu protokol, özel ortam veya kültür koşulları gerektirenler de dahil olmak üzere herhangi bir hücre türü için kullanılabilir. Hücrelerin yoğunluğu farklı hücre türleri için optimize edilmesi gerekebilir. En yüksek yoğunluğun 5 gün sonra en az hücre ölümü ile kullanılması önerilir.
  2. 3.000 x g'de kültürü 5 dk boyunca pelet hücrelerine santrifüj edin ve peletatın.
  3. Steril 0,22 μm filtre kullanarak kültür supernatant filtre ve temiz bir tüp içinde filtrat toplamak.
  4. Filtrelenmiş supernatant'a eşit hacimli PEG çökeltisi (1:1 oranı) ekleyin. Homojen bir karışım sağlamak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
    NOT: GIRdap YAPMAYIN.
  5. Gece leme (O/N) 4 °C'de kuluçka karışımı.
  6. Merkezci karışım 1.500 x g oda sıcaklığında 30 dakika (RT) heterojen bir EV pelet verim.
    NOT: EV pelet beyaz veya off-beyaz renkli görünmelidir.
  7. EV-tükenmiş kültür supernatant atın.
  8. 150-300 μL 1x fosfat tamponlu tuzlu kalsiyum ve magnezyum olmadan EV pelet resuspend ve buz üzerinde tutmak.

2. Yoğunluk Gradyanı nın Yapımı

  1. Şekil 1A'dagösterildiği gibi ayrı mikrosentrifuge tüplerde %1,2'lik artışlarda 11 farklı 1 mL yoğunluk fraksiyonu oluşturmak için 1x PBS ile iodixanol yoğunluk gradyan ortamını karıştırın.
  2. Girdap her tüp karıştırmak için.
  3. Katman yoğunluğu fraksiyonları önceden temizlenmiş ve kuru sallanan kova ultracentrifuge tüp içine kesir #18 başlayan ve şekil 1B'debelirtildiği gibi kesir #6 ile biten .
    NOT: Tüm tüpler% 10 çamaşır suyu spreyi ile dezenfekte su ile 3x durulama ve degrade kesirler yüklemeden önce steril deiyonize su son bir yıkama ile takip dezenfekte edilmelidir.
  4. Ultracentrifuge tüpündeki katmanlı degradenin üst kısmına yeniden askıda EV peleti (300 μL) ekleyin.
  5. Ultracentrifuge 100,00 x g 4 °C'de 90 dk.
  6. Ultracentrifuge tüpünden 1 mL fraksiyonu dikkatlice çıkarın ve her bir fraksiyonu yeni mikrosantrifüj tüplere aktarın.

3. EV Fraksiyonlarının Zenginleşmesi uUsing Nano tanecikleri

  1. Eşit hacimlerde NT80, NT82 ve 1x PBS kullanarak nano partiküllerin %30'luk bir bulamaç oluşturun.
    NOT: Karışım homojenliği sağlamak için kullanılmadan önce girdap olmalıdır.
  2. Yoğunluk fraksiyonları ve pipet içeren her mikrocentrifuge tüpe bulamaç 30 μL ekleyin / karıştırmak için birkaç kez ters.
  3. EV zenginleştirici nanopartikül içeren yoğunluk fraksiyonu mikrosantrifüj tüpleri O/N'yi 4 °C'de yaklaşık 20 rpm'de döndürün.
  4. Sentrifüj yoğunluk fraksiyonu mikrosantrifüj tüpler 20.000 x g 5 dk RT için.
  5. Sıvıyı atın ve EV peletini 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    NOT: Nanopartikül peletler -20 °C'de dondurulabilir veya hemen çeşitli downstream tahlilleri (pcr, western blot, kütle spektrometresi ve diğer tahliller) için kullanılabilir.

4. Downstream Tahliller için Nanopartikül Pelet Önerilen Hazırlanması

  1. RNA yalıtımı için
    1. 0,2 μm filtreden filtrelenmiş %0,001 dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılan 50 μL'lik otoklavlı deiyonize sudaki peleti yeniden askıya alın ve kit üreticisinin protokolüne göre RNA'yı izole edin.
  2. Jel elektroforez için
    1. Laemmli tampon 15 μL doğrudan pelet resuspend.
    2. Isı numunesi 35 °C'de 3 dk. Girdap yavaşça ve her ısı döngüsü arasında aşağı doğru döner.
    3. 20.000 x g'de 15 s için santrifüj numune stoğu ve doğrudan jel üzerine tüm eluted malzeme yükleyin.
      NOT: En iyi sonuçlar için jelüzerine yüklenen partikülmiktarını sınırlayın ve kalan parçacıkların kuyulara içerdiğinden emin olmak için jeli 100 V'da çalıştırın.
  3. Tripsin sindirimi için
    1. Alkillenme den önce üre 20 μL pelet resuspend ve örnek tripsinizasyon. Nano partiküller 10 dk. Triptotlu peptid içeren numune 14.000 x g santrifüj ile temiz bir toplama tüpüne aktarılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PEG yağış EV verimi artar


Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ana hatlarıyla kullanılan yöntem, gelişmiş EV verimi ve virüsün izolasyona kombinasyon yaklaşımı kullanarak EV'lerden ayrılmasına olanak tanır. Nispeten büyük miktarlarda başlangıç malzemesi (örn. hücre süpernatantı) EV izolasyonundan önce çökelme, DG ayrıştırma ve nanopartikül zenginleştirme ile filtrelenebilir ve bu da ~30 μL'lik son bir hacimle sonuçlanabilir ve bu da çeşitli alanlarda hemen kullanıma olanak sağlar. downstream tahlilleri. Nanopartikül zenginleştirme kullanımı, geleneksel ultrasantrifüj ile karşılaştır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

B.L., bu makalede kullanılan reaktifler ve/veya enstrümanlar üreten Ceres Nanosciences inc. şirketine bağlıdır. Diğer tüm yazarlar olası çıkar çatışmaları beyan etmez.

Teşekkürler

Keşançi laboratuvarının tüm üyelerine teşekkür etmek istiyoruz, özellikle Gwen Cox'a. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibeleri (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 ve NS099029 to F.K.) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CEM CD4+ HücreleriNIH AIDS Reaktif Programı117Ca
ve Mg içermeyen CEM DPBS (1x)Kalite Biyolojik114-057-101
ExoMAX Opti-EnhancerSistemleri BiyolojikBilimler EXOMAX24A-1PEG çökeltme reaktifi
Eksozom Tükenmiş FBSThermo Fisher ScientificA2720801
Fetal Sığır SerumuTepe SerumPS-FB3Serum
HIV-1 enfekte U937 HücreleriNIH AIDS Reaktif Programı165U1
Nalgene Şırınga Filtresi 0.2 ve mikro; m SFCAThermo Scientific723-2520
Nanotrap (NT80)Ceres NanosciencesCN1030Reaktif Kırmızı 120 çekirdekli
Nanotrap (NT82)Ceres NanosciencesCN2010Cibacron Blue F3GA çekirdek
Optima XE-980 UltrasantrifüjBeckman CoulterA94471
OptiPrep Yoğunluk Gradyan OrtaSigma-AldrichD1556-250mLIodixanol
SW 41 Ti Sallanan Kovalı RotorBeckman Coulter331362
Ultra Şeffaf Tüp, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059

Kaynaklar

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653(2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139(2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765(2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24(2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132(2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542(2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695(2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396(2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169(2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362(2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156(2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre D Vezik l Safla t rmaVir s Ayr t rmaPEG PresipitasyonuYo unluk Gradyan ile Ayr t rmaNanopartik l Zenginle tirmeUltrasantrif j ProtokolWestern Blot AnaliziPCR TespitiEV Verim Art r mHIV 1 Kontaminasyonu

İlgili makaleler