Method Article

Manuel Multiplex floresan Immünhistokimya 'da optimizasyon, tasarım ve kaçınarak tuzaklar

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplex floresan immünhistokimya, bozulmamış formalin-sabit, parafin katıştırılmış (FFPE) dokusu içinde birden fazla hücre türlerinin görselleştirilmesini sağlayan gelişmekte olan bir teknolojidir. Sunulan başarılı bir 7-renk Multiplex antikor ve reaktifler optimize etmek için talimatlar, slaytlar, tasarım ve ortak sorunları önlemek için ipuçları hazırlanması sağlamak için yönergeler vardır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre infiltrasyonu ve mekansal organizasyon analizi için bozulmamış doku mikroçevre değerlendirilmesi hastalık süreçlerinin karmaşıklığını anlamakta esastır. Geçmişte kullanılan prensip teknikleri, 1 ile 4 işaretçileri arasında zaman içinde bir anlık görüntü olarak hücrelerin görselleştirilmesini sağlayan immünhistokimya (ıHC) ve immünofluoresesans (IF) içerir. Her iki teknik de kötü antijenik hedefler ve çapraz türler reaktivite ile ilgili sınırlamalar boyama zorluk dahil eksiklikleri var. IHC güvenilir ve reproducible, ancak kimyasal ve görünür ışık spektrumuna güven doğası sadece birkaç işaretçileri kullanılmak üzere sağlar ve Co-yerelleştirme zorlu yapar. If kullanımı potansiyel işaretçileri genişletir, ancak genellikle formalin fikreasyon aşağıdaki geniş doku otofloresans nedeniyle dondurulmuş doku dayanır. Akış cytometri, birden fazla epiton eşzamanlı etiketleme sağlayan bir teknik, IF ve IFC eksiklikleri birçok CPAP, ancak, tek bir hücre süspansiyon olarak hücreleri incelemek için ihtiyaç önemli biyolojik atarak hücrelerin uzamsal bağlamı kaybeder Ilişki. Multiplex floresan immünhistokimya (mfihc) Bu teknolojiler, genel mikroçevre mimarisi ve mekansal koruyarak formalin sabit parafin gömülü (ffpe) doku Multi-epitope hücresel fenotiplemeyi için izin köprüler bozulmamış doku içinde hücrelerin ilişkisi. Yüksek floresan yoğunluğu fluorophores bu kovalently doku epitopu bağ türü belirli çapraz reaktivite ikincil antikorlar endişe etmeden primer antikorların birden fazla uygulama sağlar. Bu teknoloji hastalığın çalışması için güvenilir ve doğru görüntüler üretmek için kanıtlanmış olmasına rağmen, yararlı bir mfIHC boyama stratejisi oluşturma süreci zaman alıcı ve kapsamlı optimizasyon ve tasarım nedeniyle titiz olabilir. Doğru hücresel etkileşimleri temsil eden ve manuel analiz için optimizasyon süresini azaltmak için sağlam görüntüler yapmak amacıyla, burada sunulan slayt hazırlama, antikorlar, Multiplex tasarım yanı sıra hataları optimize etmek için Yöntemler genellikle boyama işlemi sırasında karşılaşılan.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bozulmamış bir tümör mikroortamının (TME) görselleştirilmesi, sadece katı malignitelerde hücresel infiltrasyonu değil, hücrenin hücre etkileşimlerini de değerlendirmede esastır. Multiplex floresan immünhistokimya (mfihc) kanser ve ilişkili hastalıklar çalışmada hücrelerin Multi-antijen fenotiplemeyi için etkili bir araç olarak ortaya çıkmıştır1,2,3,4, 5,6,7. Bu, büyük veri setleri analiz etmek için tasarlanmış yeni yazılım ve programlar ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm çalışmalar Michigan Üniversitesi 'nin iç İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. birincil antikorlar ve slayt hazırlama optimizasyonu

  1. Konvansiyonel ıHC kullanarak Multiplex için antikor ideal konsantrasyonu belirleyin.
    1. Multiplex için antikorları manuel konvansiyonel immünhistokimya (ıHC)13ile test edin.
    2. Her antikor için bol hücre tipine sahip belirli dokulara, CD3 antikor testi için Bademcik dokusu kullanma gibi test edilir.
    3. Şirket tarafından önerilen ıHC için referans konsantrasyonu kullanın ve daha sonra önerilen konsantrasyonlarda antikor konsantrasyonları yanı sıra yuk....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

7-renkli Multiplex assay alma genel süreci tekrarlayan bir desen izler. Şekil 1 , bir grafiksel formunda işlemi açıklar. Bir kez slaytlar kesilmiş ve kurutulur veya laboratuvardan alınır ve 1 h için 60 °c ' de bir hibridizasyon fırında pişmiş, daha sonra deparafinizasyonda ve rehidrasyon devam, yeniden antijen alma tarafından takip formalin slaytlar düzeltin. Her yuvarlak çoğullama antikor kaldırma (Şekil 1) üzerinde antijen alma ve bitirir başlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Katı tümör biyopsisi ve cerrahi rezeksiyondan gelen bozulmamış doku örnekleri, hasta prognoz yanı sıra hastalık analizi için önemli tanı ve öngörü araçları olarak kalır. Multiplex floresan immünhistokimya (mfIHC), immünhistokimya (ıHC), immünofluoresesans (IF) ve akış sitometri avantajlarını birleştiren yeni bir tekniktir. Bir doku ortamında hücre-hücre düzenlemeleri değerlendirilmesi için izin var situ hücre prob önceki yöntemleri8, ancak, probed olabilir epitenler düşük sayıda karmaşık analiz sı.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Perkin Elmer daha önce Ed Stack teşekkür etmek istiyorum, kurulum ve orijinal Multiplex boyama optimizasyonu ile onun yardımı için. Yazarlar da analiz yazılımı kullanarak ipuçları için Akoya Biosciences gelen Kristen Schmidt teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Kanser Sağlık Enstitüleri tarafından ödül numarası P30CA046592, K08CA201581 (TLF), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC) altında desteklenmektedir. CA170568 (HC). İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez. Ek destek Jeffery A. Colby Colon Ca....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
%100 etanolFisherHC8001GAL
%70 etanolFisherHC10001GL
%95 etanolFisherHC11001GL
Analiz yazılımıAkoya BiosciencesCLS135783inForm sürüm 2.3.0
Antifade mountantThermoFisherP36961ProLong
Elmas Engelleme çözümüVektörSP-6000Bloxall Sığır
Serumu Albümini (BSA)Sigma Yaşam BilimleriA9647-100G
Kapak FişleriFisher12-548-5E
Hassas görev mendiliKimberly-Clark34120
Floresan seyrelticiAkoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA seyreltici
Florofor 520Akoya Biyolojik BilimlerFP1487001KT1:100
Florofor 540Akoya Biyolojik BilimlerFP1494001KT1:100
Florofor 570Akoya Biyolojik BilimlerFP1488001KT1:100
Florofor 620Akoya Biyolojik BilimlerFP1495001KT1:100
Florofor 650Akoya Biyolojik BilimlerFP1496001KT1:100
Florofor 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Florofor DAPIAkoya BiosciencesFP1490TBST veya PBS'de 3 damla
Isıya dayanıklı kutuTissue-Tek25608-904Plastik sürgülü kutu-yeşil
Nemlendirilmiş OdaIbi ScientificAT-12
Hibridizasyon fırınıFisherBiotech
Hidrofobik bariyer kalemiVektörH-4000ImmEdge
MikroskobuPerkin ElmerCLS140089Mantra kantitatif patoloji iş istasyonu
İnverter teknolojilimikrodalgaPanasonicNN-A661S
Nötr tamponlu formalinFisher ScientificSF100-4%10 nötr tamponlu formalin
pH 6 antijen alma tamponuAkoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 antijen alma tamponuAkoya BiosciencesAR900AR9
Fosfat tamponlu salinFisherBP3994PBS
Plastik kayar kutuTissue-Tek25608-906
Plastik sargıFisherNC9070936
Polisorbat 20FisherBP337-800Tween 20
Birincil antikor CD163LeciaNCL-LCD1631:400
Birincil antikor CD3DakoA04521:400
Birincil antikor CD8Bahar BioM53901:400
Birincil antikor FOXP3DakoM35151:400
Birincil antikor pansitokeratinHücre Sinyali126531:500
Birincil antikor PD-L1Hücresi Sinyalizasyon136841:200
İkincil antikorAkoya BiosciencesARH1001EAOpal polimer
Slayt leke setiElektron Mikroskobu Bilimleri6254001
Tris tamponlu salinCorning46-012-CMTBS
Dikey kayar rafElektron Mikroskobu Bilimleri50-294-72
KsilenFisher
X3P1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex Fluorescent ImmunohistochemistryFormalin Fixed Paraffin Embedded TissueAntibody OptimizationMultiplex DesignSlide PreparationAntigen RetrievalFluorophore ApplicationMonoplex AssaySpatial AnalysisTumor Microenvironment

Related Articles