Method Article

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

DOI:

10.3791/60029

⸱

August 21st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dinamik protein-protein etkileşimleri, motiliteden DNA repliğine ve sinyal transdüksiyonuna kadar hücresel davranışı kontrol eder. Ancak, bir protein etkileşim ağında birden fazla protein arasındaki dinamik etkileşimleri izlemek teknik olarak zordur. Burada, Maruz Kalan Proteinlerin göreceli floresan ölçümlerine dayalı olarak protein etkileşimlerinde kat değişimlerinin kantitatif değerlendirmesini sağlayan Kantitatif Multipleks İmmünenyağış (QMI) için bir protokol sayılmiyoruz. Yüzey epitopleri (PiSCES). QMI'de, hücre lisatlarından gelen protein kompleksleri mikrokürelere immünpresipitat edilse ve pisces bolluğunu ölçmek için farklı bir protein için etiketli bir antikor ile incelenir. İmmünenen anatomikler farklı MagBead spektral bölgelere konjuge edilir, bu da bir akış sitometresinin birden fazla paralel immünoprepliti ayırt etmesini ve aynı anda her biriyle ilişkili prob antikor miktarını ölçmesini sağlar. QMI genetik etiketleme gerektirmez ve diğer immünopredipredityöntemleriile karşılaştırıldığında minimal biyomalzeme kullanılarak yapılabilir. QMI, etkileşim eden proteinlerin tanımlanmış herhangi bir grubu için uyarlanabilir ve şimdiye kadar T hücreleri ve nöronal glutamat sinapslarında sinyal ağlarını karakterize etmek için kullanılmıştır. Sonuçlar, potansiyel tanı ve tedavi uygulamaları ile yeni hipotez oluşumuna yol açmıştır. Bu protokol, ilk antikor paneli seçiminden çalışan tahlillere ve analiz verilerine kadar QMI'yi gerçekleştirmek için talimatlar içerir. Bir QMI tahlilinin ilk montajı, bir panel oluşturmak için antikorların taranmasını ve uygun bir lisis tamponunun ampirik olarak belirlenmesini içerir. Sonraki reaktif hazırlığı magbeadlar için kovalent kaplin immünopresian antikorlar içerir, ve bir streptavidin-konjuge florofile etiketlenmiş olabilir böylece biyotinilting prob antikorlar. Tofaş çalıştırmak için, lysate magbeads ile bir gecede karıştırılır, ve sonra boncuk bölünmüş ve farklı prob antikorları ile kuluçka, ve daha sonra bir florofor etiketi, ve akış sitometri tarafından okunur. PiSCES'i deneysel koşullar arasında önemli ölçüde farklılık gösteren iki istatistiksel test yapılır ve sonuçlar ısı haritaları veya düğüm kenarı diyagramları kullanılarak görselleştirilmiştir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dinamik protein-protein etkileşimleri, çoğu hücresel fizyolojinin fonksiyonel temeli olan moleküler sinyalbasamaklarını ve hareketli yapıları oluşturur 1. Bu süreçler genellikle tek girişlere dayalı sabit durumlar arasında geçiş yapan doğrusal sinyal yolları olarak tasvir edilir, ancak deneysel ve modelleme verileri entegre ağlar olarak işlev ettiklerini açıkça göstermektedir2,3, 4. G proteinleri durumunda, farklı reseptörler genellikle aynı G proteinini aktive etme yeteneğine sahiptir ve tek bir reseptör de birden fazla G proteini türünü aktive edebi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ataşe tasarımı

  1. Aday antikor hazırlığı
    1. İlgi çekici her protein için, ekrana 3-5 antikor seçin. Mümkün olduğunda, farklı epitopsiyi tanıyan monoklonal antikorlar kullanın. Ayrıca bir non-spesifik kontrol antikor içerir.
    2. Tris'i kaldırmak için, antikor30 kDa spin filtresine ekleyerek, minimum hacmine inerek, 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek ve 3 kez tekrarlayarak tampon değişimi gerçekleştirin. Taşıyıcı proteinleri çıkarmak için, üreticinin protokolüne göre antikor saflaştırma gerçekleştirin (spesifik arıtma tavsiyesi için Malzeme Tablosu'na bakın).
      NOT: Bu işlem, serbest amin gruplarına sahip taşıyıcı protei....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antikor Taraması
Şekil 2 B protein Connexin36 için bir ekran sonuçlarını gösterir. Ip_probe kombinasyonlarının çoğu IgG kontrolleri üzerinde sinyal üretmez. 1E5 veya poliklonal antikor 6200 ile monoklonal antikor 1E5 ve prob ile IP IgG kontrolleri ile karşılaştırıldığında boncuk dağılımında sağa doğru bir kayma üretir. Burada IP 1E5 ve probe 6200poly, hem spesifik olmayan bir proteinin iki bağımsız antikor tarafından tanınma olasılığını azaltmak hem de fa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

QMI tahlili antikor paneli geliştirme, ekipman ve reaktifler için önemli bir yatırım gerektirir, ancak tahkikat kurulduktan sonra, deneysel olarak kontrol edilen yanıt olarak protein etkileşim ağlarını gözlemleyerek yüksek boyutlu veri toplayabilir Uyaran. Teknik olarak, QMI dikkatli pipetleme ve örnek ve antikor kuyu yerleri izleme gerektirir. Tahlil plakalarının dikkatle etiketlenmesi, kağıt üzerindeki iyi konumların ayrıntılı bir şablonu nun yapılması gibi, daha sonra veri analizi için kaydedilir. Akış sitometre mikro.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar QMI tahlil geliştirme önemli katkıları için Tessa Davis kabul etmek istiyorum, ve teknik rehberlik ve entelektüel giriş için Smith ve Schrum laboratuvarları mevcut ve eski üyeleri. Bu çalışma NIMH hibe R01 MH113545 ve R00 MH 102244 tarafından finanse edilmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 kuyulu düz tabanlı plakalarBio Rad171025001
96 oyuklu PCR plakalarıVWR82006-704
Bio Rad171000205ile Bioplex 200 Sistemibuzdolabında saklanacak şekilde modifiye edilmiştir, ayrıntılar için Şekil S1'e bakın
Bio-Plex Pro Yıkama İstasyonuBio Rad30034376
BSASigma
CML boncuklarıInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex Mikro KürelerLuminexMC12xxx-01xxx,
antikor saflaştırmasıKavun Jel IgG Spin Saflaştırma Kiti
MESSigmaM3671
Mikroplaka filmi, steril olmayanUSA Scientific2920-0000
Fosfotaz inhibitör kokteyli #2SigmaP5726
Proteaz inhibitör kokteyliSigmaP8340
Sandviç Hazırlık BuzdolabıNorlakeSMP 36 15Bioplex 200 Sodyum'un özel soğutması için
florürSigma201154
Sodyum ortovanadatSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152
HTF kısmen için kullanılan 3 basamaklı boncuk bölgesi Thermo Scientific 45206'dır,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Co ImmunoprecipitationProtein Interaction NetworkQuantitative Multiplex ImmunoprecipitationFlow Cytometry AnalysisMagnetic Bead ImmunoprecipitationProtein Co AssociationsSignal Transduction SystemsAntibody Panel SelectionStreptavidin PE LabelingCytoscape Network Visualization

Related Articles