Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

5.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60039

⸱

23 Ağustos 2019

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

Bu makalede

Özet

Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.

Özet

Kromatin etki alanlarının organizasyonu ve yapısı tek tek hücre soylarına özgüdür. Onların yanlış regülasyonu hücresel kimlik ve / veya hastalık kaybına yol açabilir. Muazzam çabalara rağmen, kromatin alanlarının oluşumu ve yayılması anlayışımız hala sınırlıdır. Kromatin etki alanları, kuruluşları sırasında ki ilk olayları takip etmeye elverişli olmayan sabit devlet koşullarında incelenmiştir. Burada, kromatin etki alanlarını inducibly yeniden inşa etmek ve zamanın bir fonksiyonu olarak yeniden oluşumunu takip etmek için bir yöntem salıyoruz. Her ne kadar ilk olarak ÇHC2 aracılı baskılayıcı kromatin etki alanı oluşumu olgusuna uygulansa da, diğer kromatin etki adlarına kolayca adapte edilebilir. Bu yöntemin genomik ve görüntüleme teknolojileri ile değiştirilmesi ve/veya kombinasyonu, kromatin alanlarının kurulmasını ayrıntılı olarak incelemek için paha biçilmez araçlar sağlayacaktır. Bu yöntemin kromatin alanlarının nasıl oluştuğu ve birbirleriyle nasıl etkileşimde olduğu anlayışımızda devrim olacağına inanıyoruz.

Giriş

Ökaryotik genomlar son derece organize ve kromatin erişilebilirlik değişiklikleri doğrudan gen transkripsiyonkontrol 1. Genom transkripsiyonel aktivite ve çoğaltma zamanlaması2,3ile ilişkili kromatin etki alanları, farklı türleri içerir. Bu kromatin etki alanları boyutu birkaç kilobases (kb) fazla 100 kb arasında değişir ve farklı histon modifikasyonları bir zenginleştirme ile karakterizedir4. Temel sorular şunlardır: bu etki alanları nasıl oluşur ve nasıl yayılır?

En iyi karakterize kromatin etki alanlarından biri Polycomb baskıcı kompleks 2 (PRC2) aktivitesi ile teşvik edilir. PRC2, Polycomb Group 'un (PcG)5,6proteinlerinin bir alt kümesinden oluşan ve histon H3 (H3K27me1/me2/me3) 27 lisenin mono-, di-ve trimethylation katalizler bir çok alt birim kompleksidir 7,8, 9,10. H3K27me2/me3 baskıcı kromatin durumu ile ilişkilidir, ancak H3K27me1 fonksiyonu belirsiz6,11. ÇHC2 temel bileşenlerinden biri, embriyonik ektoderm gelişimi (EED), çHC2 kataliz son ürün bağlanır, H3K27me3, aromatik kafes aracılığıyla ve bu özellik PRC2 allosteric stimülasyon sonuçları12,13. ÇHC2 enzimatik aktivitesi belirli bir soy için kontrendike olan bazı gelişimsel genlerin uygunsuz ifadesi olarak gelişim sırasında hücresel kimliğin korunması için çok önemlidir, zararlı olacaktır5,6 . Bu nedenle, PrC2'nin memelilerde baskıcı kromatin alanlarının oluşumunu teşvik ettiği mekanizmaların çözülmesi hücresel kimliğin anlaşılması için temel öneme sahiptir.

PrC2 aracılı kromatin etki alanları da dahil olmak üzere kromatin etki alanı oluşumunu araştırmak için tasarlanmış tüm deneysel sistemler, kromatin etki alanı oluşumunun gelişen olaylarını takip edemeyen sabit durum koşullarında gerçekleştirilmiştir. Hücre. Burada, kromatin alanadlarının ilk işe alımını ve yayılmasını izleyen indüklenebilir bir hücresel sistem oluşturmak için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Özellikle, H3K27me2/3'ü oluşturan ÇHC2 aracılı baskıcı kromatin etki alanlarının oluşumunu izlemeye odaklanıyoruz. Kromatin etki alanı oluşumunun mekanistik ayrıntılarını yakalayabilen bu sistem, H2AK119ub veya H3K9me'den oluşan yaygın olarak çalışılan etki alanları gibi diğer kromatin etki alanlarını da dahil etmek üzere uyarlanabilir. Genomik ve görüntüleme teknolojileri ile birlikte, bu yaklaşım kromatin biyolojisindeki çeşitli önemli soruları başarılı bir şekilde ele alma potansiyeline sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İndüklen EED kurtarma mESC'lerinin üretimi

1. Hücre kültürü

  1. 4-Hidroksitamoksifen (4-OHT)13uygulanması üzerine çekirdeğe transkus transretobilen, koably entegre CreERT2 transgene sahip besleyicisiz C57BL/6 fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) kullanın.
  2. 1000 U/mL LIF, 1 μM ERK inhibitörü PD0325901 ve 3 μM GSK3 inhibitörü CHIR99021 ile desteklenen konvansiyonel ESC orta14,15,mESK'lerde büyütün. Konvansiyonel ESC ortamı için %15 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 1X penisilin/streptomisin ve 0.1 mM 2-mercaptoetanol içeren nakavt DMEM kullanın.
  3. MESC'ler için %0,1 jelatin çözeltisi ile kaplanmış plakalar kullanın.

2. Klonal EED nakavt (KO) mESCs üretimi

  1. Tasarım kılavuzu RNA 'lar (gRNA'lar) Exon 10 ve Exon 11'i silmek için, Benchling16'dakiCRISPR tasarım aracını kullanarak mESC'lerde EED'nin endojen kopyalarını siler. EED-KO-gRNA-1, exon 10'un intron'u hemen yukarıya ve EED-KO-gRNA-2'yi Exon 11'in hemen aşağısına doğru hedefler. Bu gRNA'ların eşzamanlı uygulaması homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) ile Hem Exon 10 hem de Exon 11'i siler.
  2. Clone gRNA'lar içine pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Ran ve ark.
  3. 6-iyi plaka formatında, transfect 2 x 105 mESCs her EED-KO-gRNA-1 ve EED-KO-gRNA-2 1 mg (Malzemeler Tablosubakınız) üreticinin talimatları na uyarak transfeksiyon reaktifi kullanarak. Transfeksiyondan sonra ortamı 24 saat değiştirin.
  4. Transfeksiyondan iki gün sonra, Floresan aktive hücre sıralama (FACS) kullanarak GFP pozitif hücreleri izole edin. Transfeksiyon veriminin %10-30 civarında değişmesini bekleyin. Kaplama için yeterli GFP pozitif hücreleri yakalamak için 5 x 105 hücreleri etrafında sıralayın.
  5. Koloni toplama için izole GFP pozitif mESC'leri %0,1 jelatin (plaka başına 10-20 x103 hücre) ile önceden kaplanmış 15 cm'lik plakalara plakalayın.
  6. Tek koloniler görünene kadar ESC ortamındaki hücreleri yaklaşık bir hafta büyütün. Her 2 günde bir ortamı değiştirin.
  7. 20 μL mikropipet ucu kullanarak en az 48 koloni seçin. Mikropipet ucuna aspire ederken koloninin üzerine kazıyın. Koloniyi tek bir hücreye ayırma. Koloniyi bir accutase içeren (20 mL) 96 kuyu plakasına aktarın.
  8. Tüm hücreler ayrıştırılıncaya kadar kolonileri 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  9. Çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 200 mL ESC ortam ekleyin.
  10. İyi bir şekilde karıştırın ve çok kanallı pipet kullanarak hücreleri iki ayrı 96 kuyu plakasına plakalayın.
  11. Genotipleme için 96 kuyu plakasından birini kullanın ve genotipleme sonuçlanana kadar diğerini büyütmeye devam edin. Üreticinin talimatlarına uyarak 96 kuyu plakasından DNA çıkarmak için DNA çıkarma solüsyonu kullanın.
  12. Silinen siteye yayılan ve üreticinin talimatları doğrultusunda Takdna polimeraz ile genotipleme pcr gerçekleştiren Gnt_EED-KO-up ve Gnt_EED-KO_downgenotyping astarları kullanın.
    NOT: Dna polimerazların diğer türleri de genotipleme için kullanılabilir, ancak, PCR reaksiyonu doğrudan renkli reaksiyon tampon kullanıldığında bir jel üzerine yüklenebilir gibi Taq DNA polimeraz kolaylık sağlar.
    1. Vahşi tip (WT) kasasına göre homozigot silme ile hücrelerde daha düşük molekül ağırlığına sahip bir DNA ürününün gözlemlein.
      NOT: PRC2 null hücreleri oluşturmak için, exons homozigot silme 10 ve 11 eed, çekirdek PRC213önemli bir alt birimi istikrarsızlaştırmak ve bozunmak için gereklidir. CRISPR hedefleme verimliliği %10 civarındadır.
  13. EED ekson 10 ve 11'in silinmesini ve Sırasıyla Sanger dizilimi ve Batı lekeleme ile EED protein kaybını doğrulayın.
  14. EED ve H3K27me2/me3'ün EED KO hücrelerindeki kromatinden H3K27me2/me3 ve EED'ye karşı antikorlar kullanarak ChIP-seq ile tükenmesini onaylayın. ChIP-seq deneyleri için Oksuz vd., 2017 15'te verilen protokolü kullanın.

3. Cre-ERT2 tabanlı indüklen EED ifadesini barındıracak EED nakavt mESC'lerini tasarlamak

  1. Tasarım gRNA (EED-gRNA-inducible) Benchling16'daki CRISPR tasarım aracını kullanarak EED'nin ekson 9'undan sonra intron içinde bir kesim tanıtmak için 16 (bkz.
  2. Clone gRNA'lar içine pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Ran ve ark.
  3. Ekson 9'dan sonra EED cDNA dizisini ve T2A-GFP dizisinin C-terminal Flag-HA etiketini içeren bir donör şablonu DNA'sı tasarla, hepsi endojen gen dizisine göre ters yönde.
    1. Bir splice-acceptor ve heterolog ters loxP siteleri (lox66 ve lox71) 18 arasında yuvalanmışbir poliadeniletion dizisi ile kaset flank .
    2. Her iki ucundan en az 500 bp homoloji silah ekleyin. Donör şablonu gBlocks gen parçalarının 2 segmentine bölün (bkz. gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" ve gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") PCR Blunt vektör üreticisinin talimatları aşağıdaki Gibson klonlama kullanarak.
      NOT: gblock-2 H3K27me312ile etkileşim için önemli olan EED kafes içinde bir aromatik kalıntı (Y365) içerir. gBlock-2-Wt yabani tip kalıntısı içerirken, gblock-2-cage-mutant, H3K27me3'e bağlanamayan EED (Y365A) kafes mutantını içerir. Indüklen WT EED kurtarma i-WT-r ve indüklen kafes mutant EED kurtarma kolaylık sağlamak için i-MT-r olarak gösterilir olarak gösterilir.
  4. 6-iyi plaka formatında, transfect 2 x 105 mESCs gRNA 1 mg (EED-gRNA-inducible) ve 1 mg Donör şablonları (i-WT-r veya i-MT-r) transfeksiyon reaktif kullanarak ve FACS kullanarak GFP pozitif hücreleri izole.
  5. Başarılı hedefleme için genotiplemeye hazır kolonileri izole etmek için 2.3-2.11 adımlarını izleyin.
  6. Genotyping astarlar Inducible_Genotype-FW-1 ve Inducible_Genotype-REV-1kullanın , hangi eklenen kaset yayılan ve Tak DNA polimeraz kullanarak genotipleme PCR gerçekleştirmek.
    NOT: CRISPR için hedefleme verimliliği %10 civarındadır.
    1. İnducible_Genotype-FW-2 ve Homoloji kollarının dışında olan Inducible_Geotype-REV-2 astarlarını kullanarak kasetin PCR ile doğru entegrasyonunu onaylayın.
      NOT: EED'nin verimli bir şekilde kurtarılması için kasetin homozigot entegrasyonu gereklidir. Homozigot entegrasyona sahip hücrelerin WT EED ile karşılaştırıldığında tek bir büyük DNA ürünü üreteceğini unutmayın, bu da kısa bir ürün üretecektir.
  7. Kasetin Sanger sıralaması ile entegrasyonunu onaylayın.
  8. Batı lekeleme tarafından 4-OHT yönetimi üzerine kaset ve EED ve diğer PRC2 temel bileşenleri (örneğin, EZH2 ve SUZ12) ifadesinin flipping onaylayın.
  9. T2A-GFP ifadesini ve akış sitometrisi ile çevirme yüzdesini doğrulayın. GFP ifadesinin kasetin çevrildiğini ve EED ifadesinin göstergesi olduğunu unutmayın.

4. Kromatin üzerinde ÇHC2 aktivitesinin çekirdekleşme ve yayılmasınıtaki takip

  1. I-WT-r ve i-MT-r mESC'lerin akış sitometrisi tarafından GFP'nin sızdıran ekspresyonuna sahip olmadığını doğrulayın. GFP'nin sızdıran ekspresyonu durumunda, denemeye başlamadan önce GFP negatif hücreleri FACS tarafından yalıtın.
  2. i-WT-r ve i-MT-r mm'leri beş adet 15 cm plakaya (plaka başına 5x 106 hücre) genişletin.
  3. 0 saat, 12 h, 24 saat, 36 saat ve 8 gün (her koşulda bir 15 cm plaka) için 0,5 mM 4-OHT uygulama ile WT veya kafes mutant EED indükleme ekspresyonu. 12 saatten uzun tedaviler için 12 saat sonra ortamı değiştirin. GFP kullanarak FACS tarafından başarılı bir şekilde yeniden birleştirilmiş hücreleri izole edin. Tüm koşulların aynı anda toplandığı tedavilerin zamanını ayarlayın.
  4. H3K27me2 için ChIP-seq gerçekleştirin, H3K27me3 WT veya kafes mutant EED yeniden ifade yanıt olarak kromatin onların zamansal birikimi araştırmak için. Oksuz ve ark., 2017 15'te ayrıntılı olarak kullanılankütüphane hazırlama yı içeren ChIP-seq protokolünü kullanın.
  5. Farklı zaman noktaları arasında nicel karşılaştırma sağlamak için her örnekte başak-in denetim kullanın19.
    1. Başak kontrolü için, Drosophila melanogaster (mESC kaynaklı kromatin oranı 1:50 oranında) yanı sıra Drosophila spesifik H2Av antikor (1 μL H2Av antikor başına 4 μg Drosophila kromatin üreticinin talimatları) her örnekte.
    2. Drosophila'dan gelen kromatini Oksuz ve ark., 2017 15'te ayrıntılı olarakbelirtilen protokolü kullanarak, MSK'lardan alınana benzer bir şekilde hazırlayın.
  6. Varsayılan parametreleri20kullanarak Bowtie 2 ile Mm10 genom chIP-seq için sıra okur Harita .
  7. Normalleştirmek fare ChIP-seq spike-drosophila okumak sayımları21okur . Aşağıdaki formülü kullanarak başak-in normalleştirme faktörü hesaplamak: 1 x 106/unique Drosophila okuma sayıları. Yaklaşık 1 x 106Drosophila okuma sayıları ve deneme başına 20 x 106 fare okuma sayıları almak için bekleyin.
    1. Giriş örneklerini sıralarken Drosophila kromatinini eklemeyin.
  8. Bam dosyasını bedgraph 22'ye dönüştürmekiçin bedtools genomecov aracını kullanın. Sonra, USCS23,24 bedGraphToBigWig aracını kullanarak bigwig dosyasına bedgraph dönüştürmek . Aşağıdaki komut dosyasına bakın:
    gen="mm10 genomuna giden yol"
    chr="mm10 kromozom boyutlarına giden yol"
    inp_bam="giriş yolu bam dosyası "
    multiply="başak-in normalleştirme faktörlerini hesapla"
    bedtools genomecov -bg -ölçek $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
    sıralama -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
    bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
  9. USCS genom tarayıcı24bigwig dosyaları yükleyerek ChIP-seq okuma yoğunlukları görselleştirin.

5. MESC'lerin çekirdeklerinde H3K27me3 focisinin ortaya çıkışını ve büyümesini izleme

  1. Plaka 1x 104 mESCs içine 8-iyi oda slaytlar önceden% 0.1 jelatin ile kaplanmış.
  2. Ertesi gün, belirtilen zaman noktaları (0 saat, 12 saat, 24 h ve 36 saat) için EED ifade hücreleri toplamak için ardışık 4-OHT (0,5 mM) indüksiyonlar yapmaya başlayın. 12 saatten uzun tedaviler için 12 saat sonra ortamı değiştirin.
  3. 10 dakika oda sıcaklığında (RT) fosfat tamponlu salin (PBS) % 4 paraformaldehit ile mESC'leri düzeltin.
  4. 30 dakika boyunca RT PBS/0.25% Triton X-100 ile hücreleri permeabilize.
  5. PBS/5% eşek serumu/0.1% Triton X-100 (engelleme tampon) ile HÜCRELERI 30 dakika boyunca RT'de bloke edin.
  6. Seyreltik H3K27me3 birincil antikor 1:500 engelleme tampon ve hücrelere ekleyin.
  7. Hücreleri bir gecede 4 °C'de primer antikorile kuluçkaya yatırın.
  8. Ertesi gün, PBS/0.1% Triton X-100 ile 3 yıkıntı gerçekleştirin.
  9. Sekonder antikor (Alexa flor 595) 1:1000 engelleme tampon seyreltmek ve hücrelere ekleyin.
    1. Alexa Fluor ile konjuge ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu gibi aşağıdaki adımlarda karanlıkta tüm kuluçka gerçekleştirin.
  10. İkincil antikor2 saat RT'de kuluçkaya yatırın.
  11. PBS/0.1% Triton X-100 ile 3 yıkama gerçekleştirin.
  12. Seyreltik DAPI (1 mg/mL) PBS/0.1% Triton X-100 ile 1:4000 ve hücrelere ekleyin.
  13. RT'de 10 dakika boyunca DAPI ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
  14. Aqua montaj ile hücreleri monte edin.
  15. 63X büyütmede konfokal mikroskopi ile hücreleri görüntüleyin.
  16. ImageJ, Fiji 25'in dağıtımını kullanarakgörüntüleri işleme ve sözde renklendirme.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Koşullu kurtarma sisteminin genel bir şeması
Şekil 1 endojen EED locus ifade edilir Ya WT veya kafes mutant (Y365A) EED ile EED KO hücreleri koşullu kurtarmak için hedefleme şeması gösterir. Stabilitesi ve enzimatik aktivitesi için gerekli olan ÇHC2'nin çekirdek alt birimi olan EED'yi nakavt ettikten sonra, EED'nin ekson 9'unu takip eden intron içinde bir kaset tanıtılır (Şekil1). Kaset, endojen gen dizilimine göre ters yönde, EED'nin kalan 3...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Belirli bir kromatin etki alanının oluşumu sırasında mekanistik ayrıntıları anlamak için güçlü bir yaklaşım, ilk etki alanı bozmak ve daha sonra hücreler içinde devam eden yeniden izlemedir. Devam eden olayları ayrıntılı olarak analiz etmek için yeniden yapılanma sırasında herhangi bir zamanda duraklatılmış olabilir. Kromatin etki alanları üzerinde daha önce yapılan çalışmalar, bu tür olayları sabit durum koşullarında (örneğin, yabani tip ve gen nakavtı karşılaştırması) gerçekleştirdikleri için çözemedikleri için çözemed...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

D.R. Constellation Pharmaceuticals ve Fulcrum Therapeutics'in kurucularındandır. Yazarlar hiçbir rakip çıkarları olduğunu beyan.

Teşekkürler

Dr. L. Vales, D. Ozata ve H. Mou'ya makalenin revizyonu için teşekkür ederiz. D.R. Lab, Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01CA199652 ve R01NS100897) tarafından desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(Z) -4-Hidroksitamoksifen (5 mg)SigmaH7904-5MGEED ekspresyonunun indüksiyonu için
% 16 Paraformaldehit sulu çözelti (10x10 ml)Elektron Mikroskobu Bilimleri15710İmmünofloresan için
2-merkaptoetanolLifeTechnologies21985-023mESC kültürü için
% 2 Jelatin ÇözeltisiSigmaG1393-100mlmESC'ler için kültür
Accutase 500 MLYenilikçi Hücre Teknolojisi / FISHERAT 104-500mESC kültürü için
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Tavşan IgG (H + L)Jackson immunoresaerch711-585-152İmmünofloresan
için Aqua-Mount Montaj OrtamıFISHER/VWR41799-008İmmünofloresan
için CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PKFisher Sci177445PKİmmünofloresan
DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür) için - 10 mgLife TechD1306İmmünofloresan
ERK inhibitörü için, PD0325901Stemgent04-0006mESC kültürü için
ESGRO Rekombinant Fare LIF ProteiniMillipore/FisherESG1107mESC kültürü için
FBS Kök Hücre NitelikliAtlantaS10250mESC kültürü için
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LDonör şablonu klonlama için
GSK3 inhibitörü, CHIR99021Stemgent04-0004mESC kültürü için
H3K27me2 (D18C8) tavşan mABHücre Sinyali9728SChIP-seq
H3K27me3ChIP-seqHiston9733S
antikor (pAb)Aktif motif39715ChIP-seq Knockout
DMEMInvitrogen10829-018için spike-in kontrolü mESC kültürü için
L-glutaminSigmaG7513mESC kültürü için
Transfeksiyon için Lipofektamin 2000LifeTech11668019
Genotipleme PCR içinMangoTaq DNA PolimerazBioline BIO-21079
Normal eşek serumu (10 mL)Jackson ImmunoResearch017-000-121İmmünofloresan için
Penisilin-StreptomisinSigma/RocheP0781mESC kültürü için
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138gRNA klonlaması için
QuickExtract DNA Ekstraksiyon SolüsyonuLucigenQE0905TGenotipleme için
PCR Triton X-100DonörT8787-250ML
Sıfır Künt PCR KlonlamaKiti Thermo FisherK270020
Primers/gBlocks>
EED-KO-gRNA-1Sıra: ctctggctactgtcaactag. gRNA'lar, i-WT-r ve i-MT-r sistemleri için C57BL/6 ESC'lerde EED'yi nakavt etmek için eşleşir.
EED-KO-gRNA-2Dizisi: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNA'lar, i-WT-r ve i-MT-r sistemleri için C57BL/6 ESC'lerde EED'yi nakavt etmek için eşleşir.
EED-gRNA ile indüklenebilirSekans: atggcaccccgaaattagaa. EED-KO arka planında i-WT-r sistemi oluşturmak için gRNA ve Donör.
i-WT-r Donörhttps://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. EED-KO arka planında i-WT-r sistemi oluşturmak için gRNA ve Donör.
EED-gRNA ile indüklenebilirSekans: atggcaccccgaaattagaa. EED-KO arka planında i-WT-r sistemi oluşturmak için gRNA ve Donör.
i-MT-r Donörhttps://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA ve Donör, EED-KO arka planında i-MT-r sistemi oluşturmak için.
Genotipleme Primerleri
Gnt-EED-KO-FW-1Sırası: ctgtaggctgccatctgtga. Yabani tip alel 1.9 kb'lik bir ürün üretecektir. Nakavt aleli 200 bp'lik bir ürün üretecek.
Gnt-EED-KO-REV-1Sırası: agccagggctacacagagaa. Yabani tip alel 1.9 kb'lik bir ürün üretecektir. Nakavt aleli 200 bp'lik bir ürün üretecek.
Inducible_Genotype-FW-1Sırası: tgcagtgaaacaaatttggaa. Kaset yerleştirildiğinde, astarlar 1863 bp üretecektir. Yabani tip alel, ~200 bp'lik bir ürün üretecektir.
Inducible_Genotype-REV-1Sırası: gagagggggtggcactgtaaa. Kaset yerleştirildiğinde, astarlar 1863 bp üretecektir. Yabani tip alel, ~200 bp'lik bir ürün üretecektir.
Inducible_Genotype-FW-2Sırası: ccccctctttctcttttt. Kaset yerleştirildiğinde, astarlar 3200 bp üretecektir. Yabani tip alel, 1560 bp'lik bir ürün üretecektir.
Inducible_Genotype-REV-2Sırası: atgcctgggtgaatgaaaaa. Kaset yerleştirildiğinde, astarlar 3200 bp üretecektir. Yabani tip alel, 1560 bp'lik bir ürün üretecektir.
için Antikor H2Av için Hücre Sinyali Antikoru şablon klonlama için Sigma

Kaynaklar

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kromatin Alanı OluşumuPRC2 Aracılı KromatinCRISPR-Cas9 NakavtAkış Sitometrisi AnaliziChIP-seq AnaliziFloresan MikroskobuFare Embriyonik Kök HücreleriEED Geni Delesyonu4-Hidroksitamoksifen İndüksiyonuH3K27me3 Birikimi
Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.