Yöntem makalesi

Embriyonik Kök Hücrelerden Granülosit-Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Taşıyan EkzozomLa Zenginleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

DOI:

10.3791/60170

⸱

11 Kasım 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 2Experimental Therapeutics Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 3Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Surgery, University of Louisville, 5Immuno-Oncology Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 6Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada embriyonik kök hücrelerden immün uyarıcı granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktörler taşıyan ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerin izole edilmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik kök hücreler (ESC' ler), kendini yenileyebilen ve her türlü embriyonik hücreye ayırabilen pluripotent kök hücrelerdir. Diğer birçok hücre tipi gibi, ESC'ler de ekzomlar gibi küçük membran vesiklelerini hücre dışı ortama bırakır. Ekzozomlar hücreler arası iletişimin temel arabulucuları olarak hizmet eder ve birçok (pato) fizyolojik süreçte temel bir rol oynar. Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) immün yanıtı modüle etmek için bir sitokin olarak işlev eder. Eksozomlarda GM-CSF varlığı, bağışıklık düzenleyici işlevlerini artırma potansiyeline sahiptir. Burada, GM-CSF, ES-D3 numaralı murine ESC hücre hattında bıçaklanarak aşırı ifade edildi. GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 hücrelerinden yüksek kaliteli eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinleri (EV) izole etmek için bir protokol geliştirilmiştir. İzole ekzozom zenginleştirilmiş EV'ler çeşitli deneysel yaklaşımlarla karakterize edildi. Daha da önemlisi, eksozom zenginleştirilmiş EV'lerde önemli miktarda GM-CSF bulunduğu bulunmuştur. Genel olarak, ESC'lerden GM-CSF taşıyan ekzozom zenginleştirilmiş EV'ler, bağışıklık düzenleyici faaliyetlerini uygulamak için hücresiz veziküller olarak işlev görebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ESC'ler preimplantasyon embriyosunun blastosist aşamasından türetilir1. Pluripotent kök hücreler olarak, ESC'ler her türlü embriyonik hücreye kendi kendini yenileme ve ayırt etme yeteneğine sahiptir. Olağanüstü gelişimsel potansiyelleri ve uzun vadeli proliferatif kapasiteleri nedeniyle, ESC'ler biyomedikal araştırmalar için son derece değerlidir1. Mevcut araştırma çalışmaları büyük ölçüde DIYABET, kalp hastalığı ve nörodejeneratif hastalıklar 2,3,4dahil olmak üzere çeşitli ana patolojik bozukluklar için ESC'lerin terapötikpotansiyelineodaklanmıştır.

ESC'ler de dahil olmak üzere memeli hücrelerinin hücre dışı ortama değişken boyutlarda veziküller salması bilinmektedir ve bu EV'ler hücreler arası iletişimdeki rolleri nedeniyle birçok fizyolojik ve patolojik işleve sahiptir5. EV'lerin farklı alt tipleri arasında, ekzozomlar, çeşitli hücre tiplerinden, ara endosit bölmelerin, çokvesiküler gövdelerin (MVB'ler) plazma membran6ile füzyonu üzerine hücre dışı boşluğa salınan küçük membran vezikülleridir. Ekzozomların hücreler arası iletişime aracılık yaptığı ve birçok (pato)fizyolojik süreçlerde kritik rol aldığı bildirilmiştir7,8. Ekzozomlar bazı biyolojik işlevleri kendi ebeveyn hücrelerinden miras alırlar, çünkü ekzozomlar proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere sitozolden elde edilen biyolojik malzemeler içerir. Bu nedenle, belirli bir hastalığa özgü immün yanıtı uyarıcı ilişkili antijenler veya faktörler, belirli hücre türlerinden ekzozomlarda kapsüllenir9. Bu, kanser önleyici bir aşı olarak tümör türevi ekzozomları araştıran klinik çalışmaların önünü açtı10.

GM-CSF, farklı bağışıklık hücreleri tarafından salgılanan bir sitokindir11. Ortaya çıkan kanıtlar, GM-CSF'nin bağışıklık sistemini aktive ettiğini ve düzenlediğini ve antijen sunma sürecinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir12. Örneğin, bir klinik rapor GM-CSF'nin tümörlere karşı bağışıklık tepkisini bir aşı adjuvan13olarak uyardığını göstermektedir. KLINIK DENEYLERDE GM-CSF'nin güçlü immün uyarıcı aktivitesini kullanmak için çeşitli GM-CSF tabanlı kanser immünoterapi stratejileri araştırılmıştır14. Bunlar arasında, ışınlanmış GM-CSF salgılayan tümör hücrelerinden oluşan bir kanser aşısı, metastazlı tümörlerde hücresel ve humoral antitümör yanıtları ve sonraki nekrozu indükleyerek ileri melanom hastalarında bazı vaatlerde bulundu15.

ESC'lerden elde edilen ekzozomlar orijinal ESC'lerle benzer biyolojik aktivitelere sahip olduğundan, belki ESC'lerden GM-CSF taşıyan ekzozomlar bağışıklık tepkisini düzenlemek için hücresiz veziküller olarak işlev görebilirim. Bu makalede, GM-CSF'yi ifade eden ESC'lerden yüksek kaliteli eksozom zenginleştirilmiş EV'ler üretmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmıştır. Bu ekzozomla zenginleştirilmiş EV'ler, bağışıklık tepkisini modüle etmek için bağışıklık düzenleyici veziklinler olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ES-D3 hücrelerinin kült örültme

  1. Eksozom içermeyen fetal sığır serumu (FBS) oluşturmak için FBS'yi 4 °C'de 16 saat boyunca 100.000 x g'da ultracentrifuge ve santrifüje yükleyin. Santrifüjlemeden sonra, ES-D3 murine ESC hücre hattını kültleştirmek ve ekzozomla zenginleştirilmiş EV'ler elde etmek için ekzozom içermeyen FBS olarak serum supernatant toplayın.
  2. ES-D3 hücrelerini kaplamadan önce, 15 cm doku kültürü yemeklerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca jelatin (%0,1) kullanarak kaplayın.
  3. Daha önce açıklanan bir protokol16'nınardından, jelatin kaplı 15 cm doku kültürü yemeklerinde besleyici katman hücreleri olmayan ES-D3 hücrelerini kültürleyin. ES-D3 hücre kültürü ortamı DMEM'den oluşur, ekzozom içermeyen FBS (%15), gereksiz amino asitler (0,1 mM), L-glutamin (2 mM), β-mercaptoethanol (0,1 mM), penisilin (50 birim/mL), streptomisin (50 μg/mL) ve lösemi inhibitör faktörü (LIF; 100 birim/mL). %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de kültür ES-D3 hücreleri.
  4. ES-D3 hücreleri 15 cm'lik doku kültürü yemeklerinde yaklaşık% 90 izdiah ulaştığında, ortamı aspirasyonla çıkarın. Hücreleri tripsin kullanarak yıkayın (%5 mL; %0,05). Yemeklere tripsin (5 mL) ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri bulaşıklardan toplayın.
  5. Trypsin'i devre dışı bırakmak için toplanan hücrelere taze kültür ortamı (5 mL) ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. Hücreleri taze ortamda yeniden biriktirin ve hemositometre kullanarak hücre numarasını belirleyin.
  6. Hücreleri geçirmek için, ES-D3 hücrelerini (5 x 106)jelatin kaplı (%0,1) 15 cm'lik bir doku kültürü çanağı ile taze orta (15 mL) ve kültür ile 3 gün boyunca plakalayın.
  7. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerin izolasyonu için hücre kültürü üstnatantını toplamak için, hücre kültürü süpernatantı toplamadan önce 3 gün boyunca ES-D3 hücrelerini (1 x 107)jelatin kaplı (%0,1) 15 cm doku kültürü kabında taze orta (15 mL) ile tabaklayın.

2. GM-CSF ekspresyon plazmid üretimi

NOT: GM-CSF'yi ES-D3 hücrelerinde aşırı ifade etmek için transfection plazmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP oluşturun. Bu plazmidde, murine GM-CSF cDNA'nın marker proteini ile birlikte renilla reniformis GFP (hrGFP) ifadesi, insan polipeptid zincir uzama faktörü 1α (EF1α) promotörü17,18tarafından tahrik edilir.

  1. Vektör omurgasını oluşturun.
    1. İki DNA parçası oluşturmak için 2 saat boyunca 37 °C'de EcoRI (100 birim) kısıtlama enzimini kullanarak plazmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP 'yi (20 μg DNA) sindirin: vektör omurgası (6,0 kb) ve FD3ER kesici ucu (2,5 kb).
    2. Sindirilmiş plazmid DNA'nın (10 μg) %50'sini bir adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1 saat boyunca 37 °C'de alkali fosfataz (20 birim) ile tedavi edin. Agarose jel elektroforez (%2) kullanarak hem tedavi edilmemiş hem de defosforillenmiş DNA'yı çözün.
    3. Vektör omurga DNA parçalarını (6,0 kb) DNA jel ekstraksiyon kiti kullanarak arındırın. Tedavi edilmemiş vektör omurgası boş vektör (pEF1α-IRES-hrGFP) görevi görecekken, defosforillenmiş vektör omurgası GM-CSF ifade eden plazmid (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP) oluşturmak için kullanılacaktır.
  2. GM-CSF cDNA kesici ucu oluşturun.
    1. İki DNA parçası üretmek için 2 saat boyunca 37 °C'de EcoRI(100 birim) kısıtlama enzimini kullanarak plazmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP 19 'u (20 μg) sindirin: vektör omurgası (6,5 kb) ve murine GM-CSF cDNA kesici ucu (474 bp).
    2. Sindirilen DNA'yı agarose jel elektroforezi (%2) ile çözün. DNA jel çıkarma kiti kullanarak murine GM-CSF cDNA parçasını (474 bp) arındırın.
  3. İfade plazmidlerini oluşturun.
    1. DNA ligasyon kiti kullanarak 2 ligasyon reaksiyonunu (10 μL toplam hacim) ayarlayın.
      1. Boş vektör pEF1α-IRES-hrGFP'yi oluşturmak için, işlenmemiş vektör omurgasını adım 2.1.3'ten (6.0 kb; 500 ng) kesin.
      2. pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP oluşturmak için, aşağıdaki DNA parçalarını birleştirir: (1) adım 2.1.3'ten (6.0 kb; 500 ng) ve (2) adım 2.2.2'de (474 bp; 200 ng) oluşturulan mGM-CSF cDNA parçasından defosforillenmiş vektör omurgası.
    2. 5 dakika boyunca 25 °C'de ligat. Liglenmiş DNA'yı DH5α yetkin E. coli hücrelerine dönüştürün. Dönüştürülmüş E. coli hücrelerini karbenisilin (50 μg/mL) içeren LB-agar plakaları üzerine plakalayın.
    3. DNA izolasyon kiti kullanarak plazmidleri tek E. coli kolonilerinden arındırın. Plazmidlerin kimliklerini DNA dizilimi ile doğrulayın.

3. GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 hücrelerinin üretimi

NOT: GM-CS'yi aşırı ifade etmek için ES-D3 hücrelerini plazmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP ile transfect. Plazmid pBabe-Neo'yu ES-D3 hücrelerine kotransfect18,20.

  1. Plazmidleri ES-D3 hücrelerine aktarın.
    1. ES-D3 hücrelerini (1,4 x 106)jelatin kaplı (%0,1) 10 cm'lik doku kültürü çanağı ile transfeksiyon için kültür ortamı (10 mL) ile plakalayın. Kültür kaplamalı ES-D3 hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca.
    2. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerde iki plazmid karışımı hazırlayın: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, vektör kontrolü) ile pBabe-Neo (4 μg) ve (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, gm-CSF ifade eden) pBabe-Neo (4 μg). Transfection'ı, üreticinin protokolünü izleyerek bir transfection kiti kullanarak gerçekleştirin.
    3. Plazmid karışımlarını içeren her tüpe transfeksiyon ortamı (1 mL) ve transfeksiyon reaktifi (64 μL) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatın.
    4. Transfeksiyon karışımlarını ES-D3 hücrelerinin ilgili 10 cm'lik yemeklerine ekleyin. 5 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
    5. 10 cm'lik yemeklerdeki ortamı taze kültür ortamıyla (10 mL) değiştirin. 24 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
  2. Stably transfected ES-D3 hücrelerinin toplu popülasyonlarını oluşturun.
    1. Ortamı transfected ES-D3 hücrelerinden çıkarın. Hücreleri tripsinle yıkayın (%2 mL; %0,05). Tripsin (2 mL) ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır. Hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve tripsin nötralize etmek için 2 mL taze kültür ortamı ekleyin. 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj.
    2. Transknakte olmuş hücreleri taze kültür ortamında (10 mL) yeniden biriktirin. Üreticinin protokolünü izleyerek floresanla etkinleştirilen hücre sıralamasını (FACS) kullanarak transfected ES-D3 hücrelerinde GFP'nin floresan yoğunluğunu değerlendirin.
    3. Transfected hücreleri taze kültür ortamı (10 mL) içeren iki adet 10 cm'lik yemeklere aktarın. Bulaşmamış hücreleri ortadan kaldırmak için nembilin (0,5 mg/mL) ekleyin.
    4. Transkredaklı hücreleri neomisin (0,5 mg/mL) içeren kültür ortamında kültlü çalışmaya devam edin. Transfected ES-D3% 90 izdiah ulaştığında, hücreleri tekrar 15 cm doku kültürü yemeklerine aktarın. İşlemi 2 hafta boyunca tekrarlayın.
  3. Stably transfected ES-D3 hücrelerinin klonlarını oluşturun.
    1. Stably transfected ES-D3 hücrelerinin toplu popülasyonları oluşturulduktan sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi toplayın. Hemositometre kullanarak hücre numaralarını belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. Hücreleri (1 x 107 hücre/mL) taze kültür ortamında yeniden biriktirin.
    2. Hücreleri steril 40 μm hücre süzgecinden filtreleyin. Üreticinin protokolüne uyarak FACS kullanarak GFP pozitif ES-D3 hücrelerini arındırın.
    3. Tek sıralanmış bir ES-D3 hücresini, yenidoğan içermeyen ortamda (200 μL) ebeveyn ES-D3 hücreleri (1 x 103)içeren jelatin kaplı (%0,1) 96 kuyulu doku kültürü plakasının bir kuyusuna plakalayın. Transtransfected ES-D3 hücrelerinin, transtrans enfekte olmayan ebeveyn meslektaşlarıyla birlikte kült halineilmesi, enfekte olmuş tek ES-D3 hücrelerinin tek bir klon olarak hayatta kalmasını ve çoğalmasını sağlar.
    4. Hücreleri 48 saat boyunca kültürleyin ve daha sonra 96 kuyu plakalarına nembilin (0,5 mg / mL) ekleyerek enfekte olmayan ebeveyn ES-D3 hücrelerini ortadan kaldırın.
    5. GFP pozitif ES-D3 hücrelerini 1 hafta boyunca orta boy nemlendiricin (0,5 mg/mL) içeren 96 kuyu doku kültürü plakalarında kültleştirmeye devam edin. Klonal ES-D3 hücre hatlarını 1 hafta boyunca nemlendiricin (0,5 mg/mL) içeren kültür ortamı (5 mL) ile jelatin kaplı (%0,1) 6 cm doku kültürü yemeklerine aktarın.
    6. Üreticinin protokolüne uyarak, FACS kullanarak transfected ES-D3 hücre klonlarının her birinde GFP floresanının yoğunluğunu belirleyin. GM-CSF'yi veya yüksek düzeyde yeşil floresan içeren boş vektörü ifade eden ES-D3 klonlarını seçin.
    7. Üreticinin protokolüne uyarak, bir murine GM-CSF ELISA kiti kullanarak ES-D3 hücreleri tarafından salgılanan GM-CSF miktarlarını belirleyin.

4. Eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin izolasyonu

  1. ES-D3 hücrelerini (1 x 107) 15cm doku kültürü yemeklerinde 37 °C'de 72 saat boyunca kültür edin. Hücre kültürü üstnatant toplamak. Mağaza, ekzomal bütünlüğü korumak için 1 haftaya kadar 4 °C'de süpernatant topladı.
  2. Büyük hücre parçalarını yatıştırmak için bir santrifüj kullanarak 4 °C'de 60 dakika boyunca 5.000 x g'da hücre kültürü üstnatantını santrifüj edin.
  3. Bir ultracentrifuge kullanarak 4 °C'de 90 dakika boyunca 100.000 x g'da süpernatant ve santrifüjü toplayın.
  4. Üsttekini çıkarın. Kalan kültür üstnatantı kaldırmak için her peleti fosfat tamponlu salin (PBS; 1 mL) ile iki kez hafifçe durulayın.
  5. Her peleti PBS'de yeniden diritin. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri protein içeriğine göre ölçün5.
    1. Ekzozom bakımından zenginleştirilmiş EV'lerin protein konsantrasyonlarını bicinkoninik asit (BCA) tahlili ile ölçün. ES-D3 hücrelerinden beklenen ekzozom zenginleştirilmiş EV verimi, hücre kültürü süpernatantının yaklaşık 4 μg proteini / mL'dir. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri PBS'de yeniden canlandırın (protein konsantrasyonu: ~6 μg/μL). Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri -80 °C'de saklayın.

5. Eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin iletim elektron mikroskopisi ile karakterizasyonu

NOT: İletim elektron mikroskopisi (TEM) 5 kullanarak ESC'lerden izole edilen ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerin bileşimini ve yapısını araştırın5.

  1. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri (3-5 μg/μL) oda sıcaklığında 2 saat boyunca %2 EM sınıfı paraformaldehit konsantrasyonu ile sabitlayın.
  2. Sabit numuneleri (10 μL) karbon destek filmi ile bakır ızgaralara yükleyin. Numuneleri bakır ızgaralarla 1 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından ızgaraları filtre kağıdı ile boşaltın.
  3. Izgaraları üreticinin protokolüne uygun bir boyama çözeltisi ile lekelendirin.
  4. Izgaraları cımbız kullanarak bir filtre kağıdı parçasına aktarın. Izgaraların oda sıcaklığında gece boyunca kurumasını bekleyin.
  5. Üreticinin protokolüne uyarak bir iletim elektron mikroskobu (50.000x büyütme) kullanarak elektron mikroskopi görüntüleri elde edin.

6. Ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin batı leke analizi ile değerlendirilmesi

  1. Tüm hücre özlerini hazırlayın.
    1. Ortamı 15 cm'lik yemeklerde kültürlenmiş ES-D3 hücrelerinden çıkarın. Hücreleri tripsinle yıkayın (%5 mL; %0,05). Hücrelere tripsin (5 mL) ekleyin. 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. Hücreleri toplayın ve tripsin nötralize etmek için taze kültür ortamı (5 mL) ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. PBS'deki hücreleri yeniden biriktirin.
    2. Hemositometre kullanarak hücre numaralarını belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da tekrar santrifüj edin. %0,5 SDS (5.000 hücre/μL) içeren SDS-PAGE yükleme arabelleğindeki hücreleri yeniden kullanın.
    3. Örnekleri% 10 genlikli bir sonicator kullanarak 10 s için sonicate (watt: 500 W; ultrasonik frekans: 20 kHz). Numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
  2. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerin lizazlarını hazırlayın.
    1. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri 1,2 μg/μL konsantrasyonda %0,5 SDS içeren SDS-PAGE yükleme tamponunda yeniden kullanın.
    2. Örnekleri% 10 genlikli bir sonicator kullanarak 10 s için sonicate (watt: 500 W; ultrasonik frekans: 20 kHz). Numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
  3. Proteinleri Batı lekesi ile tespit edin.
    1. Bis-Tris PAGE jelinin her kuyusuna (%4-20) tam hücre özleri (10 μL; 5.000 hücre/μL) ve eksozomla zenginleştirilmiş EV lizazları (10 μL; 1,2 μg/μL) yükleyin. Proteinleri polivinylidene florür (PVDF) membranlarına aktarın.
    2. Membranları uygun primer ve sekonder antikorlarla kuluçkaya yatır. PBS, Ara-20 (%0,2) ve yağsız kuru süt (%10 w/v) içeren şişirme tamponunda antikorları seyreltin (aşağıda belirtilen konsantrasyonlarda).
      1. Aşağıdaki primer antikorları kullanın: anti-Annexin V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-sitokrom c (100 ng/mL), anti-protein disülfit isomerase (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) ve anti-Oxphos COX IV-subunit IV (600 ng/mL).
      2. Aşağıdaki ikincil antikorları kullanın: peroksidaz konjuge keçi anti-tavşan IgG (20 ng/mL) ve peroksidaz konjuge keçi anti-fare IgG (20 ng/mL).
    3. Gelişmiş bir kemimuminesans tespit kiti kullanarak proteinleri tespit edin.

7. ELISA tarafından ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerde GM-CSF konsantrasyonlarının belirlenmesi

NOT: Üreticinin bazı değişikliklerle yaptığı protokolü izleyerek, ELSA tarafından murine GM-CSF için bir kit kullanarak exozom zenginleştirilmiş EV'lerdeki GM-CSF miktarlarını değerlendirin.

  1. ELISA plakasını yakalama antikor ile kapla. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri (0,6 μg) sadece PBS'de veya PBS + %0,05 Ara-20 (100 μL) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tedavi edin. Kaplamalı ELISA plakasına işlenmiş numuneler ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın.
  2. Örneklere algılama antikorları ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın. Örneklere Avidin-HRP ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın.
  3. Mikro plaka okuyucuda emiciliği 450 nm olarak ölçerek ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerde GM-CSF konsantrasyonlarını belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GM-CSF, murine ESC'lerde aşırı ifade edilir.
ES-D3 hücrelerinde GM-CSF'yi kesin bir şekilde aşırı ifade etmek için, murine GM-CSF cDNA, pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Şekil 1A)ifade vektörünü oluşturmak için bir transfeksiyon vektörüne klonlandı. GM-CSF, ES-D3 hücrelerinde transfeksiyon ile aşırı ifade edildi ve geçici olarak transktaklı ES-D3 hücrelerinin yaklaşık% 20'si GFP pozitifti. GM-CSF'yi veya boş vektör kontrolünü kast...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, ekozomla zenginleştirilmiş EV'lerin bağışıklık modülatörü etkilerini incelemek için sunulabilen bağışıklık uyarıcı protein GM-CSF'yi taşıyan ekzozom bakımından zenginleştirilmiş EV'ler üretmek için son derece verimli bir yöntem göstermektedir. Çeşitli çalışmalar ekzomların bağışıklık düzenleyici ve anti-tümör fonksiyonları sergilediğini göstermektedir22. Bu nedenle, GM-CSF'yi ifade eden ESC'lerden gelen ekzozomlar da bağışıklık yanıtını düzenleyen biyolojik faaliyetlere sahip olabilir....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kavitha Yaddanapudi, Chi Li ve John W. Eaton ABD patent başvurusunda "Mühendislik embriyonik kök hücre türevli ekzozomları ve kullanım yöntemlerini içeren kompozisyonlar" sundular.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İletim elektron mikroskop görüntülerini elde eden Arkadiusz Slusarczyk ve Kentucky Biyomedikal Araştırma Altyapı Ağı'na (KBRIN, P20GM103436) minnettarız. Bu çalışma kısmen NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 ve CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) ve Free to Breathe Research Grant (K.Y.) hibeleri ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alkali fosfat, Buzağı BağırsağıNew England BiolabsM0290SFosforilleyici DNA plazmid
anti-Annexin V mAbSanta Cruz Biyoteknolojiklonu H-3, sc-74438Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAbSanta Cruz Biyoteknolojiklonu B-11, sc-166029Western blot, RRID:AB_2275892
anti-sitokrom c mAbSanta Cruz Biyoteknolojiklonu A-8, sc-13156Batı lekesi, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAbSanta Cruz Biyoteknolojiklonu C-2; sc-74566Batı lekesi, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAbRockland600-401-A33SBatı lekesi, RRID:AB_11182910
anti-fare IgG, keçi, peroksidaz konjugeThermo Fisher31430Batı lekesi, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-alt birim IV mAbThermo Fisherklonu 20E8C12 A21348Batı lekesi, RRID: AB_221509
anti-protein disülfid izomeraz (PDI) pAbEnzoADI-SPA-890Batı lekesi, RRID: AB_10616242
anti-tavşan IgG, keçi, peroksidaz konjugeThermo Fisher31460Western blot, RRID: AB_228341
BCA (bikinkoninik asit) testiThermo Fisher23223Protein konsantrasyonlarının belirlenmesi
Bis-Tris PAGE Jel, ExpressPlus, %4-20GenscriptM42015Western blot
Karbenisilin, Disodyum TuzuThermo Fisher10177012E. coli kolonilerinin seçilmesi
Santrifüj, Avanti J-26 XPIBeckman CoulterDüşük hızlı santrifüjleme
Santrifüj rotoru, JA-10Beckman Coulter09U1597Düşük hızlı santrifüj
Santrifüj şişesi, Nalgene PPCOThermo Fisher3120-0500PKdüşük hızlı santrifüjleme
Cu ızgaralarıElektron Mikroskobu BilimleriFF200-CuElektron mikroskobu görüntülerinin alınması
EcoRINew England BiolabsR0101Sindirim DNA plazmidi
Gelişmiş kemilüminesans algılama sistemiThermo Fisher32106Western blot
FACScalibur akış sitometresiBecton DickinsonES-D3 hücrelerinin GFP seviyelerinin incelenmesi
Fetal sığır serumuATCC SCRR-30-2020ES-D3 hücreleri için ortam
Fisherbrand Steril Hücre Süzgeçleri; Kafes Boyutu: 40 & mu; mThermo Fisher22-363-547FACS sıralaması için ES-D3 hücrelerinin filtrelenmesi
Jelatin (%0,1)Thermo FisherES006BES-D3 hücrelerinin kültürlenmesi
GM-CSF ELISA kitiThermo Fisher88733422GM-CSF konsantrasyonlarının belirlenmesi
Dulbecco'yu nakavt etme s Modifiye Kartal' ES-D3 hücreleri içinThermo Fisher10-829-018
Lösemi İnhibitör FaktörES-D3 hücreleri içinThermo FisherESG1106
ES-D3 hücreleri içinL-glutaminVWRVWRL0131-0100
Lipofektamin 2000 transfeksiyon reaktifiThermo Fisher11668019ES-D3 hücrelerini aktarma
Mikroplaka okuyucu, PowerWave XSBioTekGM-CSF konsantrasyonlarının belirlenmesi
MoFlo XDP yüksek hızlı hücre sıralayıcıBeckman CoulterTek ES-D3 hücre klonlarının izole edilmesi
NEB 5-alfa Yetkin E. coliNew England BiolabsC2988JGM-CSF ekspresyonu plazmid oluşturma
NeomisinThermo Fisher10-131-035ES-D3 klonlarının seçilmesi
Esansiyel olmayan amino asitlerES-D3 hücreleri içinSH3023801
Yağsız kuru sütThermo FisherNC9022655Western blot
Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıThermo Fisher31985062ES-D3 hücrelerinin transfekte edilmesi
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri15710Elektron mikroskobu görüntülerinin elde edilmesi
Penisilin / streptomisinVWRsc45000-652ES-D3 hücreleri için ortam
Plazmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270GM-CSF ekspresyonu plazmid
PVDF membranlarınınMillipore EMDIPVH00010Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kiti (250)QIAGEN27106GM-CSF ekspresyonu plazmid oluşturma
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti (50)QIAGEN28704GM-CSF ekspresyonu plazmidi oluşturma
Hızlı Ligasyon KitiNew England BiolabsM2200SGM-CSF ekspresyonu plazmid oluşturma
Transmisyon elektron mikroskobuHitachiHT7700Elektron mikroskobu görüntülerinin alınması
TripsinVWR45000-660ES-D3 hücrelerinin kültürlenmesi
Ultrasantrifüj, OptimaTM L-100 XPBeckman CoulterHigh hızlı santrifüjleme
Ultrasantrifüj rotoru, 45TiBeckman Coulter09U4454Yüksek hızlı santrifüjleme
Ultrasantrifüj polikarbonat şişeBeckman Coulter355622Yüksek hızlı santrifüjleme
UranyLess boyama çözeltisiElektron Mikroskobu Bilimleri22409Elektron mikroskobu görüntülerinin elde edilmesi
Karbon destek filmi ile s Medium Medium Medium OrtamıThermo Fisher Medium oluşturulması

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
  3. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  4. Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
  5. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  6. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
  8. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
  9. Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
  10. Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
  11. Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
  12. Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
  13. Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
  14. Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
  15. Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
  16. Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  17. Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
  18. Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
  19. Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289(2012).
  20. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  21. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  22. Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
  23. Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81(2018).
  24. Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
  25. Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
  26. Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  27. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
  28. Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

GM CSF A r EkspresyonuUltrasantrif j ProtokolTransmisyon Elektron MikroskobisiWestern Blot AnaliziELISA Tespit KitiEkzozom zolasyon Y ntemiH cre K lt r S pernatantEkzozomal Mark rler

İlgili makaleler