Burada domuz eti bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi için adım adım bir protokol sunulmuştur. Bu organo-tipik ekili organ kültürü modeli 15 gün içinde hücre ölüm oranlarını gösterir gibi, insan donör kornea karşılaştırılabilir, toksik dekstran eklemeden insan dışı kornea uzun vadeli ekimi sağlayan ilk modeli temsil eder.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Split Korneal Düğmeleri Kullanarak Bir Domuz Korneal Endotel Organ Kültür Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Kornea endotel hücreleri üzerinde deneysel araştırma çeşitli zorluklarla ilişkilidir. İnsan donör kornealar nadirdir ve normalde transplantasyon için gerekli olduğu için deneysel araştırmalar için nadiren kullanılabilir. Endotel hücre kültürleri genellikle in vivo durumlara iyi tercüme etmez. İnsan olmayan korneaların biyoyapısal özellikleri nedeniyle, ekim sırasında stromal şişlik önemli kornea endotel hücre kaybına neden olur, bu da uzun bir süre için ekimi yapmak zor hale getirir. Bu yanıtı etkisiz hale getirmek için dextran gibi şişme ajanları kullanılır. Ancak, onlar da önemli endotel hücre kaybına neden olur. Bu nedenle şişme ajanlar gerektirmeyen bir ex vivo organ kültür modeli oluşturulmuştur. Yerel bir mezbahadan domuz gözleri bölünmüş kornea düğmeleri hazırlamak için kullanılmıştır. Kısmi kornea trehinasyonundan sonra korneanın dış katmanları (epitel, bowman tabakası, stromanın bazı kısımları) çıkarıldı. Bu önemli ölçüde büyük stromal şişme ve Descemet membran uzun ekim dönemleri boyunca katlama tarafından indüklenen kornea endotel hücre kaybını azaltır ve endotel hücre tabakasının genel korunmasını artırır. Sonraki tam kornea trehinasyonu kalan göz soğanı ve ekimi bölünmüş kornea düğmesinin kaldırılması izledi. Endotel hücre yoğunluğu, ışık mikroskobu kullanılarak hazırlıktan 15 gün sonraya kadar (örn. 1, 8, 15 gün) takip sürelerinde değerlendirildi. Kullanılan hazırlama tekniği daha az stromal doku şişmesi ile etkin endotel hücre tabakasının daha iyi korunmasını sağlar, hangi insan donör kornea karşılaştırılabilir bölünmüş kornea düğmelerinde yavaş ve doğrusal düşüş oranları ile sonuçlanır. İlk kez bu standart organo-tipik ekili araştırma modeli en az iki hafta istikrarlı bir ekimi sağlar gibi, onların açısından çeşitli dış faktörlerin gelecekteki araştırmalar için insan donör kornealar için değerli bir alternatiftir kornea endotel üzerindeki etkileri.
Giriş
Kornea transplantasyon işlemleri dünya çapında en sık yapılan transplantasyonlar arasında dır1. İnsan donör kornea ciddi bir sıkıntısı olduğu gibi, insan kornea kornea kornea endotel hücrelerini ele deneysel araştırma1gerçekleştirmek zordur. Ancak, göz içinde kullanılan sulama solüsyonları ve diğer maddelerin, oftalmik viskoelastik cihazların yanı sıra cerrahi alet ve tekniklerin (örn. fakoemülsifikasyon aletleri ve teknikleri, ultrason enerjisi) tanıtılması, klinik kullanım dan önce kornea endotel üzerindeki etkileri ile ilgili geçerli ve kapsamlı araştırmalar.
Araştırma için insan donör kornealarına birkaç alternatif vardır. Hayvan araştırma modelleri çok değerli ama aynı zamanda çok kaynak tüketen ve giderek etik sorgulanan. In vitro hücre kültürlerinin önemli bir dezavantajı insan gözüne sınırlı çeviri olduğunu. Hücre kültürlerinden elde edilen sonuçlar in vivo koşullara uyumsuz olabilir, çünkü hücreler endotel mezenkimal geçiş (EMT) geçirebilir, bu da hücre polaritesinin kaybı ve hücre şekli ve gen değişikliklerinden kaynaklanan fibroblast benzeri morfolojiile sonuçlanabilir. ifade2.
Önceki ex vivo modelleri sadece 120 saate kadar ekim süreleri rapor ederken, en az 15 gün taze domuz korneaları kültüre getirerek bir domuz kornea endotel organ kültür modeli oluşturmak için yeni bir hazırlık tekniği son zamanlardatanıtıldı 3 3 ,4,5,6. Kornea epiteli ve stromanın parçaları ekimden önce korneadan çıkarılırsa (toplam 300 m) stromanın şişmesi bölünmüş kornea düğmelerinde azalır ve bu da daha az endotel hücre kaybına ve bakımlı endotel kaybına neden olur. hücre tabakası 15 güne kadar, bölünmemiş kornea düğmeleri ise düzensiz stromal şişlik ve Descemet kıvrımlarının oluşumuna bağlı olarak önemli endotel hücre kaybı gösterir. Göz bankaları genellikle transplantasyon öncesi kornea ların şişmesini azaltmak için dekstran gibi ozmotik deswelling ajanları kullanır. Ancak, bu ajanlar artmış endotel hücre kaybınedengösterilmiştir 7,8,9.
Bu makalede, gelecekteki araştırmacıların bölünmüş kornea düğmeleri kullanarak kornea endotel üzerinde araştırma yapmalarını sağlamak amacıyla bu standartlaştırılmış ex vivo araştırma modelini ayrıntılı bir adım adım protokolde görselleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu model, göz içi viskoelastik cihazlar, sulama solüsyonları ve ultrason enerjisi veya kornea endotellerinin ilgi çekici olduğu diğer işlemler gibi göz içinde kullanılan maddeleri ve teknikleri test etmek için basit bir yöntemi temsil eder.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol kurumumuzun etik kurallarına uygundur. Kurumumuzun etik inceleme komitesi tüzüğüne uygun olarak, tüm domuz korneaları yerel mezbahadan alındığı için deneylerden önce etik onay alınmak zorunda değildir.
1. Organ kültürü
- Domuz gözlerini hazırlayın.
- Yerel mezbahadan, kısa bir süre sonra ölümden sonra kaldırıldı domuz gözleri elde ama termal tedavi den önce. Gözleri laboratuara götürün ve birkaç saat içinde işleyin. Taşıma sırasında, işlemeden önce gözleri oda sıcaklığında (yaklaşık 21 °C) tutun.
- Göz makasve kolibri forseps kullanarak dezenfeksiyon öncesinde tüm orbital adnexes (göz kasları, konjonktiva, yağ dokusu) kaldırın. Belirgin travma, dış hasar (örn. bıçak kesme) veya görünür kornea oparesi ile tüm gözleri ayırın ve atın.
- Steril bir kapta %5 iyot-PBS çözeltisi (1:20) bir fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisine 57 mL'lik povison iyot %7,5 povison iyot ekleyerek hazırlayın. Ayrıca 60 mL saf PBS içeren ayrı bir steril bardak hazırlayın.
NOT: Kullanılan iyot-PBS çözeltisinin toplam miktarı ve kabın büyüklüğü kesilecek kornea sayısına bağlıdır. Beş ila altı göz, düzgün dezenfekte edilmesi için %5-iyot-PBS çözeltisinin yaklaşık 60 mL'sini gerektirir. - 5-iyot-PBS çözeltisi içine 5-altı göz koyun toplam 5 dakika düzgün göz yüzeyini dezenfekte etmek için. Göz yüzeyinin tamamen batmış ve iyot çözeltisinde tamamen dezenfekte edildiğinden emin olmak için her dakikayı dikkatlice karıştırın.
- 5 dakika sonra dezenfekte edilmiş gözleri saf PBS ile dolu hazır bardağa aktarın. Yine, iyot-PBS çözeltisinin göz yüzeyinden yıkandığından emin olmak için dikkatlice karıştırın.
NOT: Dezenfekte edilmiş gözlerin kirlenmesini önlemek için bu adımı temiz bir bankta gerçekleştirin.
- Hücre kültür plakaları hazırlayın.
NOT: Sabit laminar hava akışı ile temiz bir bankta aşağıdaki adımları gerçekleştirin.- Fetal baldır serumunun 2 mL'si (FCS) çözülür. Bir şırınga (5 mL) fcs ile künt bir kanül kullanarak doldurun. Şırıngayı, FCS'nin 80 mL dekstran içermeyen kültür ortamı I'e (earle tuzları, penisilin/streptomisin, L-glutamin [200 mM] ile olası bakteriyel kontaminasyonunu önlemek için şırınga filtresinden (0,22 μm) boşaltın, amphotericin B [250 μg/mL], Hepes tampon [1 M] [50x], NaHCO3, ve distile su). Hatta substrat dağılımını sağlamak için karışımı çalkalayın.
- 12 kuyulu hücre kültür plakasının her kuyuyu 3 mL substrat karışımı ile doldurun.
- Diseksiyon ve kuluçka yapın.
NOT: Bu adımı temiz bir bankta gerçekleştirin. Kornea endoteline herhangi bir aletle dokunmayın.- PBS ile bardaktan kornea yukarı bakan göz ampulü tutucu içine bir göz ampulü aktarın ve bir oftalmik cerrahi mikroskop altına yerleştirin. Biraz diseksiyon için pozisyonda göz sabitleme göz ampul tutucu üzerinde göze bazı emme uygulamak için% 0.9 NaCl ile dolu bir şırınga kullanın.
- Merkezi korneanın yüzeysel olarak kesilmesi için, trephined derinliğinin 300 μm'yi geçmemesini sağlayan standart bir kayı içeren bir trephin (ø 7,5 mm) kullanın (Şekil 1A).
- Kolibri forceps ve üçgen bıçak ile tek kullanımlık neşter kullanın kesmek ve stroma ile yatay korneakısmen trephined kısmını kaldırmak için. Kornea epiteloluşan ayrılmış kornea parçası atın, bowman tabakası, ve stroma bir parçası.
NOT: Kalan stromanın eşit kalınlığını elde etmek için yatay kesme yönünü sıkı bir şekilde koruyun. - Deneyler sırasında endotel'i stromal taraftan ayırt edebilmek için 10-0 sütür (10-0 poliamid 6) stromaya yüzeysel olarak yerleştirin(Şekil 1B). Kornea endotel penetrasyonunu önleyin. Endotel nüfuz edilirse göz ampulü atın.
NOT: Ön göz odasından gelen sıvı dikiş kanalından sızacağı için kornea endotellerinin dikiş iğnesi ile penetrasyonu görülebilir. - Ön göz odasına ulaşılına kadar trephined kesim tam derinliğe ilerlemek için kayı olmadan trephine kullanın (Şekil 1C). Anterior göz odasından sızan direnç ve sıvıda belirgin bir düşüş korneanın tam penetrasyonundan sonra algılanabilir.
NOT: Bölünmüş kornea düğmesi trephination sonra bölünmüş kornea düğmesinin bir tarafında bağlı kalırsa bir hokey bıçağı kullanın. - Elde edilen bölünmüş kornea düğmesini, şimdi stroma bir parçası oluşan(Şekil 2),Descemet membran ve kornea endotel, kültür ortamı (kültür orta I + FCS, bölüm 1.2 bakınız) içine 12 kuyu hücre kültür plakası içine aşağı bakan etiketli tarafı, böylece kornea endotel yukarı bakıyor.
NOT: Endotel tarafı aşağı bakacaksa, endotel zarar görebilir. - Takipler sırasında kimlik tespiti için her bölünmüş kornea düğmesine ayrı bir numara atayın ve hücre kültür plakasındaki kuyuları buna göre etiketleyin.
- Dolu hücre kültür plakalarını standart koşullar altında 37 °C, %5 CO2
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sunulan diseksiyon tekniği stromal dokunun kısmi olarak çıkarılması, daha ince kornea örneği ve dolayısıyla daha az stromal şişlik ile sonuçlanan anlamına gelir(Şekil 1 ve Şekil 2). Daha az stromal şişlik kornea endotel üzerinde olumsuz bir etkiye sahip daha az makas ve çimdik kuvvetleri neden olur, böylece daha düşük endotel hücre kaybı oranları neden6. Bölünmüş kornea düğmeleri, 15 günlük ekimden sonra, ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol araştırma amaçlı standart ve düşük maliyetli ex vivo kornea endotel organ kültür modeli temsil domuz bölünmüş kornea düğmeleri, hazırlanması için bir yöntem sağlar6. Domuz bölünmüş kornea düğmeleri iki haftalık bir süre içinde göz bankalarında ekili insan donör korneagöz görülen endotel hücre kayıpları ile karşılaştırılabilir endotel hücre yoğunluğunda bir azalma gösterdi6,10,11, <...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Sunulan araştırma modelinin kurulması, Almanya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'nın KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
2
1 L HO başına
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Konu | |||
| Domuz gözleri | yerel abbatoir | ||
| Maddeler | |||
| Alizarin kırmızısı S | Sigma-Aldrich, ABD | ||
| Kültür Ortamı 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Almanya | ||
| Dulbecco'nun PBS (1x) | Gibco, ABD | ||
| Fetal buzağı serumu | Biochrom GmbH, Almanya | ||
| Hidroklorik asit (HCl) çözeltisi | kendi üretimi | ||
| kendi üretimi | Hipotonik dengeli tuz çözeltisi | : NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0,49 g; MgCl2 x H2O 0,3 g; Sodyum Asetat x 3 H2O 3,9 g; Sodyum Sitrat x 2 H2O 1,7 g | |
| Povidon iyot %7,5, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Almanya | ||
| Sodyum klorür (NaCl) %0,9 | B. Braun Melsungen AG, Almanya | ||
| Sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi | kendi üretimi | ||
| Tripan mavisi %0,4 | Sigma-Aldrich, ABD | ||
| < güçlü > Malzeme & Aletler | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Almanya | ||
| Beher Camı 50 mL | Schott AG, Almanya | ||
| Künt kanül, Filtre dahil (5 ve mikro; m) 18G | Becton Dickinson, ABD | ||
| Hücre kültürü plakası (12 kuyulu) | Corning Inc., ABD | ||
| Colibri forseps | Geuder AG, Almanya | ||
| Kornea makası | Geuder AG, Almanya | ||
| Eppendorf pipet | Eppendorf AG, Almanya | ||
| Göz Ampulü Tutucu | L. Klein, Almanya | ||
| Göz makası | Geuder AG, Almanya | ||
| Katlanmış Filtre ø 185 mm | Whatman, ABD | ||
| Hokey bıçağı | Geuder AG, Almanya | ||
| Kapaklı Laboratuvar Cam Şişesi 100 mL | Schott AG, Almanya | ||
| Manyetik karıştırma çubuğu | Carl Roth GmbH & Co. KG, Almanya | ||
| MillexGV Filtre (5 & mikro; m) | Merck Millopore Ltd., ABD | ||
| İğne tutucu | Geuder AG, Almanya | ||
| Petri kapları | VWR International, ABD | ||
| Pipet uçları | Sarstedt AG & Co., Almanya | ||
| Neşter (tek kullanımlık), üçgen bıçak | Aesculap AG & Co. KG, Almanya | ||
| Serolojik pipet 10 mL | Sarstedt AG & Co., Almanya | ||
| Serolojik pipet 5 mL | Sarstedt AG & Co., Almanya | ||
| Steril kaplar | Greiner Bio-One, & Ouml; sterreich | ||
| Steril eldiven | Paul Hartmann AG, Almanya | ||
| Steril cerrahi örtü | Paul Hartmann AG, Almanya | ||
| Dikiş makası | Geuder AG, Almanya | ||
| Sütür Ethilon 10-0 Polyamid 6 Ethicon | Inc., ABD | ||
| Şırınga (5 mL) | Becton Dickinson, ABD | ||
| Trephine & Oslash; 7,5 mm | kendi üretimimiz | ||
| Bağlama forseps | Geuder AG, Almanya | ||
| Tartı kağıdı | neoLab Migge GmbH, Almanya | ||
| Ekipman & Yazılım | |||
| Binoküler cerrahi mikroskop | Carl Zeiss AG, Almanya | ||
| Mikroskop üzerine monte edilmiş kamera | Olympus, Japonya | ||
| CellSens Giriş (yazılım) | Olympus, Japonya | ||
| Soğuk ışık kaynağı | Schott AG, Almanya | ||
| İnkübatör: | Heraeus GmbH, Almanya | ||
| Ters faz kontrast mikroskobu | Olympus GmbH, Almanya | ||
| Isıtma fonksiyonlu manyetik karıştırıcı | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Almanya | ||
| pH-metre pHenomenal | VWR International, ABD | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, ABD | ||
| Hassas terazi | Ohaus Europe GmbH, İsviçre |
Kaynaklar
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
