Yöntem makalesi

Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemi ile O2'nin Lüminesans Yaşam Boyu Görüntülemesi

DOI:

10.3791/60191

⸱

16 Aralık 2019

 ,  ,  ,  , 
1Marine Biological Section, Department of Biology, University of Copenhagen, 2Center for Electromicrobiology, Aarhus University, 3PCO AG, 4Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 5Aarhus University Centre for Water Technology, Section for Microbiology, Department of Bioscience, Aarhus University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optik sensör folyoları ile 2D O2 dağıtımlarının haritalama için yeni, frekans etki alanı parlaklık ömür boyu kamera kullanımını anlatıyoruz. Kamera sistemi ve görüntü analizi prosedürleri, su bitkilerinin rizosferinde O2 mikro ortamının görselleştirilmesi için sensör folyolarının hazırlanması, kalibrasyonu ve uygulanması ile birlikte açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çözünmüş oksijeni (O2),2B'de yüksek uzamsal (< 50-100 μm) ve zamansal (< 10 s) çözünürlükte görüntülemek için bir yöntem tanımlıyoruz. Bu yöntem, frekans etki alanında parlaklık ömrünü görüntülemek için özel bir kamera sistemi ile birlikte O2 hassas Parlak sensör folyoları (düzlemsel optodlar) kullanır. Düzlemsel optodeler, O2-hassasgösterge boyasının bir polimer içinde çözülmesi ve karışımın bıçak kaplaması ile tanımlanmış bir kalınlıkta katı bir destek üzerine yayılması ile hazırlanır. Çözücü buharlaşma sonra, düzlemsel optode ilgi örneği ile yakın temas yerleştirilir - burada su bitki Littorella uniflorakökleri ile gösterilmiştir. Düzlemsel optod içindeki gösterge boyanın parlaklık ömründeki O2 konsantrasyonuna bağlı değişim, şeffaf taşıyıcı folyo ve akvaryum duvarının arka tarafı üzerinden özel bir kamera kullanılarak görüntülenir. Bu kamera, modüle edilmiş bir uyarma sinyali ile emisyon sinyali arasındaki faz açısındaki bir kayma yla parlaklık ömrünü (μs) ölçer. Bu yöntem, sinyal uyarma kaynağının boya konsantrasyonu veya yoğunluğundan bağımsız olduğundan ve sadece doğal olarak başvurulan bir parametre olan lüminesans bozunma süresine dayandığından, lüminesans yoğunluğu görüntüleme yöntemlerinden daha üstündür. Sonuç olarak, ek bir başvuru boyası veya diğer başvuru araçları gerekmez. Biz bitki rizosferlerin makroskopik O2 görüntüleme için sistemin kullanımını göstermek, ancak kamera sistemi de kolayca bir mikroskop ile birleştiğinde olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tortular ve topraklarda çözünmüş gazların ve iyonların dağılımı ve dinamiği mikrobiyal solunum1,2veya bitki köklerinden radyal oksijen kaybı3,4,5gibi biyojeokimyasal süreçler hakkında önemli bilgiler sağlar ve mikropların kimyasal mikroortamı6,7, bitki rizosferleri5,8,9 ve hayvan yuvaları10, 11,12. Bu tür difüzyon sınırlı ortamlarda biyolojik ve kimyasal aktivite kimyasal yüzeyler veya biyojeokimyasal süreçlerin ürünlerinin dik gradyanlar oluşturabilirsiniz. Özellikle, O2 kullanılabilirliği biyojeokimyasal süreçler ve böylece biyoloji ve bir sistemin ekoloji üzerinde büyük bir etkisi vardır13. Bu nedenle, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlükte O2 konsantrasyonlarının analizi su ve karasal bilimlerde büyük önem taşımaktadır. İlk olarak, elektrokimyasal ve optik mikrosensörler14,15 bu önemli analit ölçmek için geliştirilmiştir. Daha sonra, 2 boyutlu (2D) düzlemsel optodlar ile O2 görüntüleme tanıtıldı12,16,17,18,19, hangi görüntüleme ve toprak ve tortularda heterojen O2 dağılımı nın niceleme sağladı.

Düzlemsel O2 optodes uygun bir polimer21içinde çözünmüş bir O2-hassas gösterge boya20oluşur. Gösterge boya belirli optik dalga boylarında heyecanlı ve parlaklık şeklinde gevşeme üzerine kırmızı kaydırılmış ışık yayan. O2varlığında , heyecanlı gösterge boya çarpışma üzerine O2 molekülüne enerji aktarabilirsiniz, çarpışma tabanlı lüminesans söndürme olarak adlandırılır22. Bu nedenle, parlaklık yoğunluğu yanı sıra parlaklık ömrü artan O2 konsantrasyonu ile azalır23. İdeal bir durumda yoğunluk ve yaşam süresindeki değişim, belirli bir konsantrasyonda Parlaklık yoğunluğunu veya yaşam sürelerini (I0; τ0) veya O2'nin varlığını (I, τ) kullanarak Stern-Volmer denklemini (denklem 1) takip eder [Q]. Stern-Volmer sabiti (Ksv),optodun O2'yekarşı duyarlılığıiçin bir ölçüdür; KSV sıcaklık ve basınç gibi çevresel değişkenlere bağlıdır.

(1)figure-introduction-1

O2 dağılımındaki ilgili değişiklikleri görselleştirmek için düzlemsel sensör folyosu üzerinden kamera sistemi ile bu tür değişikliklerin kaydedilmesi kullanılabilir. Başlangıçta basit parlaklık yoğunluğu tabanlı O2 görüntüleme18kullanılmıştır. Ancak, bu tür metodoloji, heterojen aydınlatma, uyarma kaynağı veya kameradaki dalgalanmalar ve düzlemsel optod içinde gösterge boyasının düzensiz dağılımı nedeniyle sonuçların güvenilirliğini tehlikeye sokan dış parazitlere karşı çok hassastır.

Bu sınırlamalardan bazıları, O 2 duyarlı gösterge boyasının,O2-göstergesinden farklıbir spektral aralıkta yayılan duyarsız bir referans boya ile düzlemsel optodun polimer tabakasında birlikte immobilize edildiği ratiometrik görüntüleme17,24için düzlemsel optodlar kullanılarak hafifletilebilir. İki spektral pencerede edinilen emisyon görüntülerine dayanarak, O2duyarlı emisyon sinyali referans sinyali ile bölünür ve yukarıda belirtilen parazitlere daha az yatkın bir oran görüntüsü oluşturur5,17. Bu yöntem, ideal olarak aynı uyarma kaynağı tarafından heyecanlanabilen, ancak kameranın başka bir spektral penceresinde (örneğin, bir RGB kameranın başka bir renk kanalında) farklı bir dalga boyunda (önemli bir spektral çakışma olmaksızın) yayan ikinci bir boyanın kullanılmasını gerektirir.

Alternatif olarak, O2 görüntüleme gösterge konsantrasyonu25'tekidüzensiz aydınlatma veya heterojenliklerden etkilenmeyen gösterge boyanın parlaklık ömründeki O2'yebağımlı değişimin ölçülmeye dayandırılabilir. İlk parlaklık ömür boyu o2 görüntüleme sistemleri bir kapı şarj lı cihaz (CCD) kamera sistemi26ile zaman etki alanı ölçümleri dayalı, bir darbeli uyarma kaynağı kullanılır ve parlaklık görüntüleri göstergesi 8 uyarma veya emisyon içinde tanımlanmış zaman aralıkları üzerinden alınır8,23,27. Bu görüntülerden, parlaklık ömrü belirlenebilir ve bir kalibrasyonda ilgili O2 konsantrasyonu ile ilişkili olabilir. Daha sonra, düzlemsel optoda karşı preslenmiş belirli bir örnek için parlaklık ömrü görüntüleri O2 konsantrasyonu karşılık gelen 2D dağılımı görüntüleri dönüştürülebilir. Bu sistem laboratuvar ve yerinde16,28,birçok uygulamada kullanılmıştır, ancak temel kapı-mümkün CCD kamera artık ticari olarak kullanılabilir.

Son zamanlarda, frekans-etki alanı8görüntüleri elde eden farklı bir parlaklık ömür boyu kamera sistemi, serbest bırakıldı. Sistem uyarma için sürekli olarak modüle edilmiş bir ışık kaynağına dayanır. Bu ya zaman alanında görüntü edinimi için kullanılan bir darbeli uyarma yerine bir sinüzoidal veya kare dalga olabilir. Bu modülasyon, o2 gösterge boyasının modüle edilmiş bir parlaklık salınımı ile sonuçlanır, bu da bir açı ile faz-shifted, φ, hangi gösterge boya parlaklık ömrüne bağlıdır (τ) (bkz. denklem 2).

(2)figure-introduction-2

Uyarma ve emisyon genliği arasındaki değişim (yani, modülasyon indeksi veya derinliği (genlik sabit parlaklık parçasıile bölünür)) arasındaki değişim de parlaklık ömrüne bağlıdır. Yani, bilinen bir modülasyon frekansı ayarlayarak kamera içinde özel CMOS görüntü sensörü başkabir yerde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ns içinde parlaklık ömrünü ölçmek mümkün 8,29,30. Çalışma prensibi hakkında genel bir kılavuz bulunabilir (aşağıdaki bağlantı https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8kullanılarak).

Aşağıdaki protokolde, biz 2D9,31suda tatlı su bitki Littorella uniflora kökleri etrafında O2 konsantrasyonu dağılımı görüntüleme için yeni kamera sisteminin kullanımını göstermektedir. Bu yöntemin hiçbir şekilde bu uygulamayla sınırlı olmadığını vurgulamak isteriz. Oksijene duyarlı optodlar veya sensör parçacıkları27 çeşitli görüntüleme yöntemleri ile birlikte tıbbi araştırmakullanılmıştır 32, biyobaskı33, basınca duyarlı boyalar için34,35, veya fotosentetik sistemleri incelemek için2,36,37, sadece uygulamanın birkaç diğer alanları isim.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Düzlemsel O2 optod imalatı

  1. Çözün 1.5 mg lüminesan O2 indikatör boya platin(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentaflorfenil)-porfirin (PtTFPP) ve 100 mg polistiren (PS) kloroformin 1 g olarak adlandırılan 'sensör kokteyl' almak için.
    NOT: Kokteyl kapalı, gaz geçirmez cam şişede buzdolabında birkaç saat bekletilebilir ve daha fazla kullanıma kadar karanlıkta.
  2. Temiz, tozsuz polietilen tereftalat (PET) folyo (uygulamaya bağlı boyut) bir su veya etanol yardımı (p) yardımıyla temizlenmiş cam plaka üzerinde tamir film (Şekil 1A).
  3. Temizlenmiş bıçak kaplama cihazını (120 μm) folyoya yerleştirin ve sensör kokteylinin bir satırını cam pipet kullanarak cihazın önüne uygulayın(Şekil 1B). Daha sonra, kokteyli eşit olarak yaymak için bıçak kaplama cihazını PET folyoüzerinde yavaşça ve düzgün bir şekilde sürükleyin.
    NOT: Tüm malzeme ve aletler iyice temizlenmeli ve üretim duman kaputu, akış tezgahı veya bir nokta emme cihazının altında tozsuz bir ortamda yapılmalıdır. Son sensör folyosındaki heterojenlikleri önlemek için, kloroform hızlı buharlaştığı ndan, sensör kokteylinin folyoya uygulanmasını takip eden adımlar hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
  4. Bitmiş düzlemsel O2-hassas optode'u ortam havasında 1 saat boyunca kurutun ve daha sonra 50-60 °C'de bir ısıtma kabininde gece boyunca, üretilen optodları karanlıkta (örneğin, kağıt zarfiçinde)daha fazla kullanıma kadar saklayın .
    NOT: Düzlemsel O2 optodes kuru ve karanlıkta birkaç ay için yıllar önce kullanılabilir. 1-20 μm arasında değişen son tabaka kalınlığı, yeterli parlaklık sinyali ve yeterli yanıt süreleri ile iyi sonuçlar verdiği kanıtlanmıştır.

2. Rhizo-sandviç odası

  1. İki cam plakayı (24,5 x 14 cm2,

























figure-protocol-1


Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni görüntüleme sistemi için bir uygulama örneği olarak, karmaşık bir biyolojik numunenin 2D O2 görüntülemesini (yani, su bitkisi Littorella uniflora'nınrizosferini) gösteriyoruz.

İlk olarak, yöntem bir düzlemsel sensör film, sözde düzlemsel optode imalatı açıklar. Şekil 1'degörüldüğü gibi, böyle bir optod şeffaf bir destek üzerine yayılan bir polimer matrisoptik gösterge ince bir tabakadan yapılır. Açıklanan protokoliz uyarınce, bıçak kaplama cihazının boşluğunda tanımlandığı gibi tek tip kalınlığa sahip homojen bir sensör filmi elde edilir. Üretilen optod yamalı bir sensör malzeme dağılımına sahipse (örn. kaplamadaki delikler, çizgiler veya boya agregaları (bu görsel olarak ve görsel olarak uv lambası yardımıyla değerlendirilebilir)), protokolün tekrarlanması ve tüm malzemelerin aseton kullanılarak iyice temizlenmesi gerekir.

Düzlemsel optod hazırlandıktan sonra, numune düzlemsel optodun algılama tabakası ile yakın temas halinde getirilebilir, burada bir rizo-sandviç odasına entegre düzlemsel optod ile gösterildiği gibi, çevredeki bir tortu matrisi içindeki bir bitkinin kökleri düzlemsel optoda yakın temas içinde konumlandırılabilir(Şekil 2). Doğru hazırlanırsa, rizo-sandviç odası bir akvaryumdan (kuluçka) diğerine (ölçüm) kolayca taşınabilir olmalıdır. Doğru inşa edilmezse, rizo-sandviç odası kararsız olabilir, tortu kaybedebilir veya hava kabarcıkları içerebilir. Bu nedenle, rizo-sandwich haznesinin montajdan hemen sonra görsel muayenesi önerilir.

Verilen protokol, frekans etki alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamerayı kullanarak düzlemsel optoda ile temas eden numunenin frekans-etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu görüntülemesini sağlar. Görüntü edinme modu ve bilimsel tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken (SCMOS) kamera özellikleri gibi bu kamera sistemi hakkında daha fazla bilgi son yayınlarda verilmiştir8,29.

Kurulumun kendisi oldukça basittir ve sadece bir ışık kaynağını (bu durumda, bir LED uyarma kaynağı) ve optodlu örneği kontrol eden kamerayı içerir (Şekil 3). Tüm parçaların doğru bir şekilde bağlandığından ve numunenin homojen bir şekilde aydınlatıldığından emin olun. Ölçümleri önceden şekillendirirken arka plan ışıklarından kaçınılmalıdır.

Numunenin görüntülenmesinden önce, optodun kalibre edilmesi gerekir. Şekil 4A'dagörüldüğü gibi, ölçülen lüminesans ömrü yarı-üstel bozunmayı takiben artan O2 konsantrasyonu ile azalır. Bu ilişki basitleştirilmiş iki siteli model(Şekil 4B ve denklem 3) kullanılarak da tanımlanabilir. Verilen örnekte, O2 konsantrasyonu daha sonra hesaplamak için gerekli parametreler aşağıdaki gibidir; τ0 = 56,26 μs, Ksv = 0,032 hPa-1 ve f = 0,86.

Kalibrasyon yapmak, sistemin doğru çalıştığını test etmek için de ideal bir yoldur. Tüm bileşenler burada açıklandığı şekilde (veya üreticilerin yönergeleri dahilinde) yüklenmişse, ölçülen ömür Şekil 4'tegörüldüğü gibi aynı O2 bağımlılığını göstermelidir. Buna ek olarak, O2 algılama malzemelerinin (polimer ve boya) aynı kombinasyonu için, ölçülen τ0 burada ölçülen (özellikle deneysel sıcaklıktan etkilenmiş) aynı aralıkta (± birkaç μs) olmalıdır. Benzer bir kalibrasyon eğrisi elde edemiyorsanız, tüm adımların doğru şekilde izlendirilip izlendirildik. Bazen optode yanlışlıkla örnek yerine cam duvara bakan hassas tarafı ile sabitlenir, ya da elde edilen görüntüler üzerinde veya az pozlanmış.

Kalibrasyon parametreleri ile Lüminesans ömrünü (τ) görüntüleyerek O2 konsantrasyonu belirlemek mümkündür. Bu şekil 5A, Bgösterilmiştir , Littorella uniflora rizosferde O2 konsantrasyonunun dağılımı karanlıkta görüntülendi ve ışık maruziyeti sonra 500 μmol fotonm m -2 s-1 için 12 saat, sırasıyla. Bitkinin fotosentetik aktivitesi nedeniyle, rizosferdeki O2 konsantrasyonu ışığa maruz kaldıktan sonra artmıştır. Yaşam boyu görüntülerin yanı sıra, görüntüleme geometrisi sabit tutarken, dış aydınlatma altında da "yapısal" görüntüler elde edilebilir. Bu şekilde, O2 görüntüleri yapısal görüntü(Şekil 5C),kesitler veya ilgi bölgeleri ile tam olarak ilişkili olabilir. Örnek olarak, tek bir kök üzerindeki O2 konsantrasyon profilleri sırasıyla karanlık ve ışıkta elde edilen görüntüden çıkarılabilmiştir (Şekil 5D).

figure-results-1
Şekil 1: Düzlemsel O2 optod imalatı. (A) Pet folyo cam bir plaka üzerine sabitlenir ve bıçak kaplama cihazı folyoüzerine yerleştirilir. (B) Hazırlanan sensör kokteyli, pet folyoya bıçak kaplama cihazının önünde ince bir çizgi olarak yayılır. (C) Bıçak kaplama cihazı, sensör kokteylini PET folyo üzerinde ince bir film olarak yaymak için aşağıya doğru hareket ettirilir ve solvent buharlaşması düzlemsel optode kullanmaya hazır olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Bir düzlemsel O2 optod entegrasyonu ile rhizo-sandviç oda montaj. (A) Optode bir su filmi kullanılarak cam plakalardan birine sabitlenir. (B) Optod elektrikli bant ile plakaya yapıştırılır. (C) Tortu, bağlı boşluklarla (yani mikroskop slaytları) karşı plakaya doldurulur. (D) Bitki kökleri eşit şekilde yayılan tortu üzerine yerleştirilir. (E) Rhizo-sandwich haznesi kapatılır ve geçici olarak kelepçelerle sabitlenir. (F) Tamamen kapalı ve monte rhizo-sandviç odası. (G) Optoda'yı kuluçka lambası ile ışığa maruz kalmaktan korumak ve alg büyümesini önlemek için monte edilmiş rhizo-sandviç odasının üzerine plastik bir kapak yerleştirilir. (H) Rhizo-sandviç odası bir akvaryumda kuluçkaya yatırılabıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Frekans-etki alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamera içeren görüntüleme kurulumu, amaç şeffaf akvaryum ve rizo-sandviç odası duvarları ile arkadan optode ile örnek odaklanmış. LED uyarma kaynağının ışık kılavuzu, numuneyi eşit olarak aydınlatmak için konumlandırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Düzlemsel O2 optod için kalibrasyon eğrileri. (A) Su dolu kalibrasyon odasındaki ilgili O2 konsantrasyonlarında ölçülen farklı fosforluk ömürleri. (B) Dinamik çarpışma söndürme için basitleştirilmiş iki siteli model kullanılarak donatılmış kalibrasyon verilerinin Stern-Volmer çizimi (denklem 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Su bitkilittorella uniflorarizosferde O2 dağılımıömür boyu görüntüleme . (A) O2 dağılımı yaklaşık 500 μmol fotonm -2 s-1 de 12 saat boyunca ışık altında bitki tuttuktan sonra . (B) O2 dağılımı, bitkiyi 1 saat karanlığa tuttuktan sonra (C) Düzlemsel optoddan görülen bitki köklerinin yapısal görüntüsü. (D) Kesitsel O2 konsantrasyon profili (konum A ve B panelindeki sarı çizgi ile gösterilir) 12 saat açık (kırmızı) ve 1 saat karanlıkta (siyah) sonra. (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Yaşam Boyu Kimyasal SensörlerGörüntüleme - Zaman-Etki Alanı ve Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemleri arasında bir karşılaştırma izni ile uyarlanmıştır. Analitik Kimya. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Telif Hakkı (2019) Amerikan Kimya Derneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde optode hazırlığından O2 görüntü analizine kadar tüm iş akışı ele alınmıştır. Bu protokolü izleyerek, kimyasal görüntüler yeni frekans-etki alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamera kullanılarak elde edilebilir. Uygulamaya bağlı olarak, düzlemsel optodlar sensör tabakasının çeşitli boyutlarda ve katman kalınlığında, santimetre karesantimetrenin birkaç onda birinden mikroskop kapak lı ve <1 μm kalınlığında sensör katmanları6,40arasında değişen katman kalınlığında imal edilebilir. Bu yöntemin potansiyeli belirli bir uygulama ile gösterilmiştir, ancak bitki rizosferlerinde O2 görüntüleme ile sınırlı değildir12,28.

Bu yöntem, saf parlaklık yoğunluğu tabanlı kimyasal görüntüleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında çeşitli faydaları vardır. Luminescence ömür boyu görüntüleme değil, ya da en azından çok daha az, düzensiz aydınlatma, düzensiz optod kalınlığı etkilenen ve fotoğraf ağartma25. Ayrıca, bu yöntem oranmetrik görüntüleme17,37ortak ek bir referans boya kullanımını önler. Diğer yaşam boyu tabanlı kamera sistemleri ile karşılaştırıldığında, yaygın olarak kullanılan gated zaman-etki alanı kameralar gibi8,26, burada sunulan yeni kamera sistemi ve protokol karşılaştırılabilir sonuçlar sunabilir. Yakın tarihli bir yayında, bu iki sistemin analitik özellikleri karşılaştırıldı ve frekans-etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu kamera sistemi en azından durdurulan zaman etki alanı tabanlı selefi8karşılaştırılabilir olduğu bulundu .

Sadece polimer matristeki bir göstergeden oluşan en basit O2 optod'u sunduk. Birçok olası O2 göstergeleri yanı sıra20 bu katkı maddeleri kullanılabilir, yani, tio2 veya elmas tozu2 gibi saçılma ajanları sensör sinyalini artırmak için optod şeffaflığı azaltırken. Ayrıca ek boyalar enerji transferi41ile sinyal yoğunluğunu artırmak için kullanılabilir.

Düzlemsel optode imalatı için, tarif edilen sensör kokteyl bileşimini kullanırken, solvent buharlaşmasından sonra 7,5 ila 12 μm civarında son sensör tabakası kalınlığı nı (kullanılan boşluğun yaklaşık %10'u) vermek için 75 - 120 μm'lik bıçak kaplama cihazında bir boşluk kullanmanızı öneririz. Bu, daha yüksek boya yüklemesi veya daha yüksek parlaklık gösterge ve referans boyaları ve yanıt süresi seçilerek değiştirilebilen sinyal yoğunluğu arasında iyi bir uzlaşmadır. Katman kalınlığındaki artış tepki süresinin artmasına neden olur, çünkü analitin çevredeki ortamla algılama katmanında termodinamik dengeye ulaşması için gereken zaman aralığı12'yeçıkar.

Burada açıklandığı gibi optodeler, o2 konsantrasyonundaki değişikliklere birkaç saniye içinde tepkiverirler 17. Ultraince sensör kaplamaları ile saniyenin altında tepki süreleri spin kaplama6ile gerçekleştirilebilir. Destek veya bıçak kaplama cihazı iyi temizlenmemişse, homojen sensör katmanlarına neden olabilir. Ayrıca, kokteyl tamamen homojen olmadığında veya kaplama cihazının önüne yayıldıktan sonra çok hızlı uygulandığında böyle istenmeyen bir sonuç görülebilir. Bu nedenle, en iyi optodes hazırlamak için bazı uygulama gerekebilir.

Bu yöntem, optode yakın temas halinde konulabilir görüntü örnekleri için kullanılabilir, bazı deniz hayvanları gibi42, biyofilm6 ve toprak31 sadece birkaç isim. Biz bir amaç kullanarak bağımsız bir kurulum mevcut, ancak, kamera kolayca daha yüksek çözünürlüklü kimyasal görüntüleme için bir mikroskop birleştiğinde olabilir43.

Zaman etki tabanlı lüminesans ömür boyu görüntüleme arka plan floresan26bastırılması etkin iken, bu yeni frekans etki alanı tabanlı kamera sistemi kullanırken bir sorundur8. Sürekli görüntü edinimi sayesinde, bu kamera seçilen LED tarafından heyecanlanabilecek herhangi bir arka plan floresanını kaydeder ve seçilen spektral pencereye kamera hedefindeki emisyon filtresi tarafından tanımlandığı şekilde yayır. Bu görünüşte daha düşük bir ömür boyu ve sonuç olarak yanlış okumalar neden olacaktır. O2 sensör uyarma ve emisyon ile örtüşen önemli bir içfloresan floresan örnekleri ile çalışmak durumunda, karbon siyahı içeren ek bir tabaka kaplama tarafından optod üstüne ekstra bir optik izolasyon uygulamak esastır2,17. Böylece, sadece düzlemsel optod yayılan parlaklık kamera ulaşacaktır. Arka plan parlaklığını kontrol etmek için optode olmayan bir görüntü alınabilir, bu da sadece numunenin içsel parlaklığını gösterir. Gösterge boyanın parlaklık yoğunluğunu artırmak için sensör kokteyline TiO2 veya elmas tozu2,44gibi saçılma ajanları eklemek de mümkündür. Ancak, bu da daha hızlı fotoğraf ağartma yol açabilir ve TiO2 bilinen bir fotoğraf katalizörü, bir boya fotostabilite bozabilir41. Göz önünde bulundurulması gereken bir başka yönü de arka plan ışığıdır. Parlaklık yaşam ları görüntülendiğinde, arka plan ışığının mümkün olduğunca verimli bir şekilde kaçınılması gerekir. Bu nedenle, bu görüntüleme yöntemi kurulumun karanlık bir ortama yerleştirilmesini gerektirir ve görüntü edinimi sırasında herhangi bir dış ışık kaynağının geçici olarak kapatılması gerekir.

Özetle, parlaklık ömür boyu görüntüleme birçok farklı uygulamalara adapte edilebilir sağlam bir kimyasal görüntüleme yöntemidir. Bu protokol (bkz. bölüm 1 - 5) Bir O2 görüntüsü oluşturmak için gerekli tüm adımları kapsar ve 2D O2 görüntüleme için durdurulan devre arası kameranın yerine düzlemsel optodeler ile değiştirebilen şu anda en esnek frekans etki alanı parlaklık ömür boyu görüntüleme sistemini kullanır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar Gerhard Holst bu makalede kullanılan kamera sistemi üreten PCO AG bir çalışanıdır. PCO AG, bu makalenin yayınlanmasına ve açık erişim maliyetlerine mali katkıda bulunmuştur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Teknik yardım için Sofie Lindegaard Jakobsen (Kopenhag Üniversitesi) ve Lars Borregaard Pedersen (Aarhus Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışmanın finansmanı, Bağımsız Araştırma Fonu Danimarka'dan (DFF-1323-00065B; MK), Bağımsız Araştırma Fonu Danimarka proje hibe | Fen Bilimleri (DFF-8021-00308B; MK) & Teknik ve Üretim Bilimleri (DFF-8022-00301B ve DFF-4184-00515B; MK), Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı (DNRF136) ve Poul Due Jensen Vakfı (KK).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hava, taş ve su pompalı hava pompasıYerel akvaryum mağazası
ChloroformSigma Aldrich67-66-3
DC4 silikon bileşiğiDow Corning GmbH2793695
Gaz karıştırıcıVö gtlin Instruments GmbHred-y kompakt sayaç GCMBu sadece bir olası cihazdır. Birçok şirket gaz karıştırma cihazları sunmaktadır
Cam tabaklar ve akvaryumYerel akvaryum veya hırdavatçı
ImageJ Yazılımı ImageJÜcretsiz olarak kullanılabilen görüntüleme yazılımı (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Bıçak kaplama cihazı

BYK-GARDNER GMBH		2021Bu, film kalınlığının kolayca değiştirilmesini sağlayan dört taraflı bir film aplikatörüdür. Diğer versiyonlar da mevcuttur. Uygulanan filmin kalınlığının 75-120 & arasında olmasını öneririz; m, solvent buharlaşmasından önce uygulanan kalınlığın ~%10'u kadar bir nihai sensör katmanı kalınlığı verir.
LED lamba, Reflektör PAR38MegamanMM17572
LED LEDHUBOmicon Laserage, AlmanyaÇeşitli LED'lerle yapılandırılabilir. Sunulan örnek için, yeşil LED (528 nm) esastır
LOCTITE AA 3494Henkel AG & Co. KGaANAAkrilik bazlı anında yapıştırıcı
NIS Elements AR YazılımıNikon IncGörüntü elde etmek için kullanılan yazılım paketi
pco.flimPCO AG, AlmanyaFrekans alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamera
platin (II) -5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentaflorfenil)-porfirin (PtTFPP)Frontier ScientificPtT975O2 indikatör
polietilen tereftalat (PET) folyoGoodfellow320-992-72Bu tür folyolar diğer sağlayıcılardan da bulunabilir ve katı destek görevi görebilir
Polistiren (PS)Sigma Aldrich9003-53-6Polimer matris
Schott RG610 filtrewww.uviroptics.comBurada 52mm vidalı filtreler elde edilebilir. Diğer kaynaklar, objektifin önüne sabitlenebilen Schott camından kare cam filtreler sunar
Vinil elektrik bandıScotch, Super 33+NA
Zeiss Makro Planar 2/100, Hama C ile Nikon adaptörü içinmakinesiyleBurada, objektifin bir C-yuvası yoksa, başka herhangi bir objektif de bir adaptörle birlikte kullanılabilir
byk.com fotoğraf birlikte teslim edilir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Glud, R. N., Kühl, M., Kohls, O., Ramsing, N. B. Heterogeneity of oxygen production and consumption in a photosynthetic microbial mat as studied by planar optodes. Journal of Phycology. 35 (2), 270-279 (1999).
  2. Moßhammer, M., Strobl, M., Kühl, M., Klimant, I., Borisov, S. M., Koren, K. Design and Application of an Optical Sensor for Simultaneous Imaging of pH and Dissolved O2 with Low Cross-Talk. ACS Sensors. 1 (6), 681-687 (2016).
  3. Jensen, S. I., Kühl, M., Glud, R. N., Jørgensen, L. B., Priemé, A. Oxic microzones and radial oxygen loss from roots of Zostera marina. Marine Ecology Progress Series. , 49-58 (2005).
  4. Larsen, M., Santner, J., Oburger, E., Wenzel, W. W., Glud, R. N. O2 dynamics in the rhizosphere of young rice plants (Oryza sativa L.) as studied by planar optodes. Plant and Soil. 390 (1-2), 279-292 (2015).
  5. Brodersen, K. E., Koren, K., Moßhammer, M., Ralph, P. J., Kühl, M., Santner, J. Seagrass-Mediated Phosphorus and Iron Solubilization in Tropical Sediments. Environmental Science and Technology. 51, 14155-14163 (2017).
  6. Kühl, M., Rickelt, L. F., Thar, R. Combined imaging of bacteria and oxygen in biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 73 (19), 6289-6295 (2007).
  7. Sønderholm, M., et al. Tools for studying growth patterns and chemical dynamics of aggregated Pseudomonas aeruginosa exposed to different electron acceptors in an alginate bead model. npj Biofilms and Microbiomes. 3, 1-11 (2018).
  8. Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S. M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytical Chemistry. 91 (5), 3233-3238 (2019).
  9. Brodersen, K. E., Koren, K., Lichtenberg, M., Kühl, M. Nanoparticle-based measurements of pH and O2 dynamics in the rhizosphere of Zostera marina L.: effects of temperature elevation and light-dark transitions. Plant, Cell & Environment. 39 (7), 1619-1630 (2016).
  10. Zhu, Q., Aller, R. C., Fan, Y. High-Performance Planar pH Fluorosensor for Two-Dimensional pH Measurements. in Marine Sediment and Water. Environmental Science & Technology. 39, 8906-8911 (2005).
  11. Murniati, E., Gross, D., Herlina, H., Hancke, K., Glud, R. N., Lorke, A. Oxygen imaging at the sediment-water interface using lifetime-based laser induced fluorescence (τLIF) of nano-sized particles. Limnology and Oceanography: Methods. 14 (8), 506-517 (2016).
  12. Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils - a review. Analytica Chimica Acta. , 9-42 (2015).
  13. Glud, R. N. Oxygen dynamics of marine sediments. Marine Biology Research. 4 (4), 243-289 (2008).
  14. Revsbech, N. P., Jorgensen, B. B., Blackburn, T. H. Oxygen in the Sea Bottom Measured with a Microelectrode. Science. 207 (4437), 1355-1356 (1980).
  15. Klimant, I., Meyer, V., Kuhl, M. Fiberoptic oxygen microsensors, a new tool in aquatic biology. Limnology and Oceanography. 40 (6), 1159-1165 (1995).
  16. Glud, R. N., Tengberg, A., Kühl, M., Hall, P. O. J., Klimant, I., Holst, G. An in situ instrument for planar O2 optode measurements at benthic interfaces. Limnology and Oceanography. 46 (8), 2073-2080 (2001).
  17. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9, 348-360 (2011).
  18. Glud, R., Ramsing, N., Gundersen, J., Klimant, I. Planar optrodes:a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
  19. Frederiksen, M. S., Glud, R. N. Oxygen dynamics in the rhizosphere of Zostera marina: A two-dimensional planar optode study. Limnology and Oceanography. 51 (2), 1072-1083 (2006).
  20. Quaranta, M., Borisov, S. M., Klimant, I. Indicators for optical oxygen sensors. Bioanalytical Reviews. 4, 115-157 (2012).
  21. Koren, K., Hutter, L., Enko, B., Pein, A., Borisov, S. M., Klimant, I. Tuning the dynamic range and sensitivity of optical oxygen-sensors by employing differently substituted polystyrene-derivatives. Sensors and Actuators B: Chemical. 176 (100), 344-350 (2013).
  22. Borisov, S. M. Fundamentals of Quenched Phosphorescence O2 Sensing and Rational Design of Sensor Materials. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , 1, Chapter 1 1-18 (2018).
  23. Wang, X., Wolfbeis, O. S. Optical methods for sensing and imaging oxygen: materials, spectroscopies and applications. Chemical Society Reviews. 43, 3666-3761 (2014).
  24. Ehgartner, J., Wiltsche, H., Borisov, S. M., Mayr, T. Low cost referenced luminescent imaging of oxygen and pH with a 2-CCD colour near infrared camera. The Analyst. 139 (19), 4924(2014).
  25. Meier, R. J., Fischer, L. H., Wolfbeis, O. S., Schäferling, M. Referenced luminescent sensing and imaging with digital color cameras: A comparative study. Sensors and Actuators B: Chemical. 177, 500-506 (2013).
  26. Holst, G., Kohls, O., Klimant, I., König, B., Kühl, M., Richter, T. A modular luminescence lifetime imaging system for mapping oxygen distribution in biological samples. Sensors and Actuators B. 51, 163-170 (1998).
  27. Moßhammer, M., Brodersen, K. E., Kühl, M., Koren, K. Nanoparticle- and microparticle-based luminescence imaging of chemical species and temperature in aquatic systems: a review. Microchimical Acta. , 1-28 (2019).
  28. Koren, K., Kühl, M. CHAPTER 7. Optical O2 Sensing in Aquatic Systems and Organisms. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. 1, 145-174 (2018).
  29. Chen, H., Holst, G., Gratton, E. Modulated CMOS camera for fluorescence lifetime microscopy. Microscopy Research and Technique. 78, 1075-1081 (2015).
  30. Franke, R., Holst, G. A. Frequency-domain fluorescence lifetime imaging system (pco.flim) based on a in-pixel dual tap control CMOS image sensor. Proceedings of SPIE 93281, Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues XIII. , 1-19 (2015).
  31. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  32. Schreml, S., et al. 2D luminescence imaging of physiological wound oxygenation. Experimental dermatology. 20 (7), 550-554 (2011).
  33. Trampe, E., et al. Functionalized Bioink with Optical Sensor Nanoparticles for O2 Imaging in 3D-Bioprinted Constructs. Advanced Functional Materials. 1804411, 1804411(2018).
  34. Gouterman, M. Oxygen Quenching of Luminescence of Pressure Sensitive Paint for Wind Tunnel Research. Journal of Chemical Education. 74 (6), 697(1997).
  35. Fischer, L. H., et al. Referenced dual pressure- and temperature-sensitive paint for digital color camera read out. Chemistry. 18 (49), 15706-15713 (2012).
  36. Fabricius-Dyg, J., Mistlberger, G., Staal, M., Borisov, S. M., Klimant, I., Kühl, M. Imaging of surface O2 dynamics in corals with magnetic micro optode particles. Marine Biology. 159 (7), 1621-1631 (2012).
  37. Koren, K., Jakobsen, S. L., Kühl, M. In-vivo imaging of O2 dynamics on coral surfaces spray-painted with sensor nanoparticles. Sensors and Actuators B: Chemical. 237, 1095-1101 (2016).
  38. Carraway, E. R., Demas, J. N., DeGraff, B. A., Bacon, J. R. Photophysics and Photochemistry of Oxygen Sensors Based on Luminescent Transition-Metal Complexes. Analytical Chemistry. 63 (4), 337-342 (1991).
  39. Klimant, I., Ruckruh, F., Liebsch, G., Stangelmayer, A., Wolfbeis, O. S. Fast response oxygen micro-optodes based on novel soluble ormosil glasses. Mikrochimica Acta. 131, 35-46 (1999).
  40. Askaer, L., Elberling, B., Glud, R. N., Kühl, M., Lauritsen, F. R., Joensen, H. P. Soil heterogeneity effects on O2 distribution and CH4 emissions from wetlands: In situ and mesocosm studies with planar O2 optodes and membrane inlet mass spectrometry. Soil Biology and Biochemistry. 42 (12), 2254-2265 (2010).
  41. Mayr, T., Borisov, S. M., Abel, T., Enko, B., Waich, K. Light Harvesting as a Simple and Versatile Way to Enhance Brightness of Luminescent Sensors. Analytical Chemistry. 81, 6541-6545 (2009).
  42. Kühl, M., et al. Microenvironmental Ecology of the Chlorophyll b-Containing Symbiotic Cyanobacterium Prochloron in the Didemnid Ascidian Lissoclinum patella. Frontiers in microbiology. 3, 1-18 (2012).
  43. Dalfen, I., Dmitriev, R. I., Holst, G., Klimant, I., Borisov, S. M. Background-Free Fluorescence-Decay-Time Sensing and Imaging of pH with Highly Photostable Diazaoxotriangulenium Dyes. Analytical Chemistry. 91 (1), 808-816 (2019).
  44. Chatni, M. R., Maier, D. E., Porterfield, D. M. Evaluation of microparticle materials for enhancing the performance of fluorescence lifetime based optrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 141, 471-477 (2009).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Oksijen OptoduFrekans Etki Alanl KameraPlanar OptodOksijen KonsantrasyonuRizosfer G r nt lemeSens r KokteyliB ak KaplamasKalibrasyon Prosed rYap sal G r nt leme

İlgili makaleler